Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Een macrophage reporter Celassay om Tolachtige receptor-gemedieerde NF-kB/AP-1-signalering op geadsorbeerde proteïne lagen op polymere oppervlakken te onderzoeken

Published: January 7, 2020 doi: 10.3791/60317
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemical Engineering, Queen's University

Summary

Dit protocol biedt onderzoekers een snelle, indirecte methode voor het meten van TLR-afhankelijke NF-кB/AP-1 transcriptiefactor-activiteit in een muriene macrofaag cellijn in reactie op een verscheidenheid aan polymere oppervlakken en geadsorbeende eiwit lagen die de micro omgeving van het biomateriaal implantaat modelleren.

Abstract

De aanhoudende inflammatoire gastheer reactie op een geïmplanteerd biomateriaal, bekend als de reactie van het vreemde lichaam, is een belangrijke uitdaging in de ontwikkeling en implementatie van biomedische apparaten en weefsel engineering constructies. Macrofagen, een aangeboren immuuncel, zijn belangrijke spelers in de reactie van het vreemde lichaam omdat ze op de implantatieplaats blijven gedurende de levensduur van het apparaat, en worden vaak bestudeerd om een goed begrip te krijgen van deze nadelige reactie van de gastheer. Veel biomaterialen onderzoekers hebben aangetoond dat geadsorlageerde proteïne lagen op geïmplanteerde materialen het macrofaag gedrag beïnvloeden en vervolgens invloed hebben op de reactie van de gastheer. De methoden in dit artikel beschrijven een in vitro model met behulp van geadsorpete eiwit lagen met cellulaire schade moleculen op polymeer biomateriaal oppervlakken om macrofaag reacties te beoordelen. Een NF-кb/AP-1 reporter macrofaag cellijn en de bijbehorende colorimetrische alkalische fosfatase assay werden gebruikt als een snelle methode om indirect te onderzoeken NF-кb/AP-1 transcriptiefactor activiteit in reactie op complexe geadsorbeerden eiwit lagen met bloed eiwitten en schade-geassocieerde moleculaire patronen, als model van de complexe geadsorreven proteïne lagen gevormd op biomateriaal oppervlakken in vivo.

Introduction

De reactie van het vreemde lichaam (FBR) is een chronische reactie van de gastheer die een negatieve invloed kan hebben op de prestaties van een geïmplanteerd materiaal of apparaat (bijv. medicatie bezorgings apparatuur, biosensoren), door de aanhoudende afgifte van ontstekingsmediatoren en door het belemmeren van de integratie tussen het geïmplanteerde materiaal en het omringende weefsel1. Deze aangeboren immuunrespons wordt geïnitieerd door de implantatie procedure en wordt gekenmerkt door de langdurige aanwezigheid van aangeboren immuuncellen en vezelig capsule vorming rond het implantaat1. Binnen de context van materiële gastheer reacties, macrofaag-materiaal interacties hebben een aanzienlijke invloed op de progressie van de reactie van de gastheer en de ontwikkeling van een FBR1. Macrofagen zijn een gevarieerde aangeboren immuuncelpopulatie, die wordt gerekruteerd op de implantatieplaats, hetzij van weefsel-Resident macrofaag populaties of van het bloed als monoyte-afgeleide macrofagen. Ze beginnen zich op de implantatieplaats te accumuleren kort na de inplanting en worden binnen enkele dagen de overheersende celpopulatie in de micro omgeving van het implantaat. Materiaal aanhechting macrofagen, samen met vreemde lichaam reuscellen (fbgc) gevormd door macrofaag fusie, kan aanhouden op het materiële oppervlak voor de levensduur van het implantaat2,3. Bijgevolg worden macrofagen beschouwd als belangrijke spelers in de reactie van het buitenlandse lichaam als gevolg van hun rollen die de karakteristieke stappen van de FBR indelen: acute inflammatoire respons, weefsel remodellering, en vorming van fibrotische weefsel1.

Toll-achtige receptoren (TLRs) zijn een familie van patroon erkenning receptoren die worden uitgedrukt door vele immuuncellen, met inbegrip van macrofagen, en is aangetoond dat het spelen van een belangrijke rol bij ontsteking en wondgenezing. Naast pathogenen afgeleide liganden, kunnen Tlr's endogene moleculen binden, bekend als schade-geassocieerde moleculaire patronen (DAMPs), die vrijkomen tijdens celnecrose en ontstekings signalerings trajecten activeren, resulterend in de productie van proinflammatoire cytokines4. Wij en anderen hebben voorgesteld dat schade die is opgelopen tijdens implantatie procedures voor zacht weefsel biomateriaal, de Damps, die vervolgens worden geadsord aan biomateriale oppervlakken in aanvulling op bloed proteïnen, en de daaropvolgende celmateriaalinteracties met een moduleren van5,6. Wanneer macrofagen interactie met de geadsorbende proteïne-laag op een implantaat, hun oppervlak TLRs kunnen geadsorberen DAMPs herkennen en activeren proinflammatoire signalering Cascades, wat leidt tot NF-κB en AP-1 transcriptiefactor activering en productie van proinflammatoire cytokines. We hebben eerder aangetoond dat Murine macrofagen significant hebben verhoogd NF-κB/AP-1 activiteit en tumor necrose factor α (TNF-α, proinflammatoire cytokine) secretie in reactie op vocht bevattende geadsorbeerde eiwit lagen op verschillende polymere oppervlakken in vergelijking met oppervlakken met geadsorbeerd serum of plasma (d.w.z. geen DAMPs aanwezig), en dat deze respons grotendeels wordt gemedieerd door TLR2, terwijl TLR4 een mindere rol speelt5.

De NF-κb/AP-1 reporter macrofaag cellijn (tabel met materialen) gebruikt in dit protocol is een handige methode voor het meten van relatieve NF-κb en AP-1 activiteit in macrofagen5,7,8. In combinatie met TLR-pathway-remmers is deze cellijn een nuttig hulpmiddel voor het onderzoeken van TLR-activering en zijn rol in ontsteking als reactie op een verscheidenheid aan stimuli5,7,8. De reporter cellen zijn een gemodificeerde muis macrophage-achtige cellijn die stabiel kan produceren uitgescheiden embryonale alkalische fosfatase (SEAP) op NF-κB en AP-1 transcriptiefactor activering9. De colorimetrische enzymatische alkalische fosfatase assay (tabel met materialen) kan vervolgens worden gebruikt om relatieve hoeveelheden seap-expressie te kwantificeren als indirecte maatstaf van NF-κb/AP-1-activiteit. Omdat NF-κB en AP-1 stroomafwaarts liggen van veel cel signalerings trajecten, kunnen neutraliserende antilichamen en remmers die gericht zijn op specifieke Tlr's (bijv. TLR2) of TLR-adapter moleculen (bijvoorbeeld MyD88) worden gebruikt om de rol van een specifiek traject te controleren. De in dit artikel beschreven methodologie biedt een eenvoudige en snelle benadering voor het beoordelen van de bijdrage van TLR-signalering in muriene macrofaag responsen op een verscheidenheid aan polymere oppervlakken met geadsorlageerde proteïne lagen die zowel bloed eiwitten als DAMPs bevatten als een in vitro model van geïmplanteerde biomaterialen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. voorbereiding van media en reagens

  1. Bereid fibroblast-media voor. Combineer 450 mL van Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM), 50 mL foetaal runderserum (FBS) en 5 mL penicillaire/streptomycine. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 3 maanden.
  2. Bereid reporter macrofaag groeimedia voor in 50 mL aliquots. Combineer 45 mL DMEM, 5 mL FBS, 5 μg/mL Mycoplasma eliminatie reagens (tabel met materialen) en 200 μg/ml phleomycine D1 (tabel met materialen). Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 3 maanden.
  3. Bereid reporter macrofaag assay media voor in 50 ml aliquots. Combineer 45 mL DMEM, 5 mL van de warmte geïnactiveerde FBS (HI-FBS), 5 μg/mL Mycoplasma eliminatie reagens en 200 μg/mL phleomycine D1. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 3 maanden.

2. coating celkweek oppervlakken met poly (methylmethacrylaat)

  1. Los poly (methylmethacrylaat) (PMMA) op in chloroform bij 20 mg/mL (bijv. 100 mg PMMA in 5 mL chloroform) in een glazen Scintillatie flacon van 20 mL. Plaats een magnetische roerstaaf in de injectieflacon en laat gedurende ten minste 2 uur roeren totdat alle vaste stoffen zijn opgelost.
    Let op: Chloroform is schadelijk bij inademing. Zorg ervoor dat u oplosmiddel in een rook afzuigkap gebruikt terwijl u PVA-handschoenen draagt.
  2. Pipetteer 400 μL PMMA-oplossing op het midden van een borosilicaatglas microscoopglaasje in een spin coater en draai bij 3000 rpm gedurende 2 minuten. bereid het aantal dia's voor de assay voor, evenals 3 − 5 extra voor de meting van de water contacthoek. Bewaar dia's in een schone doos (gespoten en afgeveegd met 70% ethanol) voor toekomstig gebruik.
    Opmerking: Spin coating wordt vaak gebruikt om een dunne, uniforme coating op een vlakke ondergrond te storten. Een spin coater roteert een substraat op hoge snelheden, met behulp van centrifugale kracht om de coating oplossing over het oppervlak te spreiden.
    1. Meet de watercontact hoek op twee willekeurige posities op het oppervlak van extra gecoate dia's (d.w.z. niet de dia's die worden gebruikt voor celkweek) met een goniometer om ervoor te zorgen dat het glasoppervlak volledig is bekleed met het polymeer.
      Opmerking: Alleen water van de hoogste zuiverheid (bijv. glas driedubbele gedistilleerd) moet worden gebruikt voor de metingen van de water contacthoek.
  3. Bevestig in een biologische veiligheidskast (BSC) 8-kamer kleverige putten aan PMMA gecoate-dia's met behulp van steriele Tang en na aseptische techniek. Druk stevig aan de bovenkant van de kleverige putten om ervoor te zorgen dat ze sterk zijn bevestigd. Inbroed de glaasjes met bijgevoegde Kleef putten bij 37 °C 's nachts om de afdichting te beveiligen.
    1. Test het zegel van de kleverige putten door toevoeging van 200 μL celkweek kwaliteit (endotoxine-vrij) water aan elk putje. Incuberen bij kamertemperatuur (RT) gedurende 60 min en zorg ervoor dat er geen lekkage is voordat u doorgaat. Zuig het water op en zorg ervoor dat de PMMA-coating niet wordt verstoord.
  4. Voer endotoxine vrije water spoelingen uit door aan elke put 300 μL endotoxine vrij water toe te voegen en gedurende 1 uur (driemaal), 12 uur en 24 uur te gebruiken om het resterende oplosmiddel te verwijderen.
  5. Test de endotoxine concentratie van de te gebruiken glijbanen voor de celkweek. Incuberen 200 μL endotoxine vrij reagens water (tabel metmaterialen) in één put van elke dia gedurende 1 uur. meet de endotoxine concentratie in het extract met behulp van een eindpunt chromogene endotoxine assay (tabel met materialen).
    Opmerking: Het volgende protocol is specifiek voor de endotoxine-assay-kit die in de tabel met materialenwordt vermeld.
  6. Gebruik alleen water en verbruiksartikelen (d.w.z. pipetpunten, micro centrifugebuizen en goed platen) die voor dit werk zijn gecertificeerd pyrogeen-vrij (d.w.z. endotoxine-vrij). Ook moet elk glaswerk dat wordt gebruikt bij de bereiding van de polymeer gecoate oppervlakken depyrogenated met behulp van droge warmte sterilisatie (250 °C gedurende 30 minuten) vóór gebruik10. Het meten van Endotoxine in de extractieoplossing, zoals hier beschreven, kan resulteren in een onderschatting van endotoxine op het materiële oppervlak11,12. Daarom wordt het aanbevolen om bij het ontwikkelen van een polymeer coating protocol de endotoxine test reactie (d.w.z. stappen 2.5.4 − 2.5.6 voor test monsters [reagens water] of Spike Controls) rechtstreeks in putten met het gecoate monster te verrichten, zodat er tijdens het coatingproces onbedoeld geen bronnen van Endotoxine in het systeem worden ingebracht.
    1. Breng alle test monsters (d.w.z. extracten) en endotoxine test reagentia aan op RT. Reconstitueer chromogene reagens in de test buffer en endotoxine norm in reagens water, laat 5 minuten los en zwenk zachtjes voordat u het gebruikt. Bedek alle flessen met paraffine folie wanneer ze niet in gebruik zijn.
    2. Maak een 5 − 8-punts standaard verdunnings curve van endotoxine-standaard, variërend van de onderste tot de bovengrens van de test door een seriële verdunning van de endotoxine norm in reagens water uit te voeren.
    3. Voor de controle op verbetering of remming van de endotoxine test in proefmonsters, een positieve controle (ook wel een piek controle of spiked monster) voorbereiden door een bekende hoeveelheid Endotoxine in ongebruikte testmonster oplossing te verdunen.
      Opmerking: De concentratie van de positieve controle moet dezelfde concentratie zijn als een standaard in het midden van de standaard curve. Als de herstelde hoeveelheid van de endotoxine piek (d.w.z. de concentratie van de positieve controle minus de concentratie van het niet-spiked testmonster) binnen 50 − 200% van de nominale concentratie van de endotoxine piek ligt, kan de extractieoplossing worden overwogen om de test niet significant te verstoren.
    4. Voeg 50 μL standaarden, samples of Spike Controls toe aan elke put van een 96-well plaat in duplicaat of drievoud. Gebruik reagens water als een negatieve controle.
    5. Voeg 50 μL chromogene reagens toe aan elke put. Voeg snel reagens toe aan alle putjes. Gebruik een timer om de hoeveelheid tijd die het kost om reagens toe te voegen aan alle putjes op te nemen. Bedek de plaat met een Kleef zegel en inbroed bij 37 °C (incubatietijd is veel afhankelijk en wordt vermeld op het analysecertificaat dat in de chromogene reagenskit is opgenomen). U de plaat ook elke 15 min tijdens de incubatie controleren tot de kleurverandering in alle standaard putten wordt waargenomen.
    6. Voeg na incubatie 25 μL van 50% azijnzuur toe aan elk goed (eindconcentratie van 10% azijnzuur per put) om de reactie te stoppen. Voeg azijnzuur toe in dezelfde volgorde als het chromogene reagens is toegevoegd. Lees de extinctie van de plaat met behulp van een plaat lezer bij 405 nm. Zuig vloeistof en gooi de plaat weg.
      Opmerking: Toevoeging van azijnzuur moet even lang duren om toe te voegen aan elk goed als het chromogene reagens duurde (± 30 s).
  7. Ultraviolet (UV) steriliseren de dia's gedurende 30 minuten voorafgaand aan celkweek experimenten.

3. coating celkweek oppervlakken met Polydimethylsiloxaan

  1. Meng Polydimethylsiloxaan (PDMS) elastomeer in een gewichtsverhouding van 10:1 (basis: Uithardings middel). Pipetteer in een biologische veiligheidskast ongeveer 10 mL Polydimethylsiloxaan base in een steriele buis. Weeg de buis en voeg langzaam Uithardings middel toe tot 10% is toegevoegd.
    Let op: Gebruik PDMS-reagentia in een goed geventileerde ruimte en Vermijd oogcontact door het dragen van een veiligheidsbril.
  2. Meng het elastomeer grondig door te roeren met een steriele serologische pipetpunt en door op en neer te pipetteren. Voeg ongeveer 200 μL van de oplossing toe aan elke put van een 48-well plaat. Kantel de putplaat langzaam om een volledige dekking van putten met elastomeer oplossing te garanderen.
  3. Plaats de goed plaat met elastomeer in een vacuüm oven ingesteld op 50 cmHg, 40 °C. Verwijder het deksel en de afdekking met een enkellaags doekje om te voorkomen dat ander vuil in de putjes valt. Laat ten minste 48 h inbroed.
    1. Bevestig dat de putten volledig zijn gecoat via visuele inspectie. Zorg ervoor dat het elastomeer volledig is genezen door zachtjes te proppen met een steriele pipetpunt voordat u het verwijdert.
  4. Voeg 300 μL van 70% ethanol (gemaakt met absolute ethanol en endotoxine vrij water) toe en inbroed bij RT gedurende 1 uur. Verwijder de ethanol en voer endotoxine-vrije water wasses door toevoeging van 300 μL endotoxine-vrij water aan elke put en inbroed voor 1 h (drie keer), 12 h en 24 uur vóór gebruik om het resterende oplosmiddel te verwijderen.
    1. Incubatie 200 μL endotoxine vrij water in drie putjes van elke plaat gedurende 1 uur. meet de endotoxine concentratie van de water extracten met behulp van een eindpunt chromogene endotoxine test (stappen 2.5.1 − 2.5.6).

4. coating celkweek oppervlakken met gefluoreerd poly (tetrafluorethyleen)

  1. Maak een oplossing van 1 mg/mL gefluoreerd poly (tetrafluorethyleen) (fPTFE) (Voeg bijvoorbeeld 10 mg fPTFE toe aan 10 mL gefluoreerd oplosmiddel [tabel met materialen]) in een glazen Scintillatie flacon van 20 ml. Plaats een magnetische roerstaaf in de injectieflacon en laat gedurende ten minste 24 uur roeren totdat alle vaste stoffen zijn opgelost.
  2. Voeg ongeveer 150 μL van de polymeeroplossing toe aan elk goed van een polystyreen 48-goed plaat (d.w.z. geen weefselcultuur behandeld). Kantel de putplaat langzaam om een volledige dekking van alle putten met polymeeroplossing te garanderen. Deksel vervangen.
    1. Om een effectieve fPTFE-coating van putten te garanderen, moeten glazen afdek stroken in fPTFE worden gecoat en worden gebruikt voor de meting van de water contacthoek (stap 4.3.1). Plaats de dekstroken in de putjes van een 24-putplaat. Voeg ongeveer 400 μL van de polymeeroplossing toe aan elke put die een dekslip bevat. Duw de afdekplaten omlaag met de steriele Tang, zorg ervoor dat ze volledig bedekt zijn met een polymeeroplossing en dek de goed plaat af met een deksel.
  3. Plaats de goed plaat met polymeeroplossing en/of dekstroken in een vacuüm oven ingesteld op 50 cmHg, 40 °C. Verwijder het deksel en de afdekking met een enkellaags doekje om te voorkomen dat ander vuil in de putjes valt. Laat ten minste 48 h inbroed.
    1. Meet de water contacthoek van met fPTFE beklede dekstroken met een goniometer om een effectieve coating te garanderen.
      Opmerking: Alleen water van de hoogste zuiverheid (bijv. glas driedubbele gedistilleerd) moet worden gebruikt voor de metingen van de water contacthoek.
  4. Voeg 300 μL van 70% ethanol (gemaakt met absolute ethanol en endotoxine vrij water) toe en inbroed bij RT gedurende 1 uur. Verwijder de ethanol en voer endotoxine-vrije water wasses door toevoeging van 300 μL endotoxine-vrij water aan elke put en inbroed voor 1 h (drie keer), 12 h en 24 uur vóór gebruik om het resterende oplosmiddel te verwijderen.
    1. Incubatie 200 μL endotoxine vrij water in drie putjes van elke plaat gedurende 1 uur. meet endotoxine concentratie van water extracten met behulp van een eindpunt chromogene endotoxine test (stappen 2.5.1 − 2.5.6).
  5. UV steriliseren de goed platen gedurende 30 minuten voorafgaand aan celkweek experimenten.

5. Lysaat maken van 3T3 cellen

  1. Groei 3T3 cellen in meerdere T150 kolven tot 70% samenvloeiing. Om cellen te ontkoppelen, aspireren media, wassen oppervlak met 5 ml PBS, en aspiraat PBS. Voeg 5 mL vrij van dierlijke oorsprong, recombinant celdissociatie enzym (tabel met materialen) toe en incuberen bij 37 °c gedurende 3 − 5 min.
  2. Maak de cellen los door de kolf voorzichtig heen en weer te kantelen. Voeg 5 mL PBS toe om het recombinant enzym dat wordt gebruikt voor celdissociatie te neutraliseren. Breng de losgekoppelde cellen van de kolven over in een centrifugebuis en meng via pipetteren. Voer een aantal live cellen met behulp van de kleurstof van een hemocytometer en de levensvatbaarheid van de cel.
    Opmerking: Een celdissociatie enzym dat door verdunning in PBS kan worden geneutraliseerd, werd geselecteerd om de introductie van serum gebaseerde eiwitten in het lysaat preparaat te voorkomen. Als trypsine wordt gebruikt om cellen te ontkoppelen, moet het worden geneutraliseerd met een serum bevattende oplossing en moet een extra PBS-wasbeurt worden uitgevoerd om de hoeveelheid serumeiwitten die in het lysaat preparaat wordt meegenomen, te verminderen.
  3. Centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 5 min. Zuig de supernatant op en hervat de cellen in het oorspronkelijke volume (D.w.z. 10 ml x aantal kolven) van PBS om eventuele resterende media af te spoelen. Herhaal.
  4. Centrifugeer de cellen opnieuw bij 200 x g gedurende 5 minuten en zuig het supernatant op. Voeg het volume PBS toe dat nodig is om een uiteindelijke celconcentratie van 1 x 106 cellen/ml te bereiken. Plaats de celoplossing in een vriezer van 80 °C totdat het monster volledig is bevroren (ten minste 2 uur).
  5. Ontdooien van de celoplossing in een waterbad van 37 °C. Eenmaal volledig ontdooid, plaats de oplossing terug in de vriezer-80 °C tot volledig bevroren. Herhaal dit voor een totaal van 3 vries-dooi cycli.
  6. Voer een micro bicinchonininezuur (BCA)-test uit op het cellysaat bij een verscheidenheid aan verdunningen (bijv. 1/100, 1/200, 1/500, 1/1000) om de eiwitconcentratie te bepalen. Verdun de cellysaat tot een eiwitconcentratie van 468,75 μg/mL, aliquot, en bewaar bij-80 °C voor toekomstig gebruik.
    Opmerking: De uiteindelijke eiwitconcentratie in een 48-put is 125 μg/cm2 (gebaseerd op de oppervlakte van een put, 0,75 cm2).
  7. Voer een Western-Blot uit om de aanwezigheid van Damps in lysaat te beoordelen (bijv. warmteshock proteïne 60 [HSP60], High Mobility Group Box 1 [HMGB1]) door 40 − 60 μg lysaat-eiwit in laad buffer op een 1,5 mm dikke 10% polyacrylamidegel te laden en de standaard Western Blot te volgen Procedures.

6. beoordeling van het effect van geadsorbede eiwit lagen en Tolachtige receptoren op de NF-κB-activiteit van macrofagen

Opmerking: Voor een schematische weergave van de experimentele workflow en de plaat indeling, Zie Figuur 1a en aanvullende figuur 1respectievelijk.

  1. Groei reporter macrofagen in een kolf van voldoende grootte tot 70% samenvloeiing. Aspiraat media, Wash oppervlak met PBS, en aspiraat PBS. Voeg het recombinant celdissociatie enzym toe en inincuberen bij 37 °C gedurende 8 min.
  2. Maak de cellen los door de zijkanten van de kolf vast te tikken. Het recombinant celdissociatie enzym inactiveren door een gelijk volume aan groeimedia toe te voegen (met 10% FBS). Voer een aantal live cellen met behulp van de kleurstof van een hemocytometer en de levensvatbaarheid van de cel.
    Opmerking: Verwachte levensvatbaarheid voor de verslaggever macrofagen na een incubatie van 8 min in het celdissociatie enzym is 90%.
  3. Centrifuge cellen bij 200 x g gedurende 5 min. aspireren supernatant en respenderen in het oorspronkelijke volume van PBS om cellen te wassen. Centrifugeer opnieuw en respendeer cellen met 7,3 x 105 cellen/ml in testmedia (met warmte GEÏNACTIVEERDE FBS).
  4. Aparte celsuspensie in 3 verschillende buisjes: TLR4 inhibitor, anti-TLR2, en onbehandeld. Incuberen cellen met 1 μg/mL TLR4 remmer voor 60 min bij RT of met 50 μg/mL anti-TLR2 gedurende 30 min bij RT.
  5. Voeg 200 μL lysaat, 10% FBS, 10% commercieel muis plasma (tabel van de materialen) of een mengsel van de eiwit oplossingen toe aan een 48-put (of gelijkwaardig) en laat eiwitten adsorgeven bij 37 °c gedurende de gewenste hoeveelheid tijd (d.w.z. 30 min, 60 min of 24 h). Aspirate eiwit oplossingen uit putten, met behulp van een verse Pasteur pipet voor elke eiwit oplossing, en wassen oppervlakken met 250 μL PBS voor 5 min. Aspirate PBS. Herhaal dit voor een totaal van 3 washes.
    Opmerking: Deze stap moet mogelijk eerder in het protocol worden gestart, afhankelijk van de gewenste adsorptie tijd. Pas het protocol dienovereenkomstig aan.
  6. Na incubatietijd met de TLR4 remmer of anti-TLR2, pipet cellen te hervatten. Voeg 200 μL celoplossing toe aan elk goed.
  7. Voor TLR2 positieve controleconditie, voeg Pam3CSK4 toe aan een eindconcentratie van 150 ng/mL. Voor TLR4 positieve controle toestand, voeg lipopolysaccharide (LPS) toe aan een eindconcentratie van 1,5 μg/mL. Incuberen cellen bij 37 °C gedurende 20 uur.
  8. Proef 20 μL supernatant van elke put en plaat in tweevoud in een 96-goed plaat. Neem drie putjes van 20 μL testmedia als achtergrond besturingselement. Voeg 200 μL SEAP reporter assay reagens toe aan elk goed. Bedek de plaat met een Kleef zegel en inincuberen voor 2,5 uur bij 37 °C.
    Opmerking: De incubatietijd kan variëren afhankelijk van de experimentele omstandigheden en moet worden geoptimaliseerd voor een sterk verschil in absorptie tussen positieve en negatieve controle putten.
    1. Breng de rest van de supernatant over in een buis van 1,5 mL (per put). Centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 10 minuten om vuil te maken. Breng supernatant over naar een nieuwe 1,5 mL Tube en bewaar bij-80 °C. Analyseer supernatant voor de aanwezigheid van proinflammatoire cytokines (bijv. TNF-α, Interleukine 6) via enzym-linked immunosorbent assay (ELISA).
  9. Verwijder de afdichting van de kleefplaat. Lees de extinctie van de plaat met behulp van een plaat lezer bij 635 nm. Zuig vloeistof en gooi de plaat weg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Reinigingsmethoden voor de polymeer gecoate oppervlakken werden getest om ervoor te zorgen dat er geen verstoring van de coating was, wat zou worden gezien als een verandering in de water contacthoek tot een ongecoat glazen dekglaasje (Figuur 2). Het inweken van PMMA-gecoate Microscoop-dia's in 70% ethanol voor 1 uur werd gevonden om de PMMA-coating te verwijderen (Figuur 2, linker paneel), waarschijnlijk als gevolg van de oplosbaarheid van pmma in 80 WT% ethanol13, daarom werden PMMA-gecoate oppervlakken gereinigd met 30 minuten alleen UV-sterilisatie. De concentratie van PMMA voor coating werd eerder geoptimaliseerd5. Een 1 h 70% ethanol Soak werd gebruikt om PDM'S schoon te maken, en UV-sterilisatie werd verwaarloosd omdat UV-licht de kettingscissie kan veroorzaken en de oppervlakte eigenschappen van PDMS14kunnen beïnvloeden. Zowel 70% ethanol Soak als UV-sterilisatie beïnvloedden de water contacthoek van dekstroken met fPTFE-coating niet (Figuur 2, rechter paneel), daarom werden de twee methoden, achtereenvolgens, gebruikt om fptfe-coatings te reinigen. De methode van fPTFE-coating werd eerder beschreven door de Grainger groep15.

Een Western Blot werd uitgevoerd op het 3T3 lysaat om ervoor te zorgen dat er vochtige soorten aanwezig waren in het complexe moleculaire mengsel. De resultaten toonden aan dat zowel HMGB1 als HSP60, twee goed gedocumenteerde Damps16,17, aanwezig waren in het lysaat (Figuur 1B). De adsorptie van TLR liganden uit het lysaat op de polymeer oppervlakken werd bevestigd door de kweek reporter macrofagen (onbehandeld, TLR2 geneutraliseerd, of TLR4 geremd) voor 20 h op eiwit-geadsorbeerd polymeer Oppervlakken (dat wil zeggen, weefsel cultuurbehandeld polystyreen [TCPS], PMMA, PDMS, fptfe), en vervolgens indirect beoordelen NF-кb/AP-1 activiteit op basis van de seap-productie met behulp van een enzymatische assay Bovendien had de reporter macrofagen de NF-кB/AP-1-activiteit significant verhoogd op geadsorbeert lysaat in vergelijking met geadsorbede FBS of plasma en geen vooraf geadsorbete proteïne (media) (Figuur 4). TLR liganden synthetische triacylated lipopeptide (Pam3CSK4, TLR2 ligand) en lipopolysaccharide (LPS, TLR4 ligand) werden opgenomen als positieve controles om het antilichaam of de remmer te bevestigen en de test werkte goed. TLR2 neutralisatie had een merkbaar sterkere reductie in NF-кB/AP-1 respons van Reporter macrofagen om lysaat te adsorderen vergeleken met TLR4 remming. Ook kleine hoeveelheden lysaat verdund in serum (gebaseerd op totaal eiwit) induceerde significant verhoogde NF-кB/AP-1 respons in vergelijking met serum alleen, met de laagste effectieve verdunning afhankelijk van het polymeer oppervlak (Figuur 5). Deze resultaten tonen de potentie van de geadsorbeende lysaat-afgeleide moleculen op inducerende TLR-afhankelijke NF-кB/AP-1 activiteit in reporter macrofagen op een verscheidenheid aan polymere oppervlakken.

Figure 1
Figuur 1: methoden en resultaten voor de alkalische fosfatasetest van NF-кB/AP-1 reporter macrofagen op TCPS, PMMA, PDMS en fPTFE. (A) diagram van de workflow voor de verslaggever macrofaag alkalische fosfatase assay. B) Western Blot van lysaat die de aanwezigheid van vochtige soorten HMGB1 en HSP60 bevestigt, met β-actin als laad controle. C) NF-кb/AP-1-activiteit (vertegenwoordigd door de extinctie) van verslaggever macrofagen gekweekt op media (negatieve controle), 10% FBS, lysate en PAM3CSK4 (TLR2 ligand, positieve controle) voor 20 h. gegevens toont de resultaten van één experiment en is representatief voor de resultaten van ten minste 2 afzonderlijke experimenten, weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Elk experiment gebruikt n = 3 afzonderlijke putjes per aandoening, en elk putje werd in tweevoud voor de enzymatische assay geplateerd. Geanalyseerd met behulp van One-way ANOVA en Tukey post-hoc test. p < 0,001. Dit cijfer is aangepast met toestemming van McKiel en Fitzpatrick5. Copyright 2018 American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: optimalisatie van reinigingsmethoden voor oppervlakken met PMMA-en fPTFE-coating, beoordeeld met behulp van de water contacthoek (WCA). De metingen werden uitgevoerd op 2 afzonderlijke spots van minstens 3 afdek stroken. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. geanalyseerd met behulp van One-way ANOVA en Tukey post-hoc test. * p < 0,05. Dit cijfer is aangepast met toestemming van McKiel en Fitzpatrick5. Copyright 2018 American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: TLR-gemedieerde NF-кB/AP-1 activiteit (vertegenwoordigd door absorptie) van verslaggever macrofagen gekweekt op 10% FBS (controle), lysaat, en positieve controle voor 20 h. A) invloed van TLR2 neutralisatie op verslaggever macrofaag reacties op geadsorreven lysaat. Positieve controle is PAM (Pam3CSK4, TLR2 ligand). B) invloed van TLR4 remming op verslaggever macrofaag respons op geadsorreven lysaat. Positieve controle is LPS (TLR4 ligand). Gegevens toont de resultaten van een experiment en is representatief voor de resultaten van ten minste 2 afzonderlijke experimenten, weergegeven als gemiddelde ± SD. Elk experiment gebruikt n = 3 afzonderlijke putjes per aandoening, en elk putje werd in tweevoud voor de enzymatische assay geplateerd. Geanalyseerd met behulp van One-way ANOVA en Tukey post-hoc test. * * p < 0,01, * * * p < 0,001. Dit cijfer is aangepast met toestemming van McKiel en Fitzpatrick5. Copyright 2018 American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: NF-кB/AP-1 activiteit (vertegenwoordigd door de extinctie) van verslaggever macrofagen gekweekt op media (negatieve controle), 30 min en 24 h geadsorbeerd eiwit lagen, en Pam3CSK4 (positieve controle) op TCPS voor 20 h. Gegevens worden gecombineerd uit 3 afzonderlijke experimenten en weergegeven als gemiddelde ± SD. Elk experiment gebruikt n = 3 afzonderlijke putjes per aandoening, en elk putje werd in tweevoud voor de enzymatische assay (d.w.z. n = 9 niet-onafhankelijke celkweek putten en n = 18 niet-onafhankelijke enzymatische assay putten). Geanalyseerd met behulp van One-way ANOVA en Tukey post-hoc test. p < 0,001. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: verslaggever macrofaag NF-кb/AP-1 activiteit (vertegenwoordigd door absorptie) na 20 h in reactie op verdunningen van lysaat in FBS (totaal eiwit = 280 μg/goed) geadsorbeenteerd aan polymeer oppervlakken gedurende 30 minuten. (A) tcp's. B) PMMA. (C) pdm's. D) fptfe. Gegevens toont de resultaten van een experiment en is representatief voor de resultaten van ten minste 2 afzonderlijke experimenten, weergegeven als gemiddelde ± SD. Elk experiment gebruikt n = 3 afzonderlijke putjes per aandoening, en elk putje werd in tweevoud voor de enzymatische assay geplateerd. Geanalyseerd met behulp van One-way ANOVA en Tukey post-hoc test. * p < 0,05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001. Dit cijfer is aangepast met toestemming van McKiel en Fitzpatrick5. Copyright 2018 American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Supplemental Figure 1
Aanvullend figuur 1: voorbeeld indelingen die worden gebruikt voor NF-кb/AP-1 reporter macrofaag celcultuurassay in 8-kamer-en 48-goed-plaat formaten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een primaire focus van ons lab is de gastheer reactie op solide biomateriaal weke delen implantaten, en in het bijzonder hoe de cellulaire schade opgelopen tijdens de implantatie procedure invloed op de reactie van de gastheer. Het hier gepresenteerde werk beschrijft voorbereidende experimenten met behulp van een verslaggever macrofaag cellijn en in vitro-gegenereerd vocht-bevattende cellulair lysaat, om de invloed te onderzoeken van moleculen die vrijkomen tijdens cellulaire schade (d.w.z. van de implantatie operatie) op macrofaag reacties op biomaterialen. Fibroblast Cell lysaat werd gebruikt om de cellulaire schade te modelleren en het vrijkomen van Damps als gevolg van biomateriale plaatsing. Fibroblasten werden gekozen om het lysaat te maken vanwege de prevalentie van fibroblasten in zacht weefsel, evenals hun vermogen om een verscheidenheid van extracellulaire matrix (ECM) eiwitten, waaronder fibronectin18, te scheiden. Bevriezen-ontdooien fietsen werd gekozen als de methode van lysis om zowel intracellulaire als ECM-afgeleide DAMPs te produceren, vergelijkbaar met wat aanwezig zou zijn in de implantaat omgeving. Proteaseremmers werden niet gebruikt om dit lysaat te maken. Hoewel ongecontroleerde cellysis, zoals bevriezen-ontdooien, kan resulteren in het vrijkomen van proteasen die DAMPs kunnen degraderen, zouden deze enzymen waarschijnlijk ook aanwezig zijn in de omgeving van het biomateriaal implantaat wanneer cellen tijdens de implantatie procedure beschadigd raken. De aanwezigheid van DAMPs in het complexe molecuul mengsel van het lysaat werd bevestigd door Western Blot (Figuur 1B; HMGB1 en HSP60) en SEAP reporter assay (Figuur 1C; NF-кB/AP-1 activiteit in reactie op geadsorbede lysaat). We hebben ook assays uitgevoerd waar lysaat werd verdund in FBS op basis van de totale eiwitconcentratie en geadsorbeerd op celkweek oppervlakken (Figuur 5) om de complexiteit van de implantaat omgeving beter weer te geven, omdat het een overvloed aan bloed eiwitten en Damps6zal bevatten. Reporter macrofaag NF-кb/AP-1 activiteit bleef significant verhoogd op geadsorbeerde lagen van lysaat verdund in FBS, en de laagste verdunning om aanzienlijke activering te bereiken was afhankelijk van het oppervlak, variërend van 0,1% (TCPS) tot 10% (PDMS en fptfe).

De polymeren PMMA, PDMS en PTFE werden voor dit werk gekozen omdat ze niet afbreekbare zijn en veelvuldig in de literatuur zijn gebruikt om de eiwit adsorptie en macrofaag respons op biomaterialen19,20,21,22,23,24,25te beoordelen. TCPS werd ook gebruikt voor de vergelijking, omdat het een gemeenschappelijk substraat gebruikt voor in vitro macrofaag en TLR signalering werk21,26,27,28. De materialen die in ons werk worden gebruikt, zijn representatieve voorbeelden van niet-afbreekbare, vaste biomaterialen. Echter, veel andere materialen kunnen worden gebruikt met dit model, op voorwaarde dat het materiaal kan worden gecoat op celkweek platen of Microscoop dia's en goed ontsmet. De NF-κb/AP-1 reporter macrofaag cellijn werd geselecteerd voor deze in vitro model omdat het maakt snelle, indirecte meting van NF-κb/AP-1 activiteit via de NF-κb/AP-1 induceerbare cytochromen expressie van seap. NF-κB/AP-1-reporter macrofagen vereisen het gebruik van phleomycine D1 in de cultuur media als een selectief antibioticum om ervoor te zorgen dat alleen cellen met het NF-кB/AP-1-induceerbaar SEAP-gen aanwezig zijn29. Voor de alkalische fosfatasetest is het van cruciaal belang om HI-FBS in de celkweek media te gebruiken om mogelijke valse positieve resultaten te voorkomen die worden gegenereerd door alkalische fosfatasen in het serum. Ons onderzoek tot op heden suggereert dat FBS-geadsoroverde oppervlakken geen detecteerbaar vals-positief resultaat genereren, waarschijnlijk omdat de serum moleculen sterk worden geadsorveerd aan het cultuur oppervlak en niet vrijkomen in het supernatant. Het cultuur tijdpunt voor de reporter macrofagen (20 h), het incubatie tijdpunt (2,5 uur) en de absorptie lengte van de extinctie (635 nm) voor de alkalische fosfatasetest werden geoptimaliseerd met dit systeem om te zorgen voor robuuste en reproduceerbare metingen voor alle omstandigheden.

Voor dit werk werd een initiële proteïne adsorptie tijdpunt van 30 min gekozen vanwege het gemeenschappelijk gebruik in eiwit adsorptie literatuur (Figuur 1C)30,31,32,33,34. We hebben echter ook langere adsorptie tijden onderzocht (d.w.z. 60 min en 24 uur, Figuur 4) om beter de geadsorbede proteïne laag te vertegenwoordigen waarmee macrofagen in vivo zouden interageren, wat waarschijnlijk 4 − 24 h zal optreden na implantatie1. Er is aangetoond dat de meerderheid van de eiwit adsorptie en de uitwisseling plaatsvindt in de eerste 60 min van de blootstelling aan een oppervlakte26,35,36, daarom kan een adsorptie tijd van 60 min een relevanter tijdstip zijn. We zijn ook verhuisd van het gebruik van FBS als een negatieve controle op de aanwezigheid van DAMPs in de geadsorbeerd eiwit laag aan commerciële muis plasma. De reden voor het gebruik van plasma in plaats van serum is dat plasmaproteïnen bekend zijn bij het spelen van belangrijke rollen in eiwit adsorptie en macrofaag respons1, en dat plasma een betere representatie van de eiwitten in de wondomgeving biedt. Plasma dat wordt gebruikt in eiwit adsorptie experimenten wordt vaak bereid als een 1 − 10% verdunning26,36,37, die ons gebruik van 10% plasma motiveerde. Humaan plasma wordt vaak gebruikt26,36, omdat het gemakkelijker te verkrijgen in grote hoeveelheden en meer klinisch relevant, in vergelijking met muis plasma. Echter, we kozen voor het gebruik van commerciële muis plasma in dit model om de soorten van de eiwit oplossingen consistent te houden met die van de reporter cellen.

Het gebruik van de reporter macrofaag cellijn introduceerde enkele beperkingen binnen de studie. Ten eerste heeft het gebruik van een muriene leukemische macrofaag cellijn inherente beperkingen, omdat het fenotype en het gedrag kunnen variëren van primaire macrofaag culturen. Hoewel deze beperking zal worden aangepakt in toekomstig werk met behulp van primaire macrofagen, werd de cellijn van ouderlijk macrofaag getoond om de macrofagen van muis beenmerg-afgeleide in termen van hun celoppervlak receptoren en respons op microbiële liganden voor tlrs 2, 3 en 438nauwkeurig na te bootsen. Bovendien, de NF-κB/AP-1 reporter macrofagen leverde vergelijkbare resultaten in reactie op HMGB1 en LPS stimulatie in vergelijking met peritoneale primaire Murine macrofagen39. Opgemerkt moet worden dat de NF-κB/AP-1 reporter macrofagen, en hun ouderlijke stam, niet Express TLR540. Onderzoekers hebben aangetoond dat HMGB1 in staat was om NF-κB-transcriptiefactoren te activeren via de TLR5-signalerings trajecten in HEK-293-cellen die stabiel met humane TLR541werden gefuteerd. Daarom werd de bijdrage van HMGB1-TLR5 signalering aan de totale NF-κB-activiteit op lysaat gecoate oppervlakken in dit model verwaarloosd. Bovendien uiten de reporter macrofagen en hun ouderlijke stam niet het eiwit van de ASC-adapter en vormen zij bijgevolg niet de meeste ontstekings masten en kunnen ze inactieve IL-1β of inactieve IL-18 niet verwerken tot hun volwassen vormen42. Daarom houdt het model dat we hebben gebruikt geen rekening met de bijdrage van ASC-afhankelijke ontstekings activiteit en daaropvolgende Signa Il-1β-en Il-18-signalering in macrofaag reacties op lysaat-geadsorbeende oppervlakken. Bijgevolg is deze test bedoeld als een voorlopig onderzoek van TLR-afhankelijke NF-κB-activering, en het daaropvolgende onderzoek met behulp van primaire macrofagen wordt aanbevolen om een vollediger en representatief inzicht te bieden in macrofaag-activering en fenotype op materiële oppervlakken die van belang zijn.

De alkalische fosfatasetest meet indirect de NF-кB/AP-1 activiteit van de reporter macrofagen. Echter, er zijn vele signalering trajecten anders dan Tlr's die betrekking hebben op NF-кB/AP-1 (bv, interleukine-1-receptor [IL-1R]43 en tumor necrose factor receptor [TNFR]44). Daarom was het noodzakelijk om de bijdrage van TLR2 en TLR4 signalering in de toegenomen NF-кB/AP-1-respons op lysaat-geadsorpete oppervlakken te beoordelen met behulp van remming van de assays (Figuur 3). De reden voor het selecteren van deze twee oppervlakte-Tlr's was dat ten minste 23 DAMPs die zijn aangetoond om te signaleer via TLR2 en TLR445, met inbegrip van de goed gekarakteriseerde HMGB1, en beide receptoren worden uitgedrukt op het celoppervlak en kunnen rechtstreeks communiceren met het biomateriaal oppervlak6. De assays TLR2 en TLR4 remming toonden aan dat wanneer TLR2 of TLR4 signalering werden geblokkeerd, de NF-кB/AP-1 reactie van de reporter macrofagen aan geadsorreven lysaat werd verlaagd, wat aangeeft dat beide trajecten betrokken zijn. Er was echter een merkbaar grotere afname van de NF-кB/AP-1-activiteit toen TLR2-signalering werd geneutraliseerd, wat suggereert dat TLR2 een primaire rol kan spelen in de reactie van Reporter macrofagen aan geadsorbeerde lysaat. We erkennen dat er mogelijk een aantal off-target remming met de TLR signalering traject neutraliserende antilichamen en remmers. Een neutraliserend antilichaam werd gebruikt voor de remming van het TLR2-traject, omdat er op het moment van dit werk geen in de handel verkrijgbare TLR2-remmer moleculen waren.

De hier gepresenteerde methoden gebruiken lysate, als een complexe bron van DAMPs, en NF-κB/AP-1 reporter macrofagen als een in vitro model voor macrofaag reacties op DAMPs en andere eiwitten geadsorbeert aan polymere biomaterialen (Figuur 1). We anticiperen ons protocol kan worden gebruikt om snel te analyseren NF-κB/AP-1 reacties en upstream TLR signalering van Reporter macrofagen naar een verscheidenheid van materialen (met inbegrip van afbreekbare materialen, poreuze steigers of hydrogels) en geadsorpeerd eiwit lagen (Figuur 3). Het gebruik van poreuze materialen en hydrogels zal echter de complexiteit binnen het systeem introduceren, omdat het een uitdaging kan zijn om onderscheid te maken tussen geadsorverde moleculen en geoefende moleculen. We verwachten ook dat dit protocol gemakkelijk kan worden aangepast om de bijdrage van een ander signalerings traject stroomopwaarts van NF-кB/AP-1 (bijv. lectine receptoren46 en nucleotide-bindend oligomerisatie domein (NOD)-achtige receptoren47) te onderzoeken met de juiste remmers. Bovendien, de NF-κB/AP-1 reactie van Reporter macrofagen kan worden vergeleken tussen verschillende materialen, mits reacties worden genormaliseerd naar Baseline cel activiteit (dat wil zeggen, cellen in media op elk oppervlak met geen vooraf geadsorbeend eiwit) en alle materialen hebben ondetecteerbaar endotoxine niveaus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs erkennen de operationele financiering van Canadian Institutes of Health Research project (PTJ 162251), Queen's University Senate Advisory Research Committee en Infrastructure support van de Canadian Foundation for Innovation John Evan's Leadership Fund (project 34137) en het Ontario Research Fund van het ministerie van onderzoek en innovatie (project 34137). L.A.M. werd gesteund door een Queen's University R. Samuel McLaughlin Fellowship, een natuurwetenschappen en ingenieurs Onderzoekraad van Canada Canadian Graduate beurs Master's Award en een Ontario Graduate beurs. De auteurs willen Dr. Myron szewczuk bedanken voor zijn genereuze gave van de NF-κb/AP-1 reporter macrofaag Cell line en Drs. Michael Blennerhassett en Sandra lourenssen voor het gebruik van hun gel Imaging systeem en Plate Reader.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture reagents
anti-mouse/human CD282 (TLR2) Biolegend 121802
CLI-095 (TLR4 inhibitor) Invivogen TLRL-CLI95
C57 complement plasma K2 EDTA 10ml, innovative grade US origin InnovativeResearch IGMSC57-K2 EDTA-Compl-10ml Mouse plasma
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Sigma Aldrich D6429-500ML
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Fisher Scientific 14190250 No calcium, no magnesium
Fetal bovine serum (FBS), research grade Wisent 98150
LPS-EK Invivogen TLRL-EKLPS Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12
NIH/3T3 fibroblasts ATCC CRL-1658
Pam3CSK4 Invivogen tlrl-pms Synthetic triacylated lipopeptide - TLR1/2 ligand
Penicillin/streptomycin Sigma Aldrich P4333-100ML
Plasmocin Invivogen ANT-MPP Mycoplasma elimination reagent
RAW-Blue cells Invivogen raw-sp NF-κB/AP-1 reporter macrophage cell line
Trypan blue solution, 0.4% Fisher Scientific 15250061
TrypLE express enzyme (1X) Fisher Scientific 12604021 animal origin-free recombinant cell dissociation enzyme
Zeocin Invivogen ANT-ZN-1
Kits and assays
ELISA precoated plates, mouse IL-6 Biolegend B213022
ELISA precoated plates, mouse TNF-α Biolegend B220233
Endotoxin (Escherichia coli) - Control standard endotoxin (CSE) Associates of Cape Cope Inc. E0005-5 Endotoxin for standard curve in chromogenic endotoxin assay
LAL water, 100 mL Associates of Cape Cope Inc. WP1001 Used with chromogenic endotoxin assay
Micro BCA protein assay Fisher Scientific PI23235
Limulus amebocyte lysate (LAL) Pyrochrome endotoxin test kit Associates of Cape Cope Inc. C1500-5 Chromogenic endotoxin assay reagent
QUANTI-Blue alkaline phosphatase detection medium Invivogen rep-qb2 Alkaline phosphatase assay to indirectly measure NF-κB/AP-1 activity
Polymeric coating reagents
Chloroform, anhydrous Sigma Aldrich 288306-1L
Ethyl alcohol anhydrous Commercial Alcohols P006EAAN Sigma: Reagent alcohol, anhydrous, 676829-1L
Straight tapered fine tip forceps Fisher Scientific 16-100-113
Fluorinert FC-40 solvent Sigma Aldrich F9755-100ML Fluorinated solvent for fPTFE
Cell culture grade water (endotoxin-free) Fisher Scientific SH30529LS
Poly(methyl methacrylate) (PMMA) Sigma Aldrich 182230-25G
Sylgard 184 elastomer kit Fisher Scientific 50822180
Teflon-AF (fPTFE) Sigma Aldrich 469610-1G Poly[4,5-difluoro-2,2-bis(trifluoromethyl)-1,3-dioxole-co-tetrafluoroethylene]
Consumables
Adhesive plate seals Fisher Scientific AB-0580
Axygen microtubes, 1.5 mL Fisher Scientific 14-222-155
Borosilicate glass scintillation vials, with white polypropylene caps Fisher Scientific 03-337-4
Clear PS 48-well plate Fisher Scientific 08-772-52
Clear TCPS 96-well plate Fisher Scientific 08-772-2C
Clear TCPS 48-well plate Fisher Scientific 08-772-1C
Cover glasses, circles Fisher Scientific 12-545-81
Falcon tissue culture treated flasks, T25 Fisher Scientific 10-126-10
sticky-Slide 8 Well Ibidi 80828
Superfrost microscope slides Fisher Scientific 12-550-15
Tissue culture treated flasks, T150 Fisher Scientific 08-772-48

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Seminars in Immunology. 20 (2), 86-100 (2008).
  2. Anderson, J. M., Miller, K. M. Biomaterial biocompatibility and the macrophage. Biomaterials. 5 (1), 5-10 (1984).
  3. Collier, T. O., Anderson, J. M. Protein and surface effects on monocyte and macrophage adhesion, maturation, and survival. Journal of Biomedical Materials Research. 60 (3), 487-496 (2002).
  4. Bianchi, M. E. DAMPs, PAMPs and alarmins: all we need to know about danger. Journal of Leukocyte Biology. 81 (1), 1-5 (2007).
  5. McKiel, L. A., Fitzpatrick, L. E. Toll-like Receptor 2-Dependent NF-κB/AP-1 Activation by Damage-Associated Molecular Patterns Adsorbed on Polymeric Surfaces. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3792-3801 (2018).
  6. Babensee, J. E. Interaction of dendritic cells with biomaterials. Seminars in Immunology. 20 (2), 101-108 (2008).
  7. Sintes, J., Romero, X., de Salort, J., Terhorst, C., Engel, P. Mouse CD84 is a pan-leukocyte cell-surface molecule that modulates LPS-induced cytokine secretion by macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 88 (4), 687-697 (2010).
  8. Tom, J. K., Mancini, R. J., Esser-Kahn, A. P. Covalent modification of cell surfaces with TLR agonists improves and directs immune stimulation. Chemical Communications. 49 (83), 9618-9620 (2013).
  9. Abdulkhalek, S., et al. Neu1 sialidase and matrix metalloproteinase-9 cross-talk is essential for toll-like receptor activation and cellular signaling. Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36532-36549 (2011).
  10. Gorbet, M. B., Sefton, M. V. Endotoxin: The uninvited guest. Biomaterials. 26 (34), 6811-6817 (2005).
  11. Xing, Z., Pabst, M. J., Hasty, K. A., Smith, R. A. Accumulation of LPS by polyethylene particles decreases bone attachment to implants. Journal of Orthopaedic Research. 24 (5), 959-966 (2006).
  12. Ding, H., et al. Comparison of the cytotoxic and inflammatory responses of titanium particles with different methods for endotoxin removal in RAW264.7 macrophages. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 23 (4), 1055-1062 (2012).
  13. Hoogenboom, R., Becer, C. R., Guerrero-Sanchez, C., Hoeppener, S., Schubert, U. S. Solubility and thermoresponsiveness of PMMA in alcohol-water solvent mixtures. Australian Journal of Chemistry. 63 (8), 1173-1178 (2010).
  14. Efimenko, K., Wallace, W. E., Genzer, J. Surface modification of Sylgard-184 poly(dimethyl siloxane) networks by ultraviolet and ultraviolet/ozone treatment. Journal of Colloid and Interface Science. 254 (2), 306-315 (2002).
  15. Godek, M. L., Sampson, J. A., Duchsherer, N. L., McElwee, Q., Grainger, D. W. Rho GTPase protein expression and activation in murine monocytes/macrophages is not modulated by model biomaterial surfaces in serum-containing in vitro cultures. Journal of Biomaterials Science. Polymer Edition. 17 (10), 1141-1158 (2006).
  16. Park, J. S., et al. Involvement of Toll-like Receptors 2 and 4 in Cellular Activation by High Mobility Group Box 1 Protein. Journal of Biological Chemistry. 279 (9), 7370-7377 (2004).
  17. Ohashi, K., Burkart, V., Flohé, S., Kolb, H. Cutting Edge: Heat Shock Protein 60 Is a Putative Endogenous Ligand of the Toll-Like Receptor-4 Complex. The Journal of Immunology. 164 (2), 558-561 (2000).
  18. Wong, T., McGrath, J. A., Navsaria, H. The role of fibroblasts in tissue engineering and regeneration. British Journal of Dermatology. 156 (6), 1149-1155 (2007).
  19. van Wachem, P. B., et al. The influence of protein adsorption on interactions of cultured human endothelial cells with polymers. Journal of Biomedical Materials Research. 21 (6), 701-718 (1987).
  20. Miller, K. M., Anderson, J. M. Human monocyte/macrophage activation and interleukin 1 generation by biomedical polymers. Journal of Biomedical Materials Research. 22 (8), 713-731 (1988).
  21. Bonfield, T. L., Colton, E., Anderson, J. M. Plasma protein adsorbed biomedical polymers: Activation of human monocytes and induction of interleukin 1. Journal of Biomedical Materials Research. 23 (6), 535-548 (1989).
  22. González, O., Smith, R. L., Goodman, S. B. Effect of size, concentration, surface area, and volume of polymethylmethacrylate particles on human macrophages in vitro. Journal of Biomedical Materials Research. 30 (4), 463-473 (1996).
  23. Anderson, J. M., et al. Protein adsorption and macrophage activation on polydimethylsiloxane and silicone rubber. Journal of Biomaterials Science. Polymer Edition. 7 (2), 159-169 (1995).
  24. Lord, M. S., Foss, M., Besenbacher, F. Influence of nanoscale surface topography on protein adsorption and cellular response. Nano Today. 5 (1), 66-78 (2010).
  25. Chen, S., et al. Characterization of topographical effects on macrophage behavior in a foreign body response model. Biomaterials. 31 (13), 3479-3491 (2010).
  26. Shen, M., Horbett, T. A. The effects of surface chemistry and adsorbed proteins on monocyte/macrophage adhesion to chemically modified polystyrene surfaces. Journal of Biomedical Materials Research. 57 (3), 336-345 (2001).
  27. Love, R. J., Jones, K. S. The recognition of biomaterials: Pattern recognition of medical polymers and their adsorbed biomolecules. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101 (9), 2740-2752 (2013).
  28. McNally, A. K., Anderson, J. M. Phenotypic expression in human monocyte-derived interleukin-4-induced foreign body giant cells and macrophages in vitro: Dependence on material surface properties. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (4), 1380-1390 (2015).
  29. Gambhir, V., et al. The TLR2 agonists lipoteichoic acid and Pam3CSK4 induce greater pro-inflammatory responses than inactivated Mycobacterium butyricum. Cellular Immunology. 280 (1), 101-107 (2012).
  30. Suzuki, O., Yagishita, H., Yamazaki, M., Aoba, T. Adsorption of Bovine Serum Albumin onto Octacalcium Phosphate and its Hydrolyzates. Cells and Materials. 5 (1), 45-54 (1995).
  31. Johnston, R. L., Spalton, D. J., Hussain, A., Marshall, J. In vitro protein adsorption to 2 intraocular lens materials. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 25 (8), 1109-1115 (1999).
  32. Jin, J., Jiang, W., Yin, J., Ji, X., Stagnaro, P. Plasma proteins adsorption mechanism on polyethylene-grafted poly(ethylene glycol) surface by quartz crystal microbalance with dissipation. Langmuir. 29 (22), 6624-6633 (2013).
  33. Swartzlander, M. D., et al. Linking the foreign body response and protein adsorption to PEG-based hydrogels using proteomics. Biomaterials. 41, 26-36 (2015).
  34. Chamberlain, M. D., et al. Unbiased phosphoproteomic method identifies the initial effects of a methacrylic acid copolymer on macrophages. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (34), 10673-10678 (2015).
  35. Dillman, W. J., Miller, I. F. On the adsorption of serum proteins on polymer membrane surfaces. Journal of Colloid And Interface Science. 44 (2), 221-241 (1973).
  36. Ishihara, K., Ziats, N. P., Tierney, B. P., Nakabayashi, N., Anderson, J. M. Protein adsorption from human plasma is reduced on phospholipid polymers. Journal of Biomedical Materials Research. 25 (11), 1397-1407 (1991).
  37. Warkentin, P., Wälivaara, B., Lundström, I., Tengvall, P. Differential surface binding of albumin, immunoglobulin G and fibrinogen. Biomaterials. 15 (10), 786-795 (1994).
  38. Berghaus, L. J., et al. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors 2, 3, and 4. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 33 (5), 443-454 (2010).
  39. Zhang, Y., Karki, R., Igwe, O. J. Toll-like receptor 4 signaling: A common pathway for interactions between prooxidants and extracellular disulfide high mobility group box 1 (HMGB1) protein-coupled activation. Biochemical Pharmacology. 98 (1), 132-143 (2015).
  40. Mizel, S. B., Honko, A. N., Moors, M. A., Smith, P. S., West, A. P. Induction of macrophage nitric oxide production by Gram-negative flagellin involves signaling via heteromeric Toll-like receptor 5/Toll-like receptor 4 complexes. Journal of Immunology. 170 (12), 6217-6223 (2003).
  41. Das, N., et al. HMGB1 Activates Proinflammatory Signaling via TLR5 Leading to Allodynia. Cell Reports. 17 (4), 1128-1140 (2016).
  42. Pelegrin, P., Barroso-Gutierrez, C., Surprenant, A. P2X7 Receptor Differentially Couples to Distinct Release Pathways for IL-1β in Mouse Macrophage. The Journal of Immunology. 180 (11), 7147-7157 (2008).
  43. Tak, P. P., Firestein, G. S. NF-κB: A key role in inflammatory diseases. Journal of Clinical Investigation. 107 (1), 7-11 (2001).
  44. Ashkenazi, A., Dixit, V. M. Death receptors: signaling and modulation. Science. 281 (5381), 1305-1308 (1998).
  45. Erridge, C. Endogenous ligands of TLR2 and TLR4: agonists or assistants. Journal of Leukocyte Biology. 87 (6), 989-999 (2010).
  46. Feng, Y., et al. A macrophage-activating, injectable hydrogel to sequester endogenous growth factors for in situ angiogenesis. Biomaterials. 134, 128-142 (2017).
  47. Lonez, C., et al. Cationic lipid nanocarriers activate Toll-like receptor 2 and NLRP3 inflammasome pathways. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 10 (4), 775-782 (2014).

Tags

Biotechniek afgifte 155 eiwit adsorptie vreemd lichaam reactie macrofaag tol-achtige receptor ontsteking polymeer biomaterial transcriptiefactor schade-geassocieerde moleculaire patronen celmateriaalinteracties
Een macrophage reporter Celassay om Tolachtige receptor-gemedieerde NF-kB/AP-1-signalering op geadsorbeerde proteïne lagen op polymere oppervlakken te onderzoeken
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McKiel, L. A., Woodhouse, K. A.,… More

McKiel, L. A., Woodhouse, K. A., Fitzpatrick, L. E. A Macrophage Reporter Cell Assay to Examine Toll-Like Receptor-Mediated NF-kB/AP-1 Signaling on Adsorbed Protein Layers on Polymeric Surfaces. J. Vis. Exp. (155), e60317, doi:10.3791/60317 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter