Summary
Aqui apresentamos um protocolo para projetar e fabricar dispositivos microfluídicos personalizados com o mínimo de investimento financeiro e de tempo. O objetivo é facilitar a adoção de tecnologias microfluídicas em laboratórios de pesquisa biomédica e ambientes educacionais.
Abstract
Os dispositivos microfluídicos permitem a manipulação de fluidos, partículas, células, órgãos ou organismos de tamanho micro em canais que vão desde as escalas de nano a submilimetro. Um rápido aumento no uso dessa tecnologia nas ciências biológicas levou à necessidade de métodos acessíveis a uma ampla gama de grupos de pesquisa. Os padrões atuais de fabricação, como a ligação PDMS, exigem técnicas litográficas e demoradas de litografia e deligação caras e demoradas. Uma alternativa viável é o uso de equipamentos e materiais que são facilmente acessíveis, exigem experiência mínima e permitem a rápida iteração de projetos. Neste trabalho descrevemos um protocolo para projetar e produzir PET-laminados (PETLs), dispositivos microfluídicos que são baratos, fáceis de fabricar e consomem significativamente menos tempo para gerar do que outras abordagens para a tecnologia microfluídica. Consistem em folhas térmicas da película, em que as canaletas e outras características são definidas usando um cortador do ofício. Os PETLs resolvem desafios técnicos específicos de campo e, ao mesmo tempo, reduzem drasticamente os obstáculos à adoção. Essa abordagem facilita a acessibilidade de dispositivos microfluídicos em ambientes educacionais e de pesquisa, fornecendo uma plataforma confiável para novos métodos de investigação.
Introduction
A microfluídica permite o controle de fluidos em pequenas escalas, com volumes que variam de microlitros (1 x 10-6 L) a picolitros (1 x 10-12 L). Este controle foi possível em parte devido à aplicação de técnicas de microfabricação emprestadas da indústria de microprocessadores1. O uso de redes microdimensionadas de canais e câmaras permite ao usuário aproveitar os fenômenos físicos distintos característicos das pequenas dimensões. Por exemplo, na escala do micrômetro, os fluidos podem ser manipulados usando o fluxo laminar, onde as forças viscosas dominam as forças inerciais. Como resultado, o transporte difusivo torna-se a característica proeminente da microfluídica, e pode ser estudado quantitativa e experimentalmente. Estes sistemas podem ser devidamente compreendidos usando as leis de Fick, teoria do movimento browniano, a equação de calor, e / ou as equações De Navier-Stokes, que são derivações importantes nos campos da mecânica de fluidos e fenômenos de transporte2.
Como muitos grupos nas ciências biológicas estudam sistemas complexos no nível microscópico, pensou-se originalmente que os dispositivos microfluídicos teriam um impacto imediato e significativo nas aplicações de pesquisa na biologia2,3. Isto é devido à difusão que é dominante no transporte de moléculas pequenas através das membranas ou dentro de uma pilha, e as dimensões das pilhas e dos micro-organismos são um fósforo ideal para sistemas e dispositivos do sub-milímetro. Portanto, havia um potencial significativo para melhorar a forma como a experimentação celular e molecular é conduzida. No entanto, a ampla adoção de tecnologias microfluídicas por biólogos ficou para trás as expectativas4. Uma razão simples para a falta de transferência de tecnologia pode ser os limites disciplinares que separam engenheiros e biólogos. O projeto e a fabricação personalizados do dispositivo permaneceram apenas fora das capacidades da maioria de grupos de pesquisa biológicos, fazendo os dependentes da perícia e das facilidades externas. A falta de familiaridade com potenciais aplicações, custos e o tempo necessário para a iteração de design também são barreiras significativas para os novos adotantes. É provável que estas barreiras tenham tido o efeito de perturbar a inovação e prevenir a aplicação generalizada de microfluídicos para enfrentar os desafios nas ciências biológicas.
Um caso em questão: Desde o final da década de 1990, a fotolitografia suave tem sido o método de escolha para a fabricação de dispositivos microfluídicos. PDMS (polidimetilsiloxano, um polímero orgânico à base de silicone) é um material amplamente utilizado por causa de suas propriedades físicas, como transparência, deformabilidade e biocompatibilidade5. A técnica tem tido grande sucesso, com dispositivos lab-on-a-chip e organ-on-a-chip continuamente sendo desenvolvidos nesta plataforma6. A maioria dos grupos que trabalham nestas tecnologias, entretanto, é encontrada em departamentos da engenharia ou tem laços fortes a eles4. A litografia geralmente requer salas limpas para a fabricação de moldes e equipamentos de ligação especializados. Para muitos grupos, isso torna os dispositivos PDMS padrão menos do que o ideal devido aos seus custos de capital e tempo de espera, especialmente quando há uma necessidade de fazer modificações de design repetidas. Além disso, a tecnologia é, em sua maioria, inacessível ao biólogo médio e aos alunos sem acesso a laboratórios especializados de engenharia. Tem sido proposto que para que os dispositivos microfluídicos sejam amplamente adotados, eles devem imitar algumas das qualidades dos materiais comumente usados pelos biólogos. Por exemplo, o poliestireno usado para cultura celular e bioensaios é barato, descartável e passível de produção em massa. Em contraste, a fabricação industrial de microfluídicos à base de PDMS nunca foi realizada por causa de sua maciez mecânica, instabilidade no tratamento da superfície e permeabilidade de gás5. Por causa dessas limitações, e com o objetivo de resolver desafios técnicos usando dispositivos personalizados construídos "internamente", descrevemos um método alternativo que utiliza xurografia7,8,9 protocolos e laminação térmica. Este método pode ser adotado com pouco capital e investimento em tempo.
Petls são fabricados usando polietileno tereftalato (PET) filme, revestido com o acetato termoadhesivo etileno-vinil (EVA). Ambos os materiais são amplamente utilizados em produtos de consumo, são biocompatíveis e estão prontamente disponíveis a um custo mínimo10. Pet / EVA filme pode ser obtido a forma de laminação de bolsas ou rolos. Usando um cortador de artesanato controlado por computador comumente encontrado em lojas amadores ou artesanais, os canais são cortados de uma única folha de filme para definir a arquitetura do dispositivo11. Os canais são então selados através da aplicação de camadas de filmes (ou vidro) adicionais que são ligados através de um laminador térmico (office) (Figura 1A). Os amortecedores perforated, auto-adesivos do vinil são adicionados para facilitar o acesso às canaletas. Os tempos de fabricação variam de 5 a 15 min, o que permite a iteração rápida do projeto. Todos os equipamentos e materiais usados para fazer PETLs são comercialmente acessíveis e acessíveis (<350 USD custo inicial, em comparação com milhares de USDs para litografia). Portanto, os PETLs fornecem uma nova solução para dois problemas principais colocados pela microfluídica convencional: acessibilidade e eficácia do tempo (Ver Comparação PDMS/PETL nas Tabelas Suplementares 1, 2).
Além de proporcionar aos pesquisadores a oportunidade de projetar e fabricar seus próprios dispositivos, os PETLs podem ser facilmente adotados em sala de aula porque são simples e intuitivos de usar. Petls podem ser incluídos no ensino médio e currículos universitários8, onde eles são usados para ajudar os alunos a entender melhor os conceitos físicos, químicos e biológicos, como difusão, fluxo laminar, micromixing, síntese de nanopartículas, formação gradiente e quimiotáxis.
Neste trabalho, ilustramos o fluxo de trabalho global para a fabricação de chips PETLs modelo com diferentes níveis de complexidade. O primeiro dispositivo é usado para facilitar a imagem latente das pilhas e dos micro-órgãos em uma câmara pequena. O segundo dispositivo, mais complexo consiste em diversas camadas e materiais, e é usado para a pesquisa no mechanobiology9. Por fim, construímos um dispositivo que exibe vários conceitos de dinâmica de fluidos (foco hidrodinâmico, fluxo laminar, transporte difusivo e micromixagem) para fins educacionais. O fluxo de trabalho e os projetos de dispositivos apresentados aqui podem ser facilmente adaptados para uma grande variedade de fins em ambas as configurações de pesquisa e sala de aula.
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Protocol
1. Design
- Identifique um aplicativo para os dispositivos e liste os componentes do canal/câmara que serão necessários.
NOTA: Todos os dispositivos exigirão canais de entrada e saída. Dispositivos usados para microscopia exigirão uma câmara de imagem. Dispositivos mais complexos exigirão canais e câmaras situados em várias camadas. - Comece por desenhar à mão cada camada, considerando como a funcionalidade do dispositivo é afetada pela superposição das camadas.
- Desenhe os projetos finais em um computador usando qualquer software que permita desenhar linhas e formas.
- Desenhe cada camada separadamente usando linhas pretas e sólidas e formas desprovidas de tons. Recomenda-se espessura da linha de 6 ou mais pontos. Nesta fase, as dimensões das características do canal e da câmara são menos importantes do que as proporções globais.
- Use a função de copiar e colar ao criar recursos e sobrepor camadas. Veja a Figura 1B para exemplos de desenhos em camadas.
- Importe cada camada no software do cortador do ofício(figura 1C). Faça isso fazendo uma captura de tela do design desenhado e usando uma abordagem de arrasto e queda.
- Criar um novo documento no software cortador de artesanato (download gratuito). Largue o arquivo de imagem no esteira exibido. O software reconhecerá a maioria dos arquivos de imagem.
- Amplie a imagem para facilitar o processamento puxando de um canto. O design agora pode ser reconhecido pelo software usando a função de rastreamento.
NOTA: Os usuários podem produzir projetos de novo diretamente neste software (usar ferramentas de desenho na paleta de design).
- Para traçar o projeto, selecione o ícone trace (forma de uma borboleta) no lado direito da janela e selecione completamente os projetos importados.
- Selecione o esboçorotulado pela opção Trace Preview . Ajuste (se necessário) as configurações de limite e escala para ajustar o rastreamento amarelo para combinar com o design.
- Selecione Trace do menu Trace uma vez que o traço amarelo corresponde ao design. Os canais são agora mostrados como um contorno vermelho. Se o contorno vermelho corresponde ao design, a imagem importada pode ser selecionada e excluída. O projeto é importado agora e pronto para a cola.
- Dimensionar o dispositivo selecionando o design rastreado e usando a grade fornecida pelo software. Puxe para mudar a largura e o comprimento dos canais e câmaras.
NOTA: O software fornece medições, e pequenas linhas podem ser desenhadas temporariamente (usar paleta de design no lado esquerdo da janela) para medir dimensões dentro do dispositivo. As dimensões funcionais da canal-largura variam de 100 μm a 900 μm. As dimensões podem ter que ser ajustadas após ter testado protótipos iniciais. É importante que todas as camadas sejam dimensionadas proporcionalmente, para garantir o alinhamento adequado durante a montagem.- Depois que o projeto é feito medida corretamente, selecione a ferramenta quadrada no menu de desenho da forma para extrair um quadrado/retângulo em torno de cada camada do dispositivo. Esta forma deve ser do mesmo tamanho para todas as camadas. Veja a Figura 1C, por exemplo.
- Crie uma camada superior separada contendo portas de acesso aos canais. Projetos simples consistirão em uma camada principal (média) do canal, uma camada de vedação inferior (muitas vezes de vidro) e uma camada superior que deve conter perfuradorações circulares para acessar os canais (entradas / tomadas).
NOTA: Desenhos contendo mais de três camadas exigirão perforations de entrada/tomada em várias camadas (Veja A Figura 1C, Figura 5A). Essas perfuradoras já podem estar incluídas no projeto, ou podem ser adicionadas neste momento.- Selecione a ferramenta de desenho no lado esquerdo da tela. Desenhe círculos sobre as portas de entrada e saída do projeto.
- Copiar e colar tanto o design original e os círculos. Apague os canais do dispositivo subjacente.
NOTA: Isso deixa as portas de entrada /tomada na posição certa correspondente ao design original. As formas também podem ser adicionadas à periferia de cada camada para ajudar no alinhamento.
- Disponha todas as camadas para serem cortadas no esteira exibido. O dispositivo está agora pronto para o corte.
2. Corte
- Aplique um único filme PET/EVA (ou outro material) de espessura preferida (3 mil é padrão) no esteira de corte adesivo. Certifique-se de que o lado adesivo (fosco) enfrenta para cima e o lado plástico (brilhante) enfrenta para baixo.
NOTA: Use luvas limpas para evitar a introdução de óleos e micropartículas nas camadas. - Achatar o filme contra o esteira (Figura 1D), removendo todo o ar que pode ter sido preso. Isso pode ser feito usando mãos enluvadas ou um rolo.
- Alinhe a borda do esteira de corte para a linha indicada no cortador. Carregue o esteira pressionando o load mat no cortador. Mantenha a configuração na lâmina de corte entre 3 e 5, dependendo da espessura do filme.
- Conecte o cabo USB cortador ao computador.
- Selecione a guia SEND e selecione uma configuração de corte.
NOTA: Uma infinidade de configurações estão disponíveis no menu cascata. O -Sticker Paper, Clear- é um cenário que funciona bem com pet / eva filme que tem uma espessura de 3-5 mil (75-125 μm). Modifique as configurações para diferentes materiais e economize configurações personalizadas para uso futuro.
- Selecione a guia SEND e selecione uma configuração de corte.
- Clique em Enviar. O corte começará(Figura 1E). Certifique-se que há bastante quarto na parte traseira do cortador para que a esteira mova-se desimpedida. Quando o cortador estiver terminado, descarregue o esteira selecionando descarregar no cortador. Não puxe o esteira para fora antes de descarregar.
3. Alinhamento
- Coloque o esteira de corte ao lado de uma superfície limpa. Com as mãos enluvadas, use um par de pinças para levantar cada camada do dispositivo microfluídico fora do esteira cortada (Figura 1F). Seja especial cuidadoso em torno das voltas e das curvas na canaleta; estes são especialmente delicados e suscetíveis a rasgar e defazer.
- Coloque as camadas do dispositivo microfluídico em uma superfície limpa. Encomendá-los de acordo com sua posição de cima para baixo no dispositivo(Figura 1G, Figura 2A, Figura 5A e Figura 7A).
- Corte pequenos (~3 mm x 10 mm) pedaços de fita dupla face que serão usados para anexar temporariamente as camadas juntas.
- Sobreponha as camadas uma a uma, começando com a camada inferior. Adicione um pequeno pedaço de fita dupla face a um canto entre as camadas, longe de quaisquer canais ou entradas / tomadas (Figura 1G, seta). A fita, embora não seja necessária, imobiliza as camadas e garante que elas não mudarão durante a laminação. Use um gabarito de arame para facilitar o alinhamento de camadas em dispositivos com mais de 4 camadas(Figura Suplementar 3).
- Certifique-se de que o lado adesivo (matte-EVA) do filme sempre enfrenta o interior (parte dentro das camadas) do dispositivo.
CUIDADO: O adesivo exposto derreterá contra as partes internas do laminador e adere a elas, resultando não apenas na perda do dispositivo, mas também afetando o desempenho futuro do laminador. - Uma vez que todas as camadas foram sobrepostas, inspecione o dispositivo. Deve haver pelo menos um lado EVA entre todas as camadas, e nenhum EVA deve ser exposto. Ao introduzir materiais revestidos não EVA (por exemplo, filme de cloreto de polivinil (PVC), um filme revestido com EVA de ambos os lados pode ser necessário, particularmente no caso de dispositivos mais complexos (Figura 5).
4. Laminação
- Ligue e ajuste o laminador para a configuração de espessura desejada. Alguns laminadores oferecem configurações de 3 e 5 mil, enquanto alguns não. Para qualquer dispositivo com 4 ou mais camadas, use a configuração de 5 mil.
- Uma vez que o laminador está pronto, executar o dispositivo através dos rolos de laminação(Figura 1H-I). Coloque o fim para que a fita dupla face foi adicionado para melhores resultados.
NOTA: Ao fabricar dispositivos de cinco ou mais camadas, eles podem ser executados através do laminador mais de uma vez. - Recuperar o dispositivo laminado.
NOTA: É aconselhável para dispositivos ser grande o suficiente para facilitar a sua recuperação do laminador. Esta consideração não afeta o tamanho dos canais ou arquitetura de chips, ele simplesmente pede um "quadro" que pode facilmente passar pelo laminador sem permanecer dentro.
5. Portas de entrada/tomada
- Use uma ferramenta rotativa e um 1/32 in. broca bit para cortar um pequeno buraco através do centro de um pára-choques de móveis. Alternativamente, use um soco de biópsia de 1 mm para perfurar os pára-choques.
NOTA: Recomenda-se uma prensa de perfuração. Embora os tamanhos variem, são recomendados 2 mm x 6 mm de diâmetro. Evite simplesmente "esfaquear" o pára-choques. A menos que o material seja removido, o pára-choque selará novamente(Figura Suplementar 1). As perforações, como indicado acima, destinam-se a interagir com tubos de polietheretherketone (PEEK), uma pipeta e ponta, ou uma agulha sem corte (16-18 G). Perfurações maiores podem ser alcançadas usando alicates de perfuração giratória(Figura Suplementar 1). Estes são úteis quando o pára-choque é usado como um "reservatório" para líquidos ou outros biológicos. - Certifique-se de que o orifício é completamente claro, removendo quaisquer detritos (causados por perfuração ou perfuração) com um par de pequenas pinças.
- Depois que as portas de entrada/saída forem desmatadas com sucesso, alinhe cuidadosamente os pára-choques com as portas de entrada/saída no dispositivo laminado(Figura 1J-K). Esta etapa é essencial a ter o fluxo apropriado dos líquidos dentro e fora do dispositivo. Segure o pára-choques atrás do dispositivo, posicione o rosto adesivo de frente para a enseada/tomada aberta no dispositivo e, em seguida, alinhe e adere. A montagem do dispositivo está agora concluída.
6. Testes
- Acesse as arquiteturas do canal/câmara através dos pára-choques perfurados (portas). Existem várias opções sobre como introduzir fluidos e biológicos nos dispositivos.
- Use tubos laboratoriais ou médicos/cirúrgicos, anexando-o a um conector de plástico (por exemplo, adaptadores Luer) ou a uma agulha sem corte. Uma pipeta padrão e ponta ou tubos PEEK sem adaptadores também podem ser usados(Figura Suplementar 2).
- Realizar infusão ou desenho de fluidos com seringas e tubos usando seringas ou bombas peristais.
NOTA: Há muitas opções no mercado, a partir de ~ 300 USD no momento da escrita. - Defina diferentes configurações de vazão de acordo com o dispositivo e experimento.
NOTA: Usamos rotineiramente configurações de vazão na faixa de 0,01-100 μL/min, mas outras taxas podem ser usadas.
Figura 1: Fabricação. (A)Um laminador de escritório e um cortador de artesanato são as duas únicas peças de equipamento necessárias para a fabricação. Ambos estão disponíveis on-line ou em lojas de artesanato / material de escritório. Outras ferramentas necessárias incluem tesouras e pinças. (B) As arquiteturas de canal e câmara podem ser compostas digitalmente usando qualquer programa de software que inclua ferramentas de desenho (gráficos vetorretais podem ser preferidos por alguns usuários, mas não são necessários). As linhas e as formas são desenhadas no preto com um fundo branco. O arquivo ou uma captura de tela do projeto podem ser importados para o software cortador de artesanato, arrastando e caindo. (C)O software do cortador do ofício está disponível livre para transferir e é exigido controlar o cortador. O software adquire o design e permite modificações, como dimensionamento. Ele também fornece ferramentas de desenho. (D)O esteira de corte carrega o filme para o corte. É ligeiramente adesivo, permitindo que a imobilização dos materiais seja cortada. A figura mostra quatro materiais diferentes prontos para carregar: 3 mil de espessura PET / EVA filme (topo), 5 mil de espessura PET / EVA filme (meio), 6 mil de espessura EVA / PET / EVA (canto inferior esquerdo) e filme de PVC (canto inferior direito). (E)Cortador está aberto para exibir lâmina (em preto) unidade e esteira carregada. (F)Após o corte, camadas individuais são levantadas usando pinças. Os cortes de canais e câmaras permanecem ligados ao esteira e são posteriormente removidos e descartados. (G)As camadas individuais são alinhadas e sobrepostas para a laminação. Pequenos pedaços de fita dupla face (seta) são frequentemente usados para ajudar no alinhamento e evitar a mudança de camada durante a laminação. (H, I) O dispositivo é alimentado na parte superior do laminador e recuperado através do slot. A laminação fornece um selo robusto, deixando caminhos de canal abertos. (J, K) Para acessar os canais, é necessário adicionar pára-choques de vinil perfurados e autoadesivos. Imagem em (J) exibe a abordagem "reversa" para o alinhamento, em que o pára-choque é colocado a partir da parte de trás, permitindo o alinhamento visual da inlet /outlet com a perfuração de pára-choques. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Representative Results
Além de baixo custo e iteração rápida, a tecnologia PETL pode ser facilmente personalizada para resolver desafios específicos. Primeiro, descrevemos um dispositivo simples que consiste em um coverslip de vidro, uma camada de câmara, uma camada de canal e uma camada de enseada/tomada(Figura 2). Este dispositivo foi projetado facilitar a imagem latente das pilhas e dos micro-órgãos o fluxo constante. O meio de cultura é reabastecido a baixas taxas de fluxo para incentivar a troca de nutrientes e gás. A câmara redonda possui um fundo de vidro, que permite imagens usando um microscópio invertido. Há pelo menos duas razões para o uso de vidro neste dispositivo. O primeiro é óptica. PET e EVA são termoplásticos usados para sua transparência óptica e flexibilidade, e podem ser usados como uma interface para imagens (particularmente em baixas ampliações9. A transmissão leve do PET no espectro visível varia de 87 a 90%12. O vidro, entretanto, tem melhores propriedades óticas e é o padrão usado na imagem latente biológica. A segunda razão para usar vidro é que as células até agora testadas (linhas de células de mamíferos), tendem a se ligar mais facilmente a ele do que ao PET/EVA (não tratado).
Figura 2: Câmara simples para microscopia invertida. (A) O dispositivo consiste em uma camada de vidro e três camadas PET/EVA (3 mil de espessura). Um coverslip de vidro (24 mm x 60 mm) é a camada inferior. A camada seguinte caracteriza a parte inferior da câmara de imagem. A próxima camada apresenta a metade superior da câmara e conecta-a ao canal in/outlet. Assim, a altura do canal é de apenas 75 μm, enquanto a altura da câmara é de 150 μm. A largura do canal é determinada pelo usuário (500 μm é mostrado aqui). A camada superior sela o trajeto da câmara/canaleta e fornece o acesso à aleta/tomadas. As camadas sobrepostas são mostradas à direita. (B) O dispositivo acabado é mostrado infundido com tine toque vermelho para visualização. O carregamento pode ser conseguido usando uma micropipette e uma ponta, um laboratório ou uma tubulação médica/cirúrgica equipada com uma agulha sem corte, ou a tubulação do PEEK, como mostrado. (C) O design do canal/câmara pode ser emitida em um único dispositivo (por exemplo, para facilitar a observação de vários espécimes individuais). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
As dimensões dos canais e câmara neste dispositivo valem a pena descrever. A altura em PETLs é sempre uma função da espessura da película ou da camada. Pet/EVA comercialmente disponível tem uma espessura medida em milésimos de polegada (1 mil - 25 μm). Portanto, as alturas de canais e câmaras são geralmente múltiplos de 25 μm. PETLs padrão são construídos usando 3 ou 5 mil pet/eva filme, o que resulta em características com uma altura de 75 ou 125 μm. O dispositivo mostrado na Figura 2 tem canais com uma altura de 75 μm, e uma câmara definida por duas camadas, com uma altura total de 150 μm. Note-se, no entanto, que as camadas podem ser compostas de diferentes materiais (por exemplo, vidro, folha, PVC, papel) e podem apresentar espessura variável, geralmente variando de 25 a 250 μm.
Figura 3: Imagem celular. (A)A câmara simples PETL pode ser usada para a cultura a curto prazo de pilhas aderentes. As células aderem ao vidro exposto na câmara e podem ser observadas usando um microscópio invertido. (B) Basófilos de ratos foram manchados com hoechst (azul) e membrana plasmática (vermelho) corantes fluorescentes para visualização em um microscópio confocal invertido. Imagemde campo brilhante de células em um simples dispositivo de câmara. Imagemde contraste de fase. Barra de escala branca é de 200 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.
A natureza da fabricação petl permite uma complexidade significativa no design do caminho fluido. O dispositivo de câmara simples consiste em quatro camadas contendo características em dois níveis do z-eixo (canal e topo da câmara em um nível, na parte inferior da câmara no segundo nível). Uma vantagem fornecida pelos PETLs é a facilidade com que arquiteturas de canal/câmara tridimensionais podem ser construídas. A adição de recursos como canais de refrigeração ou aquecimento, membranas de diálise, circuitos elétricos ou linhas de pressão (ver Figura 5)é alcançada conectando várias camadas em três dimensões. Uma ressalva encontrada até agora é o limite no número de camadas que podem ser laminadas. A transferência de calor necessária para a curadoria do EVA foi considerada insuficiente em dispositivos com uma espessura total acima de 800 μm. Essa limitação pode ser abordada em alguns dispositivos. Em muitos casos, é possível laminado cada vez que uma nova camada é adicionada. Isso não é possível quando uma nova camada requer o termoadhesivo (EVA) para enfrentar o exterior do dispositivo.
Figura 4: Imagem de microórgãos. (A) A câmara simples PETL é usada para imagem de um disco de asa do embrião de Drosophila melanogaster (ampliação 2x). As dimensões do disco de asa são de aproximadamente 90 μm x 250 μm x 500 μm. Um ou vários órgãos podem ser imageados através da janela coverslip. Ampliações aumentadas de outro disco de asa são mostradas em (B) 20x/0,75 ar, (C) 40x/1,30-óleo, e (D)100x/1.49-objetivos de óleo usando uma microscopia confocal disco girando. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
O estudo das células na cultura se beneficia de ferramentas que fornecem condições de estado dinâmicas, como fluxo constante ou estímulos mecânicos. A figura 3 fornece um exemplo em que uma linha de células de mamíferos é cultivada e imagem em um dispositivo de câmara simples. Médio pode ser constantemente trocado durante a imagem, permitindo não só para manter as condições ideais de crescimento, mas também para a introdução controlada de estímulos químicos, enquanto a imagem em tempo real. Isso também é verdade para a imagem dos micro-órgãos ex-vivo, como mostrado na Figura 4. Estruturas de canais e câmaras podem ser projetadas com dimensões específicas para se adequar a diferentes espécimes biológicos, de órgãos ou tecidos a organismos inteiros (por exemplo, embriões drosophila e discos imaginários ou C. elegans).
Figura 5: Mechano-PETL. A câmara simples PETL é modificada adicionando uma câmara de compressão. (A) O dispositivo consiste em sete camadas com quatro materiais diferentes: uma camada inferior de vidro (coverslip, não mostrado), quatro camadas PET/EVA 3 mil (camadas de canal/câmara, camada de espaçador e camada de entrada/saída), uma camada EVA/PET/EVA 6 mil (selamento do canal/câmara e adesão de PVC) e uma camada de PVC deformada (para compressão). (B, C) O trajeto da canaleta/câmara do espécime é visualizado usando a tina vermelha. O canal de compressão / caminho de câmara contém apenas ar. (D)A pressão do ar é aplicada manualmente (ou mecanicamente) ao caminho da compressão, resultando na expansão do filme de PVC no topo da câmara. A expansão desloca o tininho na câmara. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
A perturbação mecânica de espécimes biológicos melhora nossa compreensão da fisiologia celular e lança luz sobre processos como desenvolvimento embrionário e diferenciação. A figura 5 descreve um dispositivo PETL composto por uma simples matriz de canal/câmara e uma câmara de compressão. Consiste (em sua forma mais simples) de seis camadas, uma das quais é um filme de PVC. A película do PVC desvia quando a pressão de ar é aplicada, fazendo com que comprima espécimes dentro da câmara. Este dispositivo é um exemplo do uso de outros materiais que não pet/eva, e tem sido empregado com sucesso9 na substituição de PDMS / dispositivos de vidro utilizados para estudar a carga mecânica em Drosophila micro-órgãos13 (como mostrado na figura 6). Os dispositivos PETL são reutilizáveis. No entanto, devido ao baixo custo de fabricação, redução da pegada e do potencial de delaminação após manipulação contínua ou lavagem, recomendamos o uso de novos dispositivos no início de cada procedimento.
Figura 6: Imagens de mecanobiologia. (A)A DE-cadherin::GFP expressando drosophila disco de asa é imagemda dentro de um mechano-PETL usando um disco giratório microscópio confocal em ampliação 20x. (B) A pressão através da membrana acima da câmara pode ser aplicada através da atuação manual de uma seringa cheia de ar ou usando uma bomba de seringa. A lei ideal do gás é usada para estimar a quantidade de força aplicada à membrana9. A área da bolsa de disco (linha pontilhada branca) aumentou em aproximadamente 30% (linha pontilhada vermelha) com a aplicação de ~4 psi. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Devido à facilidade de fabricação de dispositivos PETL, exploramos seu uso em ambientes educacionais como salas de aula de química, biologia e engenharia e laboratórios de ensino. Um exemplo de petl educacional é mostrado na Figura 7. O dispositivo é projetado para exibir algumas das características básicas do fluxo de fluido na micro escala (por exemplo, fluxo laminar). É composto por quatro camadas de 5 mil PET / EVA filme (Figura 7A)e uma arquitetura de canal que inclui três canais de entrada convergentes e uma estrutura serpentina. Circular "depressões" ou "para baixo" passos foram adicionados ao caminho para promover a micromixagem14. Usando uma bomba de seringa, a solução de fenol vermelho é infundida através das portas externas, enquanto a solução pH 9 é infundida através da porta central. O foco hidrodinâmico15 é visualizado com o fluxo de fluido externo forçando o fluxo interno em um fluxo menor(Figura 7C). O fluxo laminar no dispositivo impede a mistura convectiva, e a mistura diffusive gradual é mostrada ao longo do comprimento da canaleta (setas). Dispositivos como o mostrado podem ser usados para ensinar conceitos (por exemplo, difusão, fluxo laminar) na dinâmica dos fluidos e biotransporte. Alternativamente, os alunos podem ser convidados a projetar e fabricar seus próprios dispositivos, um projeto que pode ser realizado em uma sessão de laboratório regular com duração de duas a três horas8.
Figura 7: PETLs na sala de aula. (A)O dispositivo é fabricado usando quatro camadas de 5 mil PET / EVA filme. A segunda camada (da direita para a esquerda) apresenta câmaras circulares que serão posicionadas o caminho do canal. (B) O dispositivo acabado foi carregado com o indicador de pH fenol vermelho (2 mm, amarelo) e uma solução transparente pH 9 (canal central). Fenol vermelho vira magenta quando em contato com soluções básicas. As caixas indicam áreas mostradas em (C) através de (F). (C)Foco hidrodinâmico. (D, E) laminar fluxo e difusão. (E, F)micromixagem. A barra de escala branca é de 2 mm em todos os painéis. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura suplementar 1: Perforação de pára-choques/porto. (A)Uma configuração de prensa de perfuração segurando uma ferramenta rotativa facilita a perfuração de pára-choques. Brocas de tamanhos 1/32" e 3/64" são usadas. (B) O processo é eficiente, e um grande número de pára-choques pode ser processado em um curto espaço de tempo. (C)A perfuração de perfuração de ponche de biópsia é uma alternativa à perfuração. (D)Um plier de perfuração giratório é usado para perfurações maiores. Essas perfuradorações podem ser usadas para carregar grandes espécimes (por retirada líquida em vez de infusão) ou como reservatórios de mídia. Por favor, clique aqui para baixar este número.
Figura suplementar 2: Tubulação. (A) Laboratório ou tubos médicos/cirúrgicos (1/32" ID, 3/32" OD) é a opção mais simples. É flexível e fácil de cortar. Requer o uso de (18 G) agulhas sem corte. (B)Uma das agulhas é anexada à seringa usando o adaptador Luer (rosa), que é removido de uma segunda agulha para que possa ser montado na tubulação. (C)Os investigadores já familiarizados com tubos PEEK (0,010" ID, 1/32 " OD) pode usá-lo com PETLs. (D)PEEK acessórios. (E)A bomba de seringa configurada é a mesma para ambos os tipos de tubos. (F) Laboratório ou tubo médico / cirúrgico configuração exigirá perfurações com um 3/64 " broca bit, enquanto tubos PEEK vai precisar de 1/32 " perfurações. Perfurações feitas com um soco de biópsia de 1 mm podem acomodar ambos os conjuntos de tubulação. Por favor, clique aqui para baixar este número.
Figura suplementar 3: Alinhamento usando um gabarito do fio. O design do dispositivo pode incluir perforações que podem servir como guias para o alinhamento de várias camadas. Os gabaritos do fio estão comercialmente disponíveis para ao redor 20 USD. Por favor, clique aqui para baixar este número.
Figura suplementar 4: Limitações de tamanho. Embora os cortadores de artesanato sejam capazes de cortar canais retos que são ~ 100 μm de largura (A),a precisão dos padrões de corte é muito diminuída para recursos que medem 150 μm ou menos (B). As dimensões ao lado das formas indicam a largura do canal. Por favor, clique aqui para baixar este número.
Tabela suplementar 1: Tempo e custo para fabricação de chip microfluídico em PDMS. *Tempo de fabricação quando a bolacha/molde está prontamente disponível e pdms pode ser curado usando um forno. Qualquer modificação de design representa um atraso de vários dias. Por favor, clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela complementar 2: Tempo e custo para a fabricação do chip microfluídico PETL. Por favor, clique aqui para baixar esta tabela.
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Discussion
Enquanto os microfluídicos estão cada vez mais presentes na caixa de ferramentas de laboratórios ao redor do mundo, o ritmo de adoção tem sido decepcionante, dado o potencial para seu impacto positivo16. Baixo custo e alta eficiência da fabricação de dispositivos microfluídicos são essenciais para acelerar a adoção dessa tecnologia no laboratório de pesquisa média. O método descrito aqui usa várias camadas de filme para criar dispositivos bie tridimensionais em uma fração do tempo e custo exigido s os métodos litográficos. A litografia padrão custa milhares de dólares (USD) para start-up, e requer dias para fabricar, o custo de inicialização de fabricação petl é inferior a 350 USD e os dispositivos podem ser fabricados em minutos. Isso facilita sua adoção não apenas no laboratório de pesquisa, mas também em ambientes onde a iteração rápida é vantajosa (por exemplo, prototipagem para dispositivos PDMS padrão), ou onde a produção industrial de dispositivos descartáveis baratos são necessárias. Por exemplo, petls podem ser fabricados usando materiais biodegradáveis, e podem ser adaptados para seu uso no campo da saúde, tornando-os ideais como ferramentas de diagnóstico. Eles podem ser usados na sala de aula, seja como materiais de aprendizagem pré-fabricados ou como um desafio criativo, no qual os alunos projetam, fabricam e testam seus próprios dispositivos.
A fabricação do PETL é significada ser descomplicada. É, no entanto, útil identificar etapas críticas e limitações atuais desta técnica. Alguns usuários descobrirão que a troca de gás em dispositivos PETL é reduzida em comparação com dispositivos PDMS, o que é compensado por ter fluxo contínuo de mídia durante a experimentação. Outra limitação é o dimensionamento. Canais e outras características menores do que 150 μm estão abaixo do limite de resolução do cortador(Figura Suplementar 4). Recomendamos trabalhar com canais com uma largura na faixa de 200-900 μm. Esses limites são flexíveis e tendem a variar particularmente no limite superior. Por exemplo, os canais com uma altura de 75 μm entrarão em colapso quando a largura do canal for de 950 μm ou mais, mas permanecerão abertos se a altura aumentar. Embora a arquitetura do dispositivo varie de acordo com a aplicação, nós usamos rotineiramente canais com uma altura de 75 ou 125 μm, e uma largura de 400-600 μm.
Atenção aos detalhes ao alinhar camadas e pára-choques é importante. A maioria das poucas complicações decorrentes da fabricação petl são resultado de problemas de alinhamento. Eva exposto no momento da laminação pode aderir aos rolos internos e torná-los inutilizáveis. A infusão de líquidos pode ser bloqueada por um pára-choques mal posicionado. Felizmente, petls não são apenas baratos, mas também são rapidamente construídos, portanto, dispositivos defeituosos podem ser facilmente substituídos ou modificados.
Petls pode suportar taxas de fluxo de infusão semelhantes às utilizadas em outros dispositivos microfluídicos. Embora 0,01 a 100 μL/min seja a faixa utilizada pelo nosso grupo, as taxas de fluxo de até 500 μL/min (e talvez maiores ao usar micropipettes acionadas à mão) podem ser usadas. Descobrimos que petls podem suportar pressões na faixa de 30 a 57 psi8. Bombas de seringa são recomendadas para a maioria das configurações experimentais, embora não sejam um requisito absoluto. Na sala de aula, as burettes foram usadas para testar os dispositivos do estudante15. Bombas peristálticas são úteis em certas configurações, como a cultura celular, especialmente porque a troca de gás é limitada em PETLs. PDMS pode ser mais vantajoso a este respeito, embora a lixiviação pode ser uma preocupação5. Tentamos produzir PET híbrido/EVA-PDMS, mas o EVA não aderirá diretamente ao PDMS; é possível que a modificação superficial deste último (por exemplo, tratamento de plasma ou tratamentos surfactantes) possa resolver este problema. Outra abordagem que pode ser comparada aos PETLs é a micro usinagem de canais usando co2 ablação a laser17,18 da PMMA. Descobrimos que o corte a laser é incompatível com o filme PET/EVA, uma vez que o calor produzido tende a curar o EVA e a produzir bordas de canais irregulares. O uso de equipamentos a laser adequados também pode aumentar significativamente os custos de fabricação.
Em resumo, os PETLs oferecem múltiplas vantagens em relação às tecnologias atuais: (i) Os custos são significativamente menores do que os métodos tradicionais devido ao uso de materiais e equipamentos de nível de consumo, tornando-o facilmente acessível a pesquisadores e estudantes. (ii) Os dispositivos podem ser projetados, cortados e montados em poucos minutos, o que permite a iteração rápida do protótipo e facilita a experimentação eficaz no tempo. (iii) Vários dispositivos podem ser fabricados simultaneamente, permitindo uma produção de alta taxa de produção. (iv) Uma variedade de materiais pode ser incorporada, adicionando versatilidade e permitindo a personalização extensiva. O desenvolvimento atual e futuro de novas funcionalidades usando essa tecnologia depende da criatividade e das exigências de novos usuários. A ampla adoção de dispositivos microfluídicos PETL provavelmente resultará na inclusão de novos materiais e configurações, à medida que os usuários desenvolverem novos designs e abordagens para suas necessidades particulares.
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Disclosures
Fernando Ontiveros está em processo de lançamento da PETL FLUIDICS (LLC), uma empresa que comercializará e fornecerá serviços de consultoria para essa tecnologia. Os co-autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
O trabalho neste manuscrito foi apoiado em parte pela National Science Foundation (NSF) (Grant No. CBET-1553826) (e suplemento de ROA associado) e os Institutos Nacionais de Saúde (NIH) (Grant No. R35GM124935) para J.Z., e o fundo notre dame melchor visitando o corpo docente para f.o. Gostaríamos de agradecer a Jenna Sjoerdsma e Basar Bilgiçer por fornecerem células e protocolos culturais de mamíferos e Fabio Sacco para assistência com figuras complementares.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biopsy punch (1mm) | Miltex | 33-31AA | Optional, replaces rotary tool set up |
| Blunt needles | Janel, Inc. | JEN JG18-0.5X-90 | Remove plastic and attach to Tygon tubing |
| Coverslips | Any | 24 x 60 mm are preferred | |
| Cutting Mat and blades | Silhouette America or Nicapa | www.silhouetteamerica.com/shop/blades-and-mats | Re-use/Disposables |
| Double-sided tape | Scotch/3M | 667 | Small amounts, any width or brand |
| PEEK tubing | IDEX/any | 1581L | Different configurations available. Consider using Tygon tubing intead, if not already using PEEK |
| PET/EVA thermal laminate film | Scotch/3M & Transcendia | TP3854-200,TP5854-100 & transcendia.com/products/trans-kote-pet | 3 - 6 mil (mil = 1/1000 inch) laminating pouches or rolls. |
| PVC film - Cling Wrap | Glad / Any | Food wrapping | |
| Rotary tool-drill | Dremel/Any | 200-121 or other | 1/32 and 3/64" drill bits from Dremel recommended |
| Rubber Roller | Speedball | 4126 | To facilitate adhesion, any brand will work |
| Scissors & tweezers | Any | Fiskars-Inch-Titanium-Softgrip-Scissors |Cole-Parmer –# UX-07387-12 | Quality brands are recommended |
| Silhouette CAMEO Craft cutter | Silhouette America | www.silhouetteamerica.com/shop/cameo/SILHOUETTE-CAMEO-3-4T | Preferred craft cutter |
| Silhouette Studio software | Silhouette America | www.silhouetteamerica.com/software | Controls the craft cutter and provides drawing tools (free download MAC and PC) |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus or New Era | 70-4504 or NE-300 | Pumps are ideal, pipettes or burettes can be used. |
| Syringes | Any | 1-3mL | |
| Thermal laminator | Scotch/3M | TL906 | Standard home/office model |
| Tygon tubing (E-3603) | Cole-Parmer | EW-06407-70 | Use with blunt needle tips |
| Vinyl furniture bumpers | DerBlue/3M/ Everbilt | Clear, self-adhesive (6 x 2 mm and 8 x 3 mm) | Round bumpers are recommended |
References
- Xia, Y., Whitesides, G. M. SOFT LITHOGRAPHY. Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).
- Beebe, D. J., Mensing, G. A., Walker, G. M. Physics and Applications of Microfluidics in Biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 4 (1), 261-286 (2002).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft Lithography in Biology and Biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3 (1), 335-373 (2001).
- Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507 (7491), 181-189 (2014).
- Berthier, E., Young, E. W. K., Beebe, D. Engineers are from PDMS-land, Biologists are from Polystyrenia. Lab on a Chip. 12 (7), 1224 (2012).
- Zhang, B., Korolj, A., Lai, B. F. L., Radisic, M. Advances in organ-on-a-chip engineering. Nature Reviews Materials. 3 (8), 257-278 (2018).
- Bartholomeusz, D. A., Boutte, R. W., Andrade, J. D. Xurography: rapid prototyping of microstructures using a cutting plotter. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (6), 1364-1374 (2005).
- Martínez-Hernández, K. J., Rovira-Figueroa, N. D., Ontiveros, F. Implementation and Assessment of Student-Made Microfluidic Devices in the General Chemistry Laboratory. , (2016).
- Levis, M., et al. Microfluidics on the fly: Inexpensive rapid fabrication of thermally laminated microfluidic devices for live imaging and multimodal perturbations of multicellular systems. Biomicrofluidics. 13 (2), 024111 (2019).
- Subramaniam, A., Sethuraman, S. Chapter 18 - Biomedical Applications of Nondegradable Polymers. Natural and Synthetic Biomedical Polymers. , 301-308 (2014).
- Yuen, P. K., Goral, V. N. Low-cost rapid prototyping of flexible microfluidic devices using a desktop digital craft cutter. Lab Chip. 10 (3), 384-387 (2010).
- Oya, K., et al. Surface Characteristics of Polyethylene Terephthalate (PET) Film Exposed to Active Oxygen Species Generated via Ultraviolet (UV) Lights Irradiation in High and Low Humidity Conditions. Journal of Photopolymer Science and Technology. 27 (3), 409-414 (2014).
- Narciso, C. E., Contento, N. M., Storey, T. J., Hoelzle, D. J., Zartman, J. J. Release of Applied Mechanical Loading Stimulates Intercellular Calcium Waves in Drosophila Wing Discs. Biophysical Journal. 113 (2), 491-501 (2017).
- Suh, Y. K., Kang, S. A Review on Mixing in Microfluidics. Micromachines. 1 (3), 82-111 (2010).
- Jahn, A., Vreeland, W. N., Gaitan, M., Locascio, L. E. Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing. Journal of the American Chemical Society. 126 (9), 2674-2675 (2004).
- Weibel, D., Whitesides, G. Applications of microfluidics in chemical biology. Current Opinion in Chemical Biology. 10 (6), 584-591 (2006).
- Chen, X., Li, T., Shen, J. CO2 Laser Ablation of Microchannel on PMMA Substrate for Effective Fabrication of Microfluidic Chips. International Polymer Processing. 31 (2), 233-238 (2016).
- Chen, X., Shen, J., Zhou, M. Rapid fabrication of a four-layer PMMA-based microfluidic chip using CO2-laser micromachining and thermal bonding. Journal of Micromechanics and Microengineering. 26 (10), 107001 (2016).
