यह प्रोटोकॉल इम्यूनोलॉजिकल सिनेप्स गठन और बाद में इम्यूनोलॉजिकल सिनेप्स की ओर बाद में ध्रुवीकृत गुप्त यातायात दोनों को चित्रित करता है। सेलुलर कंजूगेट्स एक सुपरएंटीजन-स्पंदित राजी सेल (एंटीजन-पेश सेल के रूप में कार्य) और एक जुरकैट क्लोन (एक प्रभावक सहायक टी लिंफोसाइट के रूप में कार्य) के बीच बनाए गए थे।
विधि का उद्देश्य एक इम्यूनोलॉजिकल सिनेप्स (आईएस) उत्पन्न करना है, जो एंटीजन-पेश सेल (एपीसी) और एक प्रभावक सहायक टी लिंफोसाइट (Th) सेल द्वारा गठित सेल-टू-सेल कंजुगेशन का एक उदाहरण है, और के पहले चरणों के अनुरूप छवियों को रिकॉर्ड करना है। गठन और बाद में तस्करी की घटनाओं (एपीसी और वें सेल में दोनों में होने वाली) है । इन घटनाओं अंततः आईएस में ध्रुवीकृत स्राव के लिए नेतृत्व करेंगे । इस प्रोटोकॉल में, जुरकैट कोशिकाओं को स्टेफिलोकोकस एंटोटॉक्सिन ई (देखें) के साथ चुनौती दी गई- एक सेल सिनेप्स मॉडल के रूप में रजी कोशिकाओं का उपयोग किया गया था, क्योंकि इस प्रयोगात्मक प्रणाली की निकटता जैविक वास्तविकता (Th सेल-एपीसी सिनैप्टिक कॉन्जुगेट्स) के लिए थी। यहां प्रस्तुत दृष्टिकोण में सेल-टू-सेल कंजुगन, समय-चूक अधिग्रहण, व्यापक क्षेत्र फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (WFFM) शामिल है जिसके बाद छवि प्रसंस्करण (अधिग्रहण के बाद डेकोनोवुटिशन) शामिल है। यह छवियों के सिग्नल-टू-शोर अनुपात (SNR) में सुधार करता है, लौकिक संकल्प को बढ़ाता है, उभरते सिनैप्टिक कॉन्जुगेट्स में कई फ्लोरोक्रोम के सिंक्रोनाइज्ड अधिग्रहण की अनुमति देता है और फ्लोरेसेंस ब्लीचिंग को कम करता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल एंड पॉइंट सेल निर्धारण प्रोटोकॉल (पैराफॉर्मलडिहाइड, एसीटोन या मेथनॉल) के साथ अच्छी तरह से मेल खाता है, जो आगे इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला और विश्लेषण की अनुमति देगा। यह प्रोटोकॉल लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (एलएससीएम) और अन्य अत्याधुनिक माइक्रोस्कोपी तकनीकों के साथ भी संगत है। एक मुख्य चेतावनी के रूप में, केवल उन टी सेल-एपीसी सीमाओं (जिसे इंटरफेस कहा जाता है) जो जेड-एक्सिस के साथ फोकस विमान के लिए सही 90 डिग्री कोण पर थे, उन्हें ठीक से इमेज और विश्लेषण किया जा सकता है। अन्य प्रयोगात्मक मॉडल मौजूद हैं जो जेड आयाम और निम्नलिखित छवि विश्लेषणों में इमेजिंग को सरल बनाते हैं, लेकिन ये दृष्टिकोण एपीसी की जटिल, अनियमित सतह का अनुकरण नहीं करते हैं, और आईएस में गैर-शारीरिक बातचीत को बढ़ावा दे सकते हैं। इस प्रकार, यहां उपयोग किया जाने वाला प्रयोगात्मक दृष्टिकोण आईएस में होने वाली कुछ जैविक जटिलताओं का पुन: पेश करने और सामना करने के लिए उपयुक्त है।
विधि का मुख्य लक्ष्य इम्यूनोलॉजिकल सिनेप्स (आईएस) सेल-टू-सेल एंजुगेट्स उत्पन्न करना है जो एक एंटीजन-पेश सेल (एपीसी) द्वारा गठित किया गया है जो देखने के सुपरएंटीजन और एक प्रभावक वें सेल के साथ स्पंदित होता है, और इम्यूनोलॉजिकल सिनेप्स गठन और बाद में तस्करी की घटनाओं (एपीसी और टीएच सेल दोनों में होने वाली) के पहले चरणों के अनुरूप छवियों को पंजीकृत करने के लिए, जो अंततः आईएस में ध्रुवीकृत स्राव का कारण बनेगा। एपीसी पर एमएचसी-II से बंधे एंटीजन के लिए उनके सेल रिसेप्टर (टीसीआर) के बंधन पर टी लिम्फोसाइट्स द्वारा आईएस की स्थापना एंटीजन-विशिष्ट, विनोदी और सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं1,2में शामिल एक अत्यंत गतिशील, निंदनीय और महत्वपूर्ण उदाहरण का आयोजन करती है। आईएस को एक विशेष सुप्रांतिक सक्रियण परिसर (स्मैक) पैटर्न के गठन से परिभाषित किया गया है जो एक ऐक्टिन पुनर्गठन प्रक्रिया3की विशेषता है। पर एक एपीसी के साथ टी लिम्फोसाइट्स द्वारा निर्माण है, आईएस की ओर गुप्त vesicles के ध्रुवीकरण को सिनैप्टिक गैप पर ध्रुवीकृत स्राव में फंसाया प्रतीत होता है । यह केंद्रित मशीनरी स्पष्ट रूप से टी लिम्फोसाइट्स की महत्वपूर्ण गुप्त प्रभावक भूमिकाओं की प्रभावकारिता को बढ़ाने के लिए एक शानदार विनियमित स्तर के साथ प्रतिरक्षा प्रणाली की आपूर्ति करती प्रतीत होती है, जबकि दर्शक कोशिकाओं की गैर-विशिष्ट, साइटोकिन-मध्यस्थउत्तेजना को कम करती है, सक्रियण-प्रेरित सेल डेथ (एआईसीडी)4के माध्यम से अप्रासंगिक लक्ष्य कोशिकाओं और अपोप्टिक आत्महत्या की हत्या करती है।
आईएस का परिणाम टी लिंफोसाइट और एपीसी दोनों की प्रकृति पर भिन्न होता है। एमएचसी-II से जुड़े एंटीजन को प्रदर्शित करने वाले एपीसी के साथ टी कोशिकाओं (आमतौर पर सीडी4 + कोशिकाओं) का सिनैप्टिक संपर्क टी सेल (साइटोकिन स्राव, प्रसार, आदि) की सक्रियता पैदा करता है और कुछ उदाहरणों में एआईसीडी4के माध्यम से एपोप्टोसिस। MHC-I से जुड़े एंटीजन पेश एपीसी के साथ बातचीत करने वाले साइटोटॉक्सिक टी लिम्फोसाइट्स (सीटीएल) (सीटीएल) (मुख्य रूप से सीडी8 + कोशिकाओं) के लिए, परिणाम एंटीजन के साथ सीटीएल के पूर्व-उत्तेजना या नहीं पर अलग है। इस प्रकार, एपीसी पर एंटीजन-एमएचसी-आई परिसरों की पहचान करने वाले भोले सीटीएलएस लक्ष्य कोशिकाओं को नष्ट करने और विभाजित करने के लिए “प्राइम्ड” हैं। प्राइम्ड सीटीएल भी लक्ष्य कोशिकाओं (यानी, वायरस या ट्यूमर कोशिकाओं से संक्रमित कोशिकाओं) एंटीजन विशिष्ट सेल संहार5,6का उत्पादन के साथ synapses स्थापित करते हैं ।
इम्यूनोलॉजिकल सिनेप्स में एक्सोसोम्स का ध्रुवीकृत स्राव प्रासंगिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं7में शामिल अनुसंधान का एक विकासशील और चुनौतीपूर्ण क्षेत्र है । यह प्रदर्शित किया गया है कि इंट्राल्यूमिनल वेसिकल्स (आईएलवी) ले जाने वाले मल्टीवेसिकुलर बॉडी (एमवीबी) एंटीजन के साथ टीसीआर उत्तेजना पर आईएस8,9 (वीडियो 1)की ओर ध्रुवीकृत परिवहन का अनुभव करते हैं। सिनैप्टिक झिल्ली पर इन एमवीबी का संलयन उनके डिग्रेनुलेशन और आईएलवी को सिनैप्टिक फांक8,10के लिए एक्सोसोम के रूप में छोड़ने को प्रेरित करता है । यह Th-प्रकार के जुरकैट कोशिकाओं द्वारा गठित होता है जिन्हें एपीसी11,टीसीआर-उत्तेजित सीडी 4+ लिम्फोब्लास्ट और प्राइमेड सीटीएल के रूप में कार्य करने वाली सुपरएंटीजन-लेपित राजी कोशिकाओं के साथ चुनौती दी गई थी। इस प्रकार, जुरकैट कोशिकाओं द्वारा बनाए गए सिनेप्स एक्सोसोम के ध्रुवीकृत गुप्त यातायात का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान मॉडल का गठन करते हैं। इसके अलावा, जांच के कई दशकों से पता चला है कि टीसीआर सिग्नलिंग में कई बुनियादी अंतर्दृष्टि बदल टी सेल लाइनों के साथ अध्ययन से आया है, और वास्तव में सबसे अच्छा इन मॉडल प्रणालियों के ज्ञात Jurkat ल्यूकेमिक टी सेल लाइन12है ।
पूरी तरह से विकसित आईएस का गठन कई महत्वपूर्ण जैविक परिणामपैदा करता है, जिसमें टीएच कोशिकाओं की सक्रियता, भोले सीटीएल की सक्रियता या एजिप्ड सीटीएल द्वारा लक्षित सेल हत्या, एनेर्गी या एआईसीडी5के अलावा शामिल है। इसलिए, टी लिम्फोसाइट्स द्वारा दो प्रमुख प्रकार के गुप्त रूप ों की स्थापना की जाती है जिसके परिणामस्वरूप बहुत विविध होता है, लेकिन इसी प्रकार महत्वपूर्ण, प्रतिरक्षा प्रभावककार्य1,6,13। एक तरफ, प्राइम्ड साइटोटॉक्सिक टी लिम्फोसाइट्स (सीटीएलएस) से आईएस की ओर लिटिक कणिकाओं (जिसे “गुप्त lysosomes” कहा जाता है) के तेजी से ध्रुवीकरण (सेकंड से लेकर कुछ मिनट तक) को प्रेरित करता है। लिटिक कणिकाओं का डिग्रेनुलेशन स्राव छिद्र और ग्रैनज़ीम को सिनैप्टिक फांक14में प्रेरित करता है, जो प्रो-एपोप्टिक अणु हैं। स्रावित पेरफोरिन और ग्रैनज़ीम बाद में लक्ष्यकोशिकाओंकी हत्या के लिए प्रेरित करते हैं। सीटीएलएस अस्थायी सिनेप्स विकसित करते हैं, जो केवल कुछ मिनट तक चलते हैं, क्योंकि लक्ष्य कोशिकाओं कीहत्या3,17की होती है। संभवतः यह इस परिस्थिति के कारण है कि इष्टतम सीटीएल कार्य के लिए एक त्वरित और अस्थायी संपर्क की आवश्यकता होती है ताकि कई लक्षित कोशिकाओं3,17को यथासंभव अधिक से अधिक घातक हमलों को वितरित किया जा सके । इसके विपरीत, जुरकैट कोशिकाओं जैसे Th लिम्फोसाइट्स स्थिर, लंबे समय से खड़े होते हैं (10-30 किमी से घंटे तक) उत्पन्न होते हैं, क्योंकि यह साइटोकिन्स3,17को उत्तेजित करने के दिशात्मक और लगातार स्राव के लिए आवश्यक प्रतीत होता है। साइटोकिन्स भी गुप्त vesicles में संलग्न हैं और उनमें से कुछ (यानी, आईएल-2, आईएफएन-) आईएस17 और स्राव के लिए ध्रुवीकृत परिवहन का अनुभव करते हैं। आईएस की एक आवश्यक विशेषता टी सेल और एपीसी(वीडियो 1)के बीच अन्वेषणात्मक, कमजोर और क्षणिक संपर्कों का गठन है जो एक मजबूत बातचीत और परिपक्व आईएस की स्थापना का उत्पादन कर सकता है, यह प्रदान करते हुए कि टीसीआर कॉग्नेट एंटीजन-एमएचसी परिसरों की पहचान करता है और उचित सह-उत्तेजक कनेक्शन5स्थापित किए जाते हैं । प्रारंभिक संपर्कों की शुरुआत और परिपक्व, पूरी तरह से उत्पादक आईएस की स्थापना, स्वाभाविक रूप से स्टोचस्टिक, तेज और अतुल्यकालिक प्रक्रियाएं5,18हैं। इसके अलावा, सेल-टू-सेल19के निर्माण में एक दुर्लभ आवृत्ति है, जो इमेजिंग तकनीकों के लिए एक चुनौती का गठन कर सकती है (कृपया परिणाम और चर्चा अनुभागों का उल्लेख करें)।
टी लिम्फोसाइट्स में माइक्रोट्यूबबुल-ऑर्गनाइजिंग सेंटर (एमटीओसी) और स्रावक कणिकाओं के ध्रुवीकरण की जांच करने में एक और मुख्य चुनौती यह है कि पूरी प्रक्रिया तेज (सेकंड से कुछ मिनट), विशेष रूप से सीटीएल में है। इन तथ्यों को ध्यान में रखते हुए, सबसे जल्दी दृष्टिकोण एक अंत बिंदु रणनीति है जिसमें APC/लक्ष्य कोशिकाओं और टी lymphocytes संयुक्त रूप से मिश्रित कर रहे है और कम गति केंद्रीकरण से एकाग्र, सेल के पक्ष में सेल संजूगेट निर्माण, कई मिनट के लिए इनक्यूबेटेड, तय है और बाद में के लिए मूल्यांकन का सामना करना पड़ा MTOC और/या स्रावक vesicles की ओर स्थानांतरण20है . इस दृष्टिकोण की दो महत्वपूर्ण सीमाएं हैं: कोई जीवंत तस्करी डेटा प्राप्त नहीं किया गया था और पृष्ठभूमि MTOC/गुप्त कणिकाओं ध्रुवीकरण के उच्च स्तर प्राप्त किए गए थे, शायद स्थापना18के उदासीन चरित्र के कारण । इसके अलावा, टीसीआर-उत्तेजित, प्रारंभिक सिग्नलिंग घटनाओं (यानी, इंट्रासेल्युलर कैल्शियम उगता है, ऐक्टिन पुनर्गठन) और गुप्त वेसिकल ध्रुवीकरण के बीच कोई भी संबंध जांच करने के लिए समस्याग्रस्त है। इस प्रकार, जीवित कोशिकाओं में आईएस की उपयुक्त इमेजिंग के लिए अनिवार्य प्रावधान सेल-टू-सेल संजूगेट मूर्तकरण को बढ़ाने के लिए, आईएस की पीढ़ी को सिंक्रोनाइज़ करने के लिए और जब संभव हो, परिभाषित माइक्रोस्कोप XY क्षेत्रों और जेड पदों पर सेलुलर संजूगेट्स की स्थापना की गारंटी देने के लिए गठबंधन करते हैं। इन सभी समस्याओं से बचने के लिए कई रणनीतियां विकसित की गई हैं। इन तरीकों, उनके लाभों और कमजोरियों को समझाना इस पेपर के दायरे से बाहर है । कृपया इन महत्वपूर्ण बिंदुओं से निपटने के लिए पहले प्रकाशित समीक्षाओं का उल्लेख करें1,4,5,21.
तथ्य यह है कि वें लिम्फोसाइट्स द्वारा बनाया गया है लंबे समय से रहते थे, और परिस्थिति है कि वें लिम्फोसाइट्स MTOC में, लिम्फोकिन युक्त स्रावदा कणिकाओं और MVB कई मिनट से लेने के लिए घंटे के लिए कदम है और22 को गोदी बनाता है Th-APC यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर इमेजिंग के लिए एक आदर्श उंमीदवार है ।
इस प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि सभी सिनेप्स ऑप्टिकल धुरी के लिए आदर्श रूप से लंबवत उन्मुख नहीं होंगे। इस तकनीक का उपयोग करके, प्रतिरक्षा सिनेप्स इमेजिंग के लिए आदर्श अभिविन्यास को प्रभावित करने का कोई तरीका नहीं है। इस समस्या को ठीक करने के लिए, हम बाद के विश्लेषणों से बाहर निकलते हैं जो सभी बेतरतीब ढंग से कैप्चर किए गए सिनेप्स हैं जो अंततः आदर्श मानदंडों को पूरा नहीं करते हैं। ये सिनेप्स, उपयुक्त रूप से पर्याप्त, बहुत बार नहीं हैं। हालांकि, कई प्रयोगात्मकदृष्टिकोणों काउपयोग करके इस सीमा को दरकिनार करना संभव है।
ध्रुवीकृत सीडी63 रिलीज (डिग्रेन्युनुलेशन) को अन्य पूरक तकनीकों जैसे सीडी63 (सेल सतह पर सीडी63 पुनर्स्थानीयकरण) के जीवित कोशिकाओं (तय नहीं किया गया है और पार्मिबिलाइज्ड नहीं), चरण 6 के बाद, और बाद में धोने और निर्धारण, जैसा कि पहले8दिखाया गया था। इसके अलावा, नैनोपार्टिकल ट्रैकिंगविश्लेषण9,25 द्वारा एक्सोसोम8,9 और एक्सोसोम क्वाटिफिकेशन पर सीडी63 रिलीज किया जा सकता है। ये दृष्टिकोण निश्चित रूप से हमारे प्रोटोकॉल के साथ संगत हैं, बशर्ते जीवित कोशिकाओं की कोशिका सतह प्रतिरक्षण के बाद निर्धारण किया जा रहा हो।
हमें कोशिकाओं की आदर्श संख्या मिली है (8-अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड में 1 सेमी2 अच्छी तरह से) 4 x 105 कोशिकाएं (2 x 105 राजी कोशिकाएं और 2 x 105 ज्यूकैट कोशिकाएं) हैं क्योंकि वे कुएं के नीचे कुशलतापूर्वक पालन करते हैं। प्लास्टिक के लिए बाध्यकारी दक्षता (फाइब्रोनेक्टिन का उपयोग करना), या ग्लास बॉटम (पॉली-एल-लिसिन का उपयोग करना) माइक्रोस्लाइड आमतौर पर एक समस्या नहीं है। उच्च सेल संख्या का पालन कोशिकाओं के बीच कोई अंतराल पैदा कर सकते हैं और बाद में, जटिल सिनैप्टिक कॉन्जुगेट्स(चित्रा 1); दोनों स्थितियां वांछनीय नहीं हैं जब एकल सेल-टू-सेल संजूगेट्स को इमेजअप करने की आवश्यकता होती है, उदाहरण के लिए, एमटीओसी या गुप्त कणिका ध्रुवीकरण प्रयोग। कोशिकाओं की कम संख्या से conjugates खोजने की संभावना कम हो सकती है, खासकर जब ट्रांससंक्रमित जुरकैट कोशिकाओं को सिनेप्स उत्पन्न करने के लिए एपीसी के साथ चुनौती दी जाती है। कृपया ध्यान दें कि हमने देखा है कि प्रोटोकॉल की शुरुआत से पहले माइक्रोस्कोप एक्स/वाई चरण पर एक तापमान स्थिर चरण इनक्यूबेटर (यानी, 1-2 घंटे पहले से मंच/माइक्रोस्कोप सेटअप को स्थिर करने के लिए) स्थिर एक्स, वाई, जेड मापदंडों को बनाए रखता है, जो उचित इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है । स्वचालित फोकस सिस्टम अंततः छोटे जेड विविधताओं की भरपाई करेगा।
जब इलेक्ट्रोपॉरेज जैसी कुछ जीन ट्रांसड्यूक्शन तकनीकों का उपयोग जुरकैट क्लोन(वीडियो 1)में फ्लोरोसेंट चिमेरिक प्रोटीन (यानी जीएफपी-सीडी63) को व्यक्त करने के लिए किया जाता है, तो कोशिकाओं का काफी अंश विद्युतीकरण के बाद मर सकता है। यह एक समस्या हो सकती है क्योंकि मृत कोशिकाएं सिनेप्स नहीं बनाती हैं, जब वे जीवित, ट्रांससंक्रमित कोशिकाओं पर अधिक होते हैं, तो वे वें कोशिकाओं को जीवित करके किए गए कंजूगेट्स के गठन में हस्तक्षेप कर सकते हैं। हमने पाया है कि संजूगेट गठन कदम से पहले मानक प्रोटोकॉल का पालन करके ट्रांससंक्रमित संस्कृतियों से मृत कोशिकाओं का सावधानीपूर्वक उन्मूलन वास्तव में छवि संजूगेट्स को ठीक से छवि संजूगेट्स करने की संभावना को बढ़ा सकता है। इसके अलावा, कम ट्रांसफेक्शन क्षमता (<20%) इसके बाद से एक महत्वपूर्ण चेतावनी हो सकती है, जो एक मध्यम संजूगेट गठन दक्षता (लगभग 60%)25के साथ संयुक्त है, ट्रांससंक्रमित कोशिकाओं द्वारा बनाए गए कंजूगेट्स को खोजने की संभावना कम हो जाएगी। यह कोई समस्या नहीं है जब गैर-ट्रांससंक्रमित कोशिकाओं का उपयोग अंतिम बिंदु प्रयोगों और बाद में निर्धारण में संजूगेट्स प्राप्त करने के लिए किया जाता है। 8 माइक्रोवेल चैंबर स्लाइड पारंपरिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल के साथ संगत हैं। इससे विभिन्न उद्देश्यों के साथ उपरोक्त प्रोटोकॉल का लचीलापन बढ़ता है। एसीटोन के साथ निर्धारण प्लास्टिक के नीचे कुओं के साथ चैंबर स्लाइड का उपयोग करते समय विचार करने के लिए एक समस्या हो सकती है। हालांकि, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 8 माइक्रोवेल माइक्रोस्कोप चैंबर स्लाइड हैं जिनमें ग्लास बॉटम्स होते हैं, जो एसीटोन निर्धारण के साथ संगत होते हैं। प्लास्टिक के ढक्कन तब हटा दें जब एसीटोन का उपयोग 8 माइक्रोवेल ग्लास-बॉटम चैंबर स्लाइड में सुसंस्कृत कोशिकाओं को ठीक करने के लिए किया जाता है।
यह सिफारिश की जाती है कि माइक्रोस्कोप एक मोटराइज्ड एक्सवाई चरण, मोटराइज्ड एपि-फ्लोरेसेंस बुर्ज और ऑटोमैटिक फोकस सिस्टम (जैसे, परफेक्ट फोकस सिस्टम) या समकक्ष सप्लीमेंट से लैस है। जब बहु-अच्छी तरह से अधिग्रहण की आवश्यकता होतीहै,तो स्वचालित फोकस प्रणाली प्रयोग के साथ एक स्थिर ध्यान सुनिश्चित करेगी। पिछला अनुभव इंगित करता है कि राजी कोशिकाओं पर उचित फोकस ऑफसेट स्थापित करके, दोनों टी कोशिकाओं के आंदोलन(वीडियो 1)और XY बहु-बिंदु प्रयोगों में माइक्रोस्कोप चरण/कक्ष स्लाइड आंदोलनों को मुआवजा दिया जा सकता है । यह वास्तव में मल्टीवेल समय चूक पर कब्जा करने के लिए सुविधाजनक है ।
एक काले और सफेद, पंचरोमेटिक और कूल्ड चार्ज्ड डिवाइस (सीडीडी) कैमरे का उपयोग किया गया था लेकिन उच्च संवेदनशीलता, फ्लोरेसेंस वैज्ञानिक पूरक धातु-ऑक्साइड सेमीकंडक्टर (SCMOS) कैमरा वांछनीय है, क्योंकि इससे कैमरा एक्सपोजर समय कम हो जाएगा और अस्थायी संकल्प में वृद्धि होगी। लघु कैमरा एक्सपोजर बार हम इस्तेमाल किया है (रैंकिंग फार्म १०० एमएस से ५०० एमएस) स्वचालित फ्लोरेसेंस शटर के साथ संयुक्त लंबे समय चूक पर कब्जा (24 घंटे तक) एक पर्याप्त समय संकल्प के साथ (1 फ्रेम प्रति मिनट या उससे कम, 16 XY पदों के लिए) महत्वपूर्ण फ्लोरेसेंस ब्लीचिंग के बिना और/या सेल व्यवहार्यता में नुकसान की अनुमति देता है । मोटर चालित चरण बहु-बिंदु (XY) कैप्चर की अनुमति देता है और आदर्श अभिविन्यास में उभरते और विकासशील सिनेप्स को खोजने और छवि बनाने का मौका बढ़ाता है, लेकिन मल्टीवेल चैंबर स्लाइड में छवि अधिग्रहण की अनुमति भी देता है जब विभिन्न ज्यूरकैट क्लोन को एक साथ25संयुग्मित करने की आवश्यकता होती है। गुप्त कणिकाओं के यातायात का विश्लेषण करते समय सर्वोत्तम परिणाम प्राप्त करने के लिए उद्देश्य का उच्च संख्यात्मक एपर्चर (यानी 60x, 1.4) आवश्यक है।
राजी-SEE-Jurkat एक अच्छी तरह से स्थापित इम्यूनोलॉजिकल सिनेप्स मॉडल है कि शोधकर्ताओं के असंख्य द्वारा इस्तेमाल किया गया है के बाद से यह मूल रूप से11वर्णित किया गया है का गठन किया । हमने अपने प्रोटोकॉल को इस मॉडल के लिए अनुकूलित किया है ताकि गठन के शुरुआती दौर को ठीक से छवि दी जा सके। हमारा उद्देश्य20 पहले MTOC के ध्रुवीकरण और आईएस के प्रति गुप्त मशीनरी का अध्ययन करने के लिए पीछा जल्दी दृष्टिकोण में सुधार करने के लिए किया गया था । यह उल्लेखनीय है कि इस प्रोटोकॉल के साथ किए गए कंजूगेट्स सिनेप्स में एफ-ऐक्टिन पुनर्गठन का उत्पादन करते हैं, जो एक विहित स्मैक को विन्यास करते हैं, एमवीबी ध्रुवीकृत यातायात25को सहवर्ती रूप से। इन महत्वपूर्ण घटनाओं का विश्लेषण और मान्यता भी कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी25द्वारा की गई है .
ध्रुवीकृत यातायात में गतिज मतभेद विभिन्न प्रकार के आईएस के बीच मौजूद हैं। उदाहरण के लिए, सीटीएल से लिटिक कणिकाओं का ध्रुवीकृत परिवहन सेकंड या बहुत कम मिनटों में होता है, जबकि कई साइटोकिन युक्त वेसिकल्स को एच लिम्फोसाइट्स से समाप्त होने में कई घंटे तक लगते हैं। इन लौकिक विसंगतियों को पहले से ध्यान में रखा जाना चाहिए, ताकि सबसे अच्छी रणनीति डिजाइन करने के लिए और सबसे उपयुक्त प्रयोगात्मक और इमेजिंग दृष्टिकोण का चयन करने के लिए, क्योंकि कुछ इमेजिंग स्ट्रैजम्स (यानी, लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (एलएससीएम)) के लिए, समय एक सीमित कारक हो सकता है क्योंकि कैप्चर समय उचित समय संकल्प (1 मिन या उससे कम)4से बहुत अधिक है। यह एक सीमा नहीं है जब व्यापक क्षेत्र फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (WFFM) के रूप में ऊपर प्रोटोकॉल में वर्णित प्रयोग किया जाता है । चूंकि सीटीएल में, सिनेप्स की ओर एमटीओसी का ध्रुवीकरण केवल कुछ मिनटोंतक रहता है3,6,17,विविध विशिष्ट राज्य-कला माइक्रोस्कोपी यहां वर्णित करने के लिए अलग-अलग दृष्टिकोण (लेकिन उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प को शरण देना) इन सिनेप्स26,27को ठीक से छवि बनाने के लिए आवश्यक हैं, मुख्य रूप से जब कई माइक्रोस्कोप क्षेत्र (बहु-बिंदु कैप्चर) छवि वाले होते हैं। इन उच्च संकल्प, नए दृष्टिकोण भी Th lymphocytes द्वारा किए गए synapses इमेजिंग के लिए उपयोग किया जा सकता है, हालांकि किफायती और/या रसद कारणों (यानी, इन इमेजिंग तकनीकों में से कुछ के लिए आवश्यक मुख्य उपकरण यहां वर्णित एक से 6-7 गुना अधिक लागत) निश्चित रूप से कला इमेजिंग तरीकों के इन राज्य के लिए एक सीमा का गठन कर सकता है4। तथ्य यह है कि वें लिम्फोसाइट्स द्वारा बनाया गया है लंबे समय से रहते थे, और परिस्थिति है कि वें लिम्फोसाइट्स MTOC में, लिम्फोकिन युक्त स्रावशील वेसिकल्स और एमवीबी को परिवहन और डॉक22में कई मिनट तक का समय लगता है, इस प्रोटोकॉल को वें-एपीसी आईएस इमेजिंग के लिए एक आदर्श, किफायती दृष्टिकोण बनाता है।
अधिग्रहण के बाद छवि deconvolution के संयोजन में WFFM एक दिलचस्प दृष्टिकोण का गठन करता है और न केवल आर्थिक कारण इस रणनीति का समर्थन करते हैं। जेड धुरी (तकनीक की सबसे महत्वपूर्ण चेतावनी) में आंतरिक गरीब संकल्प को अधिग्रहण के बाद छवि डेकोनोवोलुशन4 (वीडियो 2के साथ वीडियो 1 की तुलना) का उपयोग करके सुधारा जा सकता है। डेकोवोलुशन एक गणना-आधारित, छवि प्रसंस्करण दृष्टिकोण का उपयोग करता है जो शोर अनुपात और छवि संकल्प के लिए संकेत में सुधार कर सकता है और इसके विपरीत27 से 2 गुना तक, XY धुरी में 150-100 एनएम और जेड एक्सिस4में 500 एनएम तक नीचे।
उच्च संवेदनशीलता, उच्च readout गति और व्यापक गतिशील रेंज, नए फ्लोरेसेंस sCMOS कैमरों का उपयोग छवियों की गुणवत्ता में सुधार होगा और फ्लोरेसेंस ब्लीचिंग को कम करेगा । यहां वर्णित सेल-टू-सेल कंजुगन प्रोटोकॉल द्वारा पेश किया गया लचीलापन कला माइक्रोस्कोपी तकनीकों के कई राज्य के साथ वर्णित सेलुलर दृष्टिकोण के संयोजन की अनुमति देता है, दोनों जीवित कोशिकाओं में, लेकिन निश्चित कोशिकाओं में भी, और अपेक्षित परिणाम वास्तव में इम्यूनोलॉजिकल सिनेप्स के बारे में हमारे ज्ञान में सुधार होगा।
यद्यपि हमने आसान-से-हैंडल, अच्छी तरह से स्थापित सेल लाइनों का उपयोग करके प्रोटोकॉल को लागू और मान्य किया है, लेकिन संभावित दृष्टिकोण अधिक शारीरिक बातचीत के दृश्य की अनुमति दे सकता है जब प्राथमिक टी कोशिकाएं और विभिन्न प्रकार की एंटीजन-पेश कोशिकाएं (जैसे मैक्रोफेज की डेंड्रिटिक कोशिकाएं) का उपयोगकियाजाता है। इस संदर्भ में, प्राथमिक माउस टी लिम्फोब्लास्ट9को चुनौती देने के लिए एपीसी के रूप में उपयोग की जाने वाली सुपरएंटीजन (एसईबी) -स्पंदित माउस ईएल-4 सेल लाइन का उपयोग करके इस प्रोटोकॉल को भी बढ़ाया और मान्य किया गया है। वास्तव में प्राथमिक टी लिम्फोसाइट्स, विशेष रूप से सीटीएल, और अधिक अल्पकालिक और गतिशील सिनैप्टिक संपर्क प्रदान किए गए(9संदर्भ में पूरक वीडियो 8 देखें) देखें-राजी और जुरकैट मॉडल के साथ देखे गए लोगों के लिए। सिनैप्टिक संपर्क मोड की परिवर्तनशीलता को दो-आयामी इन विट्रो ऊतक समकक्ष में डेंड्रिटिक कोशिकाओं या बी कोशिकाओं के साथ प्राथमिक टी-सेल इंटरैक्शन के लिए सबसे अच्छा देखा जा सकता है जिसे इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके रिकॉर्ड और विश्लेषण भी किया जा सकता है। इसके अलावा, सुपरएंटीजन के अलावा, तकनीक का उपयोग अन्य प्रकार के सिनेप्स को इमेज करने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, इसका उपयोग टीसीआर ट्रांसजेनिक, एंटीजन-विशिष्ट टी सेल मॉडल में किया जा सकता है, उदाहरण के लिए ओवएल्बिन विशिष्ट मूत्र OT1/OT2 प्रणाली का उपयोग करके या एंटीजन-विशिष्ट टी सेल रिसेप्टर्स के साथ टी कोशिकाओं के ट्रांसफेक्शन द्वारा । यह तत्काल भविष्य के लिए प्रयोगात्मक संभावनाओं के असंख्य खोलता है ।
The authors have nothing to disclose.
हम उनके उदार योगदान के लिए प्रयोगशाला के सभी अतीत और वर्तमान सदस्यों को स्वीकार करते हैं । इस काम को स्पेनिश मिनिस्टरियो डी ओनिमिया वाई प्रतिस्पर्धी (MINECO), प्लान नैसिनल डी Investigación Científica (SAF2016-77561-R से M.I., जो फेडर-ईसी फंडिंग के साथ दिए गए हिस्से में था) से अनुदान द्वारा समर्थित था। हम उनके समर्थन और वीडियो का उत्पादन करने के लिए प्रदान की जाने वाली सुविधाओं के लिए Facultad de मेडिविना (UAM) और Facultad de मेडिविज़र को स्वीकार करते हैं। हम निरंतर और शानदार तकनीकी और सैद्धांतिक समर्थन के लिए NIKON-यूरोप स्वीकार करते हैं । इस लेख के लिए मुफ्त पहुंच निकॉन द्वारा प्रायोजित है।
Camera Nikon DS-QI1MC | Nikon | MQA11550 | Cooled Camera Head |
CMAC | ThermoFisher Scientific | C2110 | Cell tracker blue |
JURKAT cells | ATCC | ATCC TIB-152 | Effector T lymphocytes |
μ-Slide 8 well ibiTreat, μ-Slide 8 well Glass-Bottom | IBIDI | Cat.No: 80826, 80827 | Cell culture and cell imaging supports |
Microscope NIKON Eclipse Ti-E | Nikon | NIKON Eclipse Ti-E | Wide-field fluorescence, fully-motorized microscope equipped with Perfect Focus System (PFS) option |
Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module | OKOLAB | H201-NIKON-TI-S-ER | Cell culture atmosphere |
Raji Cells | ATCC | ATCC CCL-86 | APC |
RPMI medium GIBCO | ThermoFisher Scientific | 21875034 | Culture medium |
Streptococcus Enterotoxin E (SEE) | Toxin Technology, Inc | EP404 | Bacterial Toxin |
Software Huygens Essential | SVI | Huygens Essential | Image Deconvolution software |
Software Image J | NIH | Image J | Image software |
Software Nikon NIS-AR | Nikon | NIS-Elements AR | Image capture and analysis software |