Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Polimerik Yüzeylerde Adsorbe Protein Katmanlarında Sinyalizasyonu NF-kB/AP-1 Sinyallerini İnceleyecek Bir Makrofaj Muhabiri Hücre Tetkik

Published: January 7, 2020 doi: 10.3791/60317
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemical Engineering, Queen's University

Summary

Bu protokol, araştırmacılara, biyomateryal implant mikroçevresini modelleyen çeşitli polimerik yüzeylere ve adsordi protein katmanlarına yanıt olarak bir murine makrofaj hücre hattında TLR bağımlı NF-кB/AP-1 transkripsiyon faktörü aktivitesini ölçmenin hızlı ve dolaylı bir yöntemini sağlar.

Abstract

Yabancı cisim reaksiyonu olarak bilinen implante biyomateryale verilen kalıcı inflamatuar konak yanıtı, biyomedikal cihazların ve doku mühendisliği yapılarının geliştirilmesi ve uygulanmasında önemli bir sorundur. Makrofajlar, doğuştan gelen bir bağışıklık hücresi, cihazın ömrü boyunca implant yerinde kalır, çünkü yabancı cisim reaksiyonunun önemli oyuncuları, ve yaygın olarak bu zararlı konak yanıtı bir anlayış kazanmak için çalışılır. Birçok biyomalzeme araştırmacısı, implante edilmiş malzemeler üzerindeki adsord protein katmanlarının makrofaj davranışını etkilediğini ve daha sonra ev sahibi nin tepkisini etkilediğini göstermiştir. Bu yazıda yöntemler makrofaj yanıtları değerlendirmek için polimer biyomalzeme yüzeylerde hücresel hasar molekülleri içeren adsordi protein katmanları kullanarak bir in vitro modeli açıklar. Bir NF-кB/AP-1 muhabiri makrofaj hücre hattı ve ilişkili kolorimetrik alkalen fosfataz testi, in vivo'da biyomateryal yüzeylerde oluşan karmaşık adsordit protein tabakalarının bir modeli olarak, kan proteinleri ve hasarla ilişkili moleküler desenler içeren karmaşık adsorditprotein katmanlarına yanıt olarak NF-кB/AP-1 transkripsiyon faktörü aktivitesini dolaylı olarak incelemek için hızlı bir yöntem olarak kullanılmıştır.

Introduction

Yabancı cisim reaksiyonu (FBR), implante edilmiş bir malzemenin veya cihazın (örneğin, ilaç dağıtım cihazları, biyosensörler) inflamatuar arabulucuların kalıcı salınımı yoluyla ve implante edilen malzeme ile çevre dokuarasındakientegrasyonu engelleyerek performansını olumsuz etkilenebilen kronik bir konak tepkisidir 1 . Bu doğuştan gelen immün yanıt implantasyon prosedürü ile başlatılır veimplant1 etrafında doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ve fibröz kapsül oluşumu uzun süreli varlığı ile karakterizedir. Malzeme ana bilgisayar yanıtları bağlamında, makrofaj-malzeme etkileşimleri ana yanıtın ilerlemesi ve FBR1gelişimi üzerinde önemli bir etkiye sahiptir. Makrofajlar, dokuda yerleşik makrofaj popülasyonlarından veya monosit kaynaklı makrofajlar olarak kandan implant bölgesine alınan çeşitli doğuştan gelen bağışıklık hücresi popülasyonlarıdır. İmplant tan kısa bir süre sonra implant yerinde birikmeye başlarlar ve birkaç gün içinde implant mikroortamında baskın hücre popülasyonu haline gelirler. Malzeme-yapışkan makrofajlar, makrofaj füzyonu ile oluşan yabancı cisim dev hücreleri (FBGC) ile birlikte,implantınömrü boyunca malzeme yüzeyinde devam edebilir 2,3. Sonuç olarak, makrofajlar FBR karakteristik adımları düzenleyen rolleri nedeniyle yabancı cisim yanıtı önemli oyuncular olarak kabul edilir: akut inflamatuar yanıt, doku remodeling, ve fibrotik doku oluşumu1.

Toll benzeri reseptörler (TLR) birçok bağışıklık hücreleri tarafından ifade edilen desen tanıma reseptörleri bir aile, makrofajlar da dahil olmak üzere, ve inflamasyon ve yara iyileşmesinde önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Patojen kaynaklı ligandlara ek olarak, TLR'ler hücre nekrozu sırasında salınan hasarla ilişkili moleküler desenler (DAMP) olarak bilinen endojen molekülleri bağlayabiliyor ve proinflamatuar sitokin üretimiyle sonuçlanan inflamatuar sinyal yollarını aktive edebiliyoruz4. Biz ve diğerleri, yumuşak doku biyomateryal implantasyon prosedürleri sırasında maruz kalınan hasar, daha sonra kan proteinlerine ek olarak biyomalzeme yüzeylere adsorb ve sonraki hücre-malzeme etkileşimlerimodüle5,6barajlar serbest önerdi . Makrofajlar implant üzerindeki adsorbe protein tabakası ile etkileşime girdiğinde, yüzey TLR'leri adsorbe EDILEN APM'leri tanıyabilir ve proinflamatuar sinyal basamaklarını aktive ederek NF-κB ve AP-1 transkripsiyon faktörü aktivasyonuna ve proinflamatuar sitokin üretimine yol açabilir. Daha önce göstermiştir ki, mürin makrofajlar NF-κB/AP-1 aktivitesini ve tümör nekroz faktörα (TNF-α, proinflamatuar sitokin) salgılayıcı, sadece adsorbe serum veya plazma içeren yüzeylere göre çeşitli polimerik yüzeylerde DAMP içeren adsordi protein katmanlarına yanıt olarak salgılanır (yani, hiçbir DAMP mevcut) ve bu yanıt büyük ölçüde TLR2 aracılık edilir, TLR4 daha az bir rol oynar iken5.

Bu protokolde kullanılan NF-κB/AP-1 muhabiri makrofaj hücre hattı(Tablo)makrofajlarda göreceli NF-κB ve AP-1 aktivitesini ölçmek için uygun bir yöntemdir5,7,8. TLR yol inhibitörleri ile birlikte, Bu hücre hattı TLR aktivasyonu ve uyaranların çeşitli yanıt olarak inflamasyon rolünü araştırmak için yararlı bir araçtır5,7,8. Muhabir hücreler, NF-κB ve AP-1 transkripsiyon faktörü aktivasyonu9üzerine salgılanan embriyonik alkali fosfataz (SEAP) üretebilen modifiye edilmiş fare makrofaj benzeri bir hücre hattıdır. Kolorimetrik enzimatik alkalen fosfataz testi(Malzeme Tablosu)daha sonra NF-κB/AP-1 aktivitesinin dolaylı bir ölçüsü olarak SEAP ekspresyonunun göreli miktarlarını ölçmek için kullanılabilir. NF-κB ve AP-1 birçok hücre sinyal yollarının aşağı olduğu için, belirli TLR'leri (örneğin, TLR2) veya TLR adaptör moleküllerini (örneğin, MyD88) hedefleyen antikorları ve inhibitörleri nötralize etmek belirli bir yolun rolünü doğrulamak için kullanılabilir. Bu makalede açıklanan metodoloji, implante biyomalzemelerin in vitro modeli olarak hem kan proteinleri hem de DAMP'lar içeren adsordi protein tabakaları içeren çeşitli polimerik yüzeylere, rürin makrofaj yanıtlarında TLR sinyalinin katkısını değerlendirmek için basit ve hızlı bir yaklaşım sunmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Medya ve Reaktif Hazırlama

  1. Fibroblast ortamı hazırlayın. 450 mL Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamını (DMEM), 50 mL fetal sığır serumunu (FBS) ve 5 mL penisilin/streptomisin'i birleştirin. 4 °C'de 3 aya kadar saklayın.
  2. 50 mL aliquots muhabir makrofaj büyüme medya hazırlayın. 45 mL DMEM, 5 mL FBS, 5 μg/mL mikoplazma eliminasyon reaktifi(Malzeme Tablosu)ve 200 μg/mL phleomisin D1(Malzeme Tablosu)birleştirin. 4 °C'de 3 aya kadar saklayın.
  3. 50 mL aliquots muhabir makrofaj tsay medya hazırlayın. 45 mL DMEM, 5 mL ısı inaktive FBS (HI-FBS), 5 g/mL mikoplazma eliminasyon reaktifi ve 200 μg/mL phleomisin D1'i birleştirin. 4 °C'de 3 aya kadar saklayın.

2. Kaplama Hücre Kültür Yüzeyleri Poli (metil metakrilat) ile

  1. 20 mg/mL 'de kloroformda (örneğin, 5 mL kloroformda 100 mg PMMA) 20 mL'lik bir cam sintilasyon şişesinde poli (metil metakrilat) (PMMA) çözün. Şişeye manyetik bir karıştırma çubuğu yerleştirin ve tüm katılar eriyene kadar en az 2 saat karıştırmaya izin verin.
    DİkKAT: Kloroform solunduğunda zararlıdır. PVA eldiven giyerken duman kaputunda çözücü kullandığınızdan emin olun.
  2. Pipet 400 μL PMMA çözeltisi bir spin coater bir borosilikat cam mikroskop slayt merkezine, ve 2 dakika için 3000 rpm spin. Tsurk için gerekli slayt sayısını hazırlayın, hem de su temas açısı ölçümü için 3−5 ekstra. Slaytları ileride kullanılmak üzere temiz bir kutuda (püskürtülür ve %70 etanol ile silinir) saklayın.
    NOT: Spin kaplama genellikle düz bir yüzeye ince, düzgün bir kaplama yatırmak için kullanılır. Bir spin kaplama yüzeye kaplama çözeltisi yaymak için santrifüj kuvvet kullanarak, yüksek hızlarda bir substrat döndürür.
    1. Cam yüzeyinin tamamen polimerle kaplandığından emin olmak için bir goniyometre ile ekstra kaplamalı kaydırakların yüzeyindeki iki rasgele pozisyonda su temas açısını ölçün (hücre kültürü için kullanılan slaytlar değil).
      NOT: Su temas açısı ölçümleri için sadece en yüksek saftaki su (örn. cam üçlü distile) kullanılmalıdır.
  3. Biyolojik güvenlik kabininde (BSC) steril forceps kullanarak ve aseptik tekniği takip ederek PMMA kaplı-slaytlar 8 odalı yapışkan kuyular takın. Güçlü bir şekilde bağlı olduğundan emin olmak için yapışkan kuyuların üstüne sıkıca bastırın. Mühür sabitlemek için bir gecede 37 °C'de bağlı yapışkan kuyularla kaydırakları kuluçkaya yatırın.
    1. Yapışkan kuyuların mührünü her kuyuya 200 μL hücre kültürü sınıfı (endotoksiniçermeyen) su ekleyerek test edin. 60 dakika oda sıcaklığında (RT) kuluçka ya da devam etmeden önce sızıntı olmadığından emin olun. PMMA kaplamasını bozmamaya dikkat edin, suyu aspire edin.
  4. Her kuyuya 300 μL endotoksinsiz su ekleyerek ve kalan çözücüleri çıkarmak için kullanmadan önce 1 saat (üç kez), 12 saat ve 24 saat kuluçkaya yatarak endotoksinsiz su yıkar.
  5. Hücre kültürü için kullanılacak slaytların endotoksin konsantrasyonu test edin. Her slaytTan birinde 200 μL endotoksiniçermeyen reaktif su(Malzeme Tablosu)1 saat boyunca inkübül, son nokta kromojenik endotoksin tonu(Malzeme Tablosu)kullanarak ekstredeki endotoksin konsantrasyonu ölçün.
    NOT: Aşağıdaki protokol, Malzeme Tablosu'ndalistelenen endotoksin test kitine özgüdür.
  6. Bu iş için pyrogen içermeyen (yani endotoksin içermeyen) sertifikalı sadece su ve sarf malzemelerini (örneğin, pipet uçları, mikrosantrifüj tüpleri ve kuyu plakaları) kullanın. Ayrıca, polimer kaplı yüzeylerin hazırlanmasında kullanılan herhangi bir cam,10kullanmadan önce kuru ısı sterilizasyonu (30 dk için 250 °C) kullanılarak depirojenize edilmelidir. Burada açıklandığı gibi ekstre çözeltisinde endotoksinölçümü, malzeme yüzeyinde endotoksinin aztahmin edilmesine neden olabilir11,12. Sonuç olarak, polimer kaplama protokolü geliştirilirken, kaplama işlemi sırasında endotoksin kaynağının sisteme yanlışlıkla girmemesini sağlamak için kaplamalı numuneyi içeren kuyuların içinde doğrudan endotoksin test reaksiyonu (örneğin, test numuneleri [reaktif su] veya başak kontrolleri için 2.5.4−2.5.6 adımları) gerçekleştirmesi önerilir.
    1. Tüm test örneklerini (yani, özler) ve endotoksin acentalarını RT'ye getirin. Kullanılmadığında tüm şişeleri parafin film ile kaplayın.
    2. Reaktif suda endotoksin standardının seri seyreltmesini gerçekleştirerek, testin alt sınırına kadar değişen 5−8 noktalı standart endotoksin standardı seyreltme eğrisi oluşturun.
    3. Test numunelerinde endotoksin testinin geliştirilmesi veya inhibisyonu için kontrol etmek için, kullanılmayan numune çözümünde bilinen miktarda endotoksinseyrelterek pozitif bir kontrol (ani kontrol veya çivili numune olarak da adlandırılır) hazırlayın.
      NOT: Pozitif kontrolün konsantrasyonu, standart eğrinin ortasındaki standart la aynı konsantrasyonda olmalıdır. Endotoksin ani sıçramasının kurtarılan miktarı (yani, pozitif kontrol konsantrasyonu eksi çivilenmemiş test numunesinin konsantrasyonu) endotoksin ani sıçramasının nominal konsantrasyonunun %50−200'ü içindeyse, çıkarma çözeltisi tetkikle önemli ölçüde engel olmadığı düşünülebilir.
    4. 96 kuyulu bir plakanın her kuyuya yinelenen veya üç aylık olarak 50 μL standartlar, numuneler veya başak kontrolleri ekleyin. Negatif kontrol olarak reaktif su kullanın.
    5. Her kuyuya 50°L kromojenik reaktif ekleyin. Tüm kuyulara hızlı bir şekilde reaktif ekleyin. Tüm kuyulara reaktif eklemek için gereken süreyi kaydetmek için bir zamanlayıcı kullanın. Plakayı yapışkan bir mühürle kaplayın ve 37 °C'de kuluçkaya yatırın (kuluçka süresi çok bağlıdır ve kromojenik reaktif kitinde yer alan Analiz Sertifikası'nda belirtilir). Alternatif olarak, tüm standart kuyularda renk değişimi gözlemlenene kadar kuluçka sırasında her 15 dakikada bir plakayı kontrol edin.
    6. Kuluçkadan sonra, reaksiyonu durdurmak için her kuyuya %50 asetik asit (kuyu başına %10 asetik asitin son konsantrasyonu) ekleyin. Kromojenik reaktif eklenince aynı sırada asetik asit ekleyin. 405 nm'de bir plaka okuyucu kullanarak plakanın emiciliğini okuyun. Sıvı aspire ve plaka atın.
      NOT: Asetik asit ilavesi, kromozomremi alan reaktifin (± 30 s) her birine eklenmesi yle aynı süreyi almalıdır.
  7. Ultraviyole (UV) hücre kültürü deneyleri öncesinde 30 dakika boyunca slaytlar sterilize.

3. Polidimethylsiloxane ile Kaplama Hücre Kültürü Yüzeyleri

  1. 10:1 ağırlık oranı (baz:kür ajan) bir polidimethylsiloxane (PDMS) elastomer karıştırın. Biyolojik bir güvenlik kabininde, pipet yaklaşık 10 mL polidimetilsiloksane baz steril bir tüp içine. Tüpü tartın ve %10 eklenene kadar yavaşça kür leme maddesi ekleyin.
    DİkKAT: İyi havalandırılan bir alanda PDMS reaktifleri kullanın ve güvenlik gözlüğü takarak göz temasından kaçının.
  2. Steril serolojik pipet ucu ile karıştırarak ve yukarı ve aşağı boru ile elastomer iyice karıştırın. 48 kuyulu bir plakanın her kuyuya yaklaşık 200 μL çözelti ekleyin. Elastomer çözeltisi ile kuyuların tam kapsama alanını sağlamak için kuyu plakasını yavaşça yatırın.
  3. 50 cmHg, 40 °C'de ayarlanmış bir vakum fırınına elastomerli kuyu plakasını yerleştirin. Diğer enkazların kuyulara düşmesini önlemek için kapağını ve kapağını tek katlı bir mendille çıkarın. En az 48 saat kuluçkaya yatın.
    1. Kuyuların görsel denetim le tamamen kaplandın. Çıkarmadan önce steril bir pipet ucu yla hafifçe prodding ile elastomerin tamamen iyileştiğinden emin olun.
  4. 300 μL%70 etanol ekleyin (mutlak etanol ve endotoksiniçermeyen su ile yapılır) ve RT'de 1 saat boyunca inkübün. , ve 24 saat önce kalan çözücü kaldırmak için kullanmak.
    1. Her plakanın üç kuyusunda 200 μL endotoksinsiz su 1 saat. Uç nokta kromojenik endotoksin tonu kullanarak su ekstrelerinin endotoksin konsantrasyonunun ölçülmesi (adım 2.5.1−2.5.6).

4. Florlu Poli (tetrafloroetilen) ile Kaplama Hücre Kültürü Yüzeyleri

  1. 20 mL'lik bir cam sintillasyon şişesinde florlu poli(tetrafloroetilen) (fPTFE) (örneğin, 10 mL florlu çözücüye 10 mg fPTFE ekleyin [Malzeme Tablosu]) 1 mg/mL çözeltisi yapın. Şişeye manyetik bir karıştırma çubuğu yerleştirin ve tüm katılar eriyene kadar en az 24 saat karıştırmaya izin verin.
  2. Bir polistiren 48-well plaka (yani, doku kültürü tedavi değil) her kuyuya polimer çözeltisi yaklaşık 150 μL ekleyin. Polimer çözeltisi ile tüm kuyuların tam kapsama alanını sağlamak için kuyu plakasını yavaşça yatırın. Kapağı değiştirin.
    1. Kuyuların etkili fPTFE kaplamasını sağlamak için cam kapaklar fPTFE ile kaplandırılmalı ve su temas açısı ölçümü için kullanılmalıdır (adım 4.3.1). 24 kuyuluk bir plakanın kuyularının içine kapaklar yerleştirin. Bir kapak kaymaiçeren her kuyuya yaklaşık 400 μL polimer çözelti ekleyin. Kapakları steril forsepsler kullanarak aşağı iterek tamamen polimer çözeltiyle kaplı olmalarını sağlayın ve kuyu plakasını bir kapakla kapatın.
  3. Polimer solüsyonlu kuyu plakasını ve/veya kapaklı plakayı 50 cmHg, 40 °C'de ayarlanmış bir vakum fırınına yerleştirin. Diğer enkazların kuyulara düşmesini önlemek için kapağını ve kapağını tek katlı bir mendille çıkarın. En az 48 saat kuluçkaya yatın.
    1. Etkili kaplama sağlamak için fPTFE kaplı kapakların su temas açısını goniyometre ile ölçün.
      NOT: Su temas açısı ölçümleri için sadece en yüksek saftaki su (örn. cam üçlü distile) kullanılmalıdır.
  4. 300 μL%70 etanol ekleyin (mutlak etanol ve endotoksiniçermeyen su ile yapılır) ve RT'de 1 saat boyunca inkübün. , ve 24 saat önce kalan çözücü kaldırmak için kullanmak.
    1. 1 saat boyunca her plakanın üç kuyusunda 200 μL endotoksiniçermeyen su inkübünü 1 saat. Uç nokta kromojenik endotoksin tonu kullanarak su ekstrelerinin endotoksin konsantrasyonunun ölçülmesi (adım 2.5.1−2.5.6).
  5. UV hücre kültürü deneyleri önce 30 dakika boyunca kuyu plakaları sterilize.

5. 3T3 Hücrelerden Lysate yapma

  1. Birden fazla T150 şişelerinde 3T3 hücrelerini %70'inin biraraya gelmesine kadar büyütün. Hücreleri ayırmak, aspirasyon ortamı, 5 mL PBS ile yüzeyi yıkayın ve PBS aspire edin. Hayvansal kökenli olmayan 5 mL, rekombinant hücre ayrıştırma enzimi(Malzeme Tablosu)ekleyin ve 37 °C'de 3−5 dakika kuluçkaya yatırın.
  2. Şişeyi yavaşça ileri geri yatırarak hücreleri ayırın. Hücre bölünmesi için kullanılan rekombinant enzimi nötralize etmek için 5 mL PBS ekleyin. Bir santrifüj tüpü içine şişelerden müstakil hücreleri aktarın ve pipetleme yoluyla karıştırın. Hemositometre ve hücre canlılığı boyası kullanarak canlı hücre sayımı yapın.
    NOT: PBS'de seyreltme yoluyla nötralize edilebilen bir hücre ayrıştırma enzimi, lysat preparatına serum bazlı proteinlerin girişini önlemek için seçilmiştir. Hücreleri ayrıştırmak için tripsin kullanılıyorsa, serum içeren bir solüsyon la nötralize edilmeli ve lysat preparatına taşınan serum proteinlerinin miktarını azaltmak için ek bir PBS yıkama yapılmalıdır.
  3. Hücreleri 200 x g'de 5 dk. Kalan ortamları yıkamak için PBS'nin orijinal hacmindeki süpernatant ve resuspend hücrelerini (yani 10 mL x şişe sayısı) aspire edin. Tekrar.
  4. Hücreleri 5 dk için 200 x g'da tekrar santrifüj edin ve süpernatantı aspire edin. 1 x 106 hücre/mL son hücre konsantrasyonu elde etmek için gerekli PBS hacmini ekleyin. Hücre çözeltisini -80 °C'lik bir derin dondurucuya, numune tamamen dondurulana kadar (en az 2 saat) yerleştirin.
  5. 37 °C'lik su banyosunda hücre çözeltisi çözülme. Tamamen çözüldükten sonra, çözeltiyi tamamen dondurulana kadar -80 °C'lik derin dondurucuya geri yerleştirin. Toplam 3 donma-çözülme döngüsü için tekrarlayın.
  6. Protein konsantrasyonunu belirlemek için çeşitli seyreltmelerde (örn. 1/100, 1/200, 1/500, 1/1000) hücre lysat'ında mikro bilardoik asit (BCA) tayini yapın. Hücre lisatını 468,75 μg/mL protein konsantrasyonuna seyreltin, aliquot ve ileride kullanım için -80 °C'de saklayın.
    NOT: 48 kuyulu bir plakadaki son protein konsantrasyonu 125 μg/cm2 'dir (bir kuyunun yüzey alanına göre, 0.75 cm2).
  7. 1,5 mm kalınlığındaki poliakrilamid jele yükleme tamponuna 40−60 μg lysate protein yükleyerek LYSATe proteini 60 [HSP60], yüksek hareketlilik grubu kutusu 1 [HMGB1]) lysate'deki DAMP'lerin varlığını değerlendirmek için Batılı bir leke yapın ve standart Batı lekesini takip edin Yordam.

6. Adsorbed Protein Tabakalarının ve Toll benzeri Reseptörlerin Makrofajların NF-κB Aktivitesi Üzerine Etkisini Değerlendirmek

NOT: Deneysel iş akışı ve plaka düzeninin şeması için sırasıyla Şekil 1A ve Ek Şekil 1'ebakın.

  1. Uygun büyüklükteki bir şişede muhabir makrofajlarını %70'lik bir araya getirmek için büyütün. Aspire ortamı, Yüzeyi PBS ile yıkayın ve PBS'yi aspire edin. Rekombinant hücre ayrışma enzimini ekleyin ve 37 °C'de 8 dakika kuluçkaya yatırın.
  2. Şişenin kenarlarına sıkıca dokunarak hücreleri ayırın. Eşit hacimli büyüme ortamı (%10 FBS içeren) ekleyerek rekombinant hücre dissosiyasyon enzimini inaktive edin. Hemositometre ve hücre canlılığı boyası kullanarak canlı hücre sayımı yapın.
    NOT: Hücre dissosilasyon enziminde 8 dk'lık bir kuluçka dan sonra muhabir makrofajlar için beklenen canlılık %90'dır.
  3. 5 dk. Aspire supernatant için 200 x g santrifüj hücreleri ve hücreleri yıkamak için PBS orijinal hacminde resuspend. Tekrar santrifüj ve istif medya (ısı inaktive FBS içeren) 7.3 x 105 hücreleri / mL hücreleri resuspend.
  4. 3 farklı tüpler halinde ayrı hücre süspansiyon: TLR4 inhibitörü, anti-TLR2, ve tedavi edilmezse. RT'de 60 dk veya RT'de 30 dakika için 50 g/mL anti-TLR2 ile 1 μg/mL TLR4 inhibitörü olan inkübat hücreler.
  5. 48 kuyulu bir plakaya (veya eşdeğeri) 200°L lysate, %10 FBS, %10 ticari fare plazması(Malzeme Tablosu)veya protein çözeltilerinin karışımını ekleyin ve proteinin istenilen süre için 37 °C'de (yani 30 dk, 60 dk veya 24 saat) adsorb'a izin verin. Her protein çözeltisi için taze pasteur pipet kullanarak kuyulardan protein çözeltilerini aspire edin ve yüzeyleri 5 dk. Aspire PBS için 250 μL PBS ile yıkayın. Toplam 3 yıkıntı için tekrarlayın.
    NOT: Bu adımın, istenen adsorpsiyon süresine bağlı olarak protokolde daha erken başlatılması gerekebilir. Protokolü buna göre ayarlayın.
  6. TLR4 inhibitörü veya anti-TLR2 ile kuluçka döneminden sonra pipet hücreleri yeniden askıya alınır. Her kuyuya 200 μL hücre çözeltisi ekleyin.
  7. TLR2 pozitif kontrol koşulu için Pam3CSK4'ü 150 ng/mL'lik son konsantrasyona ekleyin. TLR4 pozitif kontrol koşulu için, lipopolisakkariti (LPS) 1,5 g/mL'lik son konsantrasyona ekleyin. 37 °C'de 20 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
  8. Her kuyudan ve plakadan 20 μL supernatant numunesini 96 kuyulu bir plakaya kopyalayın. Arka plan denetimi olarak 20 μL'lik bir araştırma ortamının üç kuyusu ekleyin. Her kuyuya 200 μL SEAP muhabiri acenta reaktifi ekleyin. Plakayı yapışkan bir mühürle kaplayın ve 37 °C'de 2,5 saat kuluçkaya yatırın.
    NOT: Kuluçka süresi deneysel koşullara bağlı olarak değişebilir ve pozitif ve negatif kontrol kuyuları arasında emicilik güçlü bir fark için optimize edilmelidir.
    1. Supernatant'ın geri kalanını 1,5 mL'lik bir tüpe (kuyu başına) aktarın. Herhangi bir enkaz pelet için 10 dakika için 1.000 x g santrifüj. Supernatant'ı yeni bir 1,5 mL'lik tüpe aktarın ve -80 °C'de saklayın. Enzime bağlı immünosorbent tsay (ELISA) ile proinflamatuar sitokinlerin (örneğin, TNF-α, interlökin 6) varlığı için süpernatant analiz edin.
  9. Yapışkan plaka mührünü çıkarın. 635 nm'de bir plaka okuyucu kullanarak plakanın emiciliğini okuyun. Sıvı aspire ve plaka atın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Polimer kaplı yüzeyler için temizleme yöntemleri, kaplamada herhangi bir bozulma olmaması için test edilmiştir, bu da su temas açısında kaplamasız cam kapak kaymasına bir değişiklik olarak görülebilir(Şekil 2). PMMA kaplı mikroskop slaytlarının 1 saat boyunca %70 etanolle ıslatılması pmma kaplamasını(Şekil 2,sol panel), büyük olasılıkla PMMA'nın %80'inde etanol13'teçözünürlüğü nedeniyle, bu nedenle PMMA kaplı yüzeyler 30 dk UV sterilizasyonu kullanılarak tek başına temizlendi. Kaplama için PMMA konsantrasyonu daha önce optimize edildi5. PdMS'nin temizlenmesinde %1 saat 70 etanol kullanıldı ve UV ışığı zincir makası na neden olabileceği ve PDMS14'ünyüzey ıslatma özelliklerini etkileyebildiği için UV sterilizasyonu ihmal edildi. Hem %70 etanol emmek hem de UV sterilizasyonu fPTFE kaplı kapakların su temas açısını etkilemedi(Şekil 2, sağ panel), bu nedenle fPTFE kaplamaların temizlenmesinde art arda iki yöntem kullanıldı. FPTFE kaplama yöntemi daha önce Grainger grup15tarafından tanımlanmıştır.

3T3 lysate'de, kompleks moleküler karışımda DAMP türlerinin bulunduğundan emin olmak için batılı bir leke yapıldı. Sonuçlar, hem HMGB1 hem de HSP60, iyi belgelenmiş iki BARAJ16,17, lysate mevcut olduğunu gösterdi (Şekil 1B). TLR ligandların polimer yüzeylere adsorpsiyonu, muhabir makrofajların (işlenmemiş, TLR2 nötralize veya TLR4 inhibe) protein-adsorbed polimer yüzeylerde 20 saat (yani, doku kültürü ile tedavi polistiren [TCPS], PMMA, PDMS, fPTFE) ve daha sonra dolaylı olarak nf-кB/AP-1 aktivitesini enzimatik bir test kullanarak SEAP üretimine dayalı olarak değerlendirir(Şekil 1C ve Şekil 3). Ayrıca, muhabir makrofajlar adsorbe fbs veya plazma ile karşılaştırıldığında adsorbed lysate üzerinde NF-кB/AP-1 aktivitesini önemli ölçüde artırmış ve önceden adsord protein (medya)(Medya) (Şekil 4). TLR ligands sentetik triasilate lipopeptid (Pam3CSK4, TLR2 ligand) ve lipopolisakkarit (LPS, TLR4 ligand) antikor veya inhibitörü doğrulamak için pozitif kontroller olarak dahil edildi ve testi düzgün çalışıyordu. TLR2 nötralizasyonu, muhabir makrofajların TLR4 inhibisyonuna göre adsorbe lisata verdiği NF-кB/AP-1 tepkisinde belirgin bir azalma yada daha güçlü bir azalma yada daha güçlü bir azalma yada daha güçlü bir azalma yada tetkikçiye karşı dır. Ayrıca serumda seyreltilmiş küçük miktarda lisat (toplam proteine dayalı) nf-кB/AP-1 yanıtı sadece seruma göre önemli ölçüde artmış ve polimer yüzeyine bağlı en düşük etkin seyreltme(Şekil 5). Bu sonuçlar, çeşitli polimerik yüzeylerde muhabir makrofajlarda TLR'ye bağımlı NF-кB/AP-1 aktivitesini indükleyen adsorbed lysate kaynaklı moleküllerin gücünü göstermektedir.

Figure 1
Şekil 1: TCPS, PMMA, PDMS ve fPTFE'de NF-кB/AP-1 muhabir makrofajlarının alkali fosfataz tahsini için yöntem ve sonuçlar. (A) Muhabir makrofaj alkalen fosfataz tetkik için iş akışının diyagramı. (B) Batıda DAMP türleri HMGB1 ve HSP60'ın varlığını doğrulayan lysate blot, β-actin yükleme kontrolü olarak. (C) NF-кB/AP-1 aktivitesi (absorbance anceance tarafından temsil) medya (negatif kontrol), 10% FBS, lysate ve Pam3CSK4 (TLR2 ligand, pozitif kontrol) için 20 saat. Her deney de durum başına n = 3 ayrı kuyu kullandı ve her kuyu enzimatik tarak için yinelenen olarak kaplandı. Tek yönlü ANOVA ve Tukey post-hoc testi kullanılarak analiz edilir. p < 0.001. Bu rakam McKiel ve Fitzpatrick5izni ile adapte edilmiştir. Telif Hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: SU temas açısı (WCA) kullanılarak değerlendirilen PMMA ve fPTFE kaplamalı yüzeyler için temizleme yöntemlerinin optimizasyonu. Ölçümler en az 3 kapaklı 2 ayrı noktada niçin yapıldı. Veriler ortalama ± SD olarak gösterilir. Tek yönlü ANOVA ve Tukey post-hoc testi kullanılarak analiz edilir. * p < 0.05. Bu rakam McKiel ve Fitzpatrick5izni ile adapte edilmiştir. Telif Hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: %10 FBS (kontrol), lysate ve 20 saat için pozitif kontrol üzerine kültürlenen muhabir makrofajların TLR aracılı NF-кB/AP-1 aktivitesi (absorbance ile temsil edilir). (A) TLR2 nötralizasyonunun muhabir makrofaj yanıtları üzerindeki etkisi. Pozitif kontrol Pam 'dir (Pam3CSK4, TLR2 ligand). (B) TLR4 inhibisyonunun muhabir makrofaj yanıtı üzerindeki etkisi adsorbe lisate. Pozitif kontrol LPS 'dir (TLR4 ligand). Veriler bir denemenin sonuçlarını gösterir ve ortalama ± SD olarak gösterilen en az 2 ayrı deneyin sonuçlarını temsil eder. Her deney de durum başına n = 3 ayrı kuyu kullandı ve her kuyu enzimatik tarak için yinelenen olarak kaplandı. Tek yönlü ANOVA ve Tukey post-hoc testi kullanılarak analiz edilir. ** p < 0.01, *** p < 0.001. Bu rakam McKiel ve Fitzpatrick5izni ile adapte edilmiştir. Telif Hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: NF-кB/AP-1 etkinliği (absorbance anceance tarafından temsil) medya (negatif kontrol), 30 dakika ve 24 saat adsorbed protein katmanları ve Pam3CSK4 (pozitif kontrol) TCPS üzerinde 20 saat kültürlü. Veriler 3 ayrı deneyden elde edilir ve ortalama ± SD olarak gösterilir. Her deney de durum başına n = 3 ayrı kuyu kullandı ve her kuyu enzimatik titreşme için çoğaltılamaz olarak kaplandı (yani, n = 9 bağımsız olmayan hücre kültürü kuyuları ve n = 18 bağımsız olmayan enzimatik araştırma kuyuları). Tek yönlü ANOVA ve Tukey post-hoc testi kullanılarak analiz edilir. p < 0.001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Muhabir makrofaj NF-кB/AP-1 aktivitesi (absorbance ile temsil edilir) 20 saat sonra FBS lysate seyreltme yanıt olarak (toplam protein = 280 μg / iyi) polimer yüzeylere 30 dakika adsorbe. (A) TCPS. (B) PMMA. (C) PDMS. (D) fPTFE. Veriler bir denemenin sonuçlarını gösterir ve ortalama ± SD olarak gösterilen en az 2 ayrı deneyin sonuçlarını temsil eder. Her deney de durum başına n = 3 ayrı kuyu kullandı ve her kuyu enzimatik tarak için yinelenen olarak kaplandı. Tek yönlü ANOVA ve Tukey post-hoc testi kullanılarak analiz edilir. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. Bu rakam McKiel ve Fitzpatrick5izni ile adapte edilmiştir. Telif Hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Supplemental Figure 1
Ek Şekil 1: NF-кB/AP-1 muhabiri makrofaj hücre kültürü için 8 odalı ve 48 kuyulu plaka formatlarında kullanılan örnek düzenler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Laboratuvarımızın ana odak noktası katı biyomalzeme yumuşak doku implantlarına yapılan ana yanıttır ve özellikle implantasyon işlemi sırasında oluşan hücresel hasarın konak yanıtını nasıl etkilediğidir. Burada sunulan çalışma, hücresel hasar sırasında (implant cerrahisinden) biyomalzemelere makrofaj tepkileri üzerine salınan moleküllerin etkisini araştırmak için bir muhabir makrofaj hücre hattı ve in vitro-generated DAMP içeren hücresel lysate kullanılarak yapılan ön deneyleri açıklamaktadır. Fibroblast hücreli lysate, biyomateryal yerleşimi nedeniyle DAMP'ların hücresel hasarını ve salınımını modellemek için kullanıldı. Fibroblastlar yumuşak dokuda fibroblastların prevalansı nedeniyle lysat oluşturmak için seçildi, hem de fibronektin dahil olmak üzere ekstrasellüler matriks (ECM) proteinlerin çeşitli salgılama yeteneği18. Donma-çözülme bisikleti, implant ortamında kine benzer şekilde hem hücre içi hem de ECM kaynaklı DAMC'ler üretmek için lysis yöntemi olarak seçilmiştir. Proteaz inhibitörleri bu lysate yapmak için kullanılmadı. Donma-çözülme döngüsü gibi kontrolsüz hücre lisisi, DAMP'ları bozabilecek proteazların salınımına neden olsa da, implantasyon işlemi sırasında hücreler hasar gördüğünde bu enzimler de biyomalzeme implant ortamında bulunabilir. Lysate'nin karmaşık moleküler karışımında DAMP'ların varlığı Batı lekesi ile doğrulandı (Şekil 1B; HMGB1 ve HSP60) ve SEAP muhabiri testi (Şekil 1C; NF-кB/AP-1 adsorbe lisate yanıt olarak faaliyet). Ayrıca, toplam protein konsantrasyonuna göre FBS'de lysate'nin seyreltildiği ve hücre kültür yüzeylerine adsorbe edildiği(Şekil 5)implant ortamının karmaşıklığını daha iyi yansıtacak, çünkü çok sayıda kan proteini ve DAMP'lar 6 içerecektir. Muhabir makrofaj NF-кB/AP-1 aktivitesi FBS seyreltilmiş lysate adsorbed katmanlarında önemli ölçüde artmış kaldı ve önemli aktivasyon elde etmek için en düşük seyreltme yüzeybağımlı, arasında değişen% 0.1 (TCPS) arasında değişen 10% (PDMS ve fPTFE).

Polimerler PMMA, PDMS ve PTFE onlar nondegradable çünkü bu çalışma için seçildi ve biyomalzemelere protein adsorpsiyon ve makrofaj yanıtı değerlendirmek için literatürde yaygın olarak kullanılmıştır19,20,21,22,23,24,25. TCPS, in vitro makrofaj ve TLR sinyalizasyon çalışmaları21,26,27,28için kullanılan ortak bir substrat olduğu için karşılaştırma için de kullanılmıştır. Çalışmamızda kullanılan malzemeler, bozunamayan, katı biyomalzemelerin temsili örnekleridir. Ancak, malzeme hücre kültür plakaları veya mikroskop slaytlar üzerine kaplanabilir ve düzgün dekontamine sağlanan, bu model ile birçok diğer malzemeler kullanılabilir. NF-κB/AP-1 muhabiri makrofaj hücre hattı bu in vitro model için seçilmiştir, çünkü SEAP'nin NF-κB/AP-1 indükleyici ifadesi ile NF-κB/AP-1 aktivitesinin hızlı ve dolaylı olarak ölçülmesini sağlar. NF-κB/AP-1 muhabir makrofajları, kültür medyasında phleomisin D1'in seçici antibiyotik olarak kullanılmasını gerektirerek sadece NF-кB/AP-1 indüklenemeyen SEAP genine sahip hücrelerin mevcut olmasını sağlamak için29. Alkali fosfataz testi için, serumda bulunan alkali fosfatazlar tarafından oluşturulan olası yanlış pozitif sonuçları önlemek için hücre kültürü medyasında HI-FBS kullanmak önemlidir. Bugüne kadar yaptığımız araştırmalar, FBS adsordi yüzeylerin saptanabilir bir yanlış pozitif sonuç oluşturmadığını, muhtemelen serum moleküllerinin kültür yüzeyine güçlü bir şekilde adsorbe edildiklerinden ve süpernatant'a salınmadığından kaynaklandığını göstermektedir. Muhabir makrofajlar (20 saat), gözetleme kuluçka zaman noktası (2,5 saat) ve alkali fosfataz tetkik için emme okuma dalga boyu (635 nm) için kültür zaman noktası tüm koşullar için sağlam ve tekrarlanabilir ölçümler sağlamak için bu sistem ile optimize edildi.

Protein adsorpsiyon literatüründe yaygın kullanımı nedeniyle bu çalışma için 30 dk'lık bir ilk protein adsorpsiyon zaman noktası seçilmiştir (Şekil 1C)30,31,32,33,34. Ancak, makrofajların in vivo ile etkileşeceği adsordi protein tabakasını daha iyi temsil etmek için daha uzun adsorpsiyon sürelerini (yani 60 dk ve 24 h, Şekil 4)daha iyi yansıtarak implantasyondansonra 4−24 saat daha fazla adsorpsiyon süreleri araştırdık. Bu protein adsorpsiyon ve değişim çoğunluğu bir yüzeye maruz kalma ilk 60 dakika oluşur ileri sürülmuştur26,35,36, bu nedenle bir 60 dk adsorpsiyon süresi daha uygun bir zaman noktası olabilir. Ayrıca adsorbed protein tabakasında DAMPs varlığı için olumsuz bir kontrol olarak FBS kullanarak ticari fare plazma taşındı. Serum yerine plazma kullanmanın mantığı, plazma protein lerinin protein adsorpsiyonve makrofaj yanıtı1'deönemli rol oynadığının bilinmesi ve plazmanın yara ortamındaki proteinlerin daha iyi bir temsili olmasıdır. Protein adsorpsiyon deneylerinde kullanılan plazma yaygın olarak% 10 plazma kullanımımızı motive bir 1−10% seyreltme26,36,37olarak hazırlanır. İnsan plazması yaygın olarak kullanılır26,36, bu büyük miktarlarda elde etmek daha kolay ve daha klinik olarak ilgili olduğu gibi, fare plazması ile karşılaştırıldığında. Ancak, bu modelde protein çözeltilerinin türlerini muhabir hücrelerinkiyle tutarlı tutmak için ticari fare plazması kullanmayı seçtik.

Muhabir makrofaj hücre hattının kullanımı çalışma içinde bazı sınırlamalar getirmiştir. İlk olarak, fenotip ve davranış birincil makrofaj kültürlerden değişebilir gibi bir murine lösemik makrofaj hücre hattı kullanarak, doğal sınırlamalar vardır. Bu sınırlama birincil makrofajlar kullanılarak gelecekteki çalışmalarda ele alınacak iken, ebeveyn makrofaj hücre hattı yakından fare kemik iliği türetilmiş makrofajlar hücre yüzey reseptörleri ve TLRs 2, 3 ve 438için mikrobiyal ligands yanıt açısından taklit gösterilmiştir. Ayrıca, NF-κB/AP-1 muhabiri makrofajlar periton primer murine makrofajlar ile karşılaştırıldığında HMGB1 ve LPS stimülasyonuna yanıt olarak benzer sonuçlar verdi39. Bu NF-κB/AP-1 muhabiri makrofajlar ve ebeveyn zorlanma, TLR540ifade etmeyin unutulmamalıdır. Araştırmacılar, HMGB1'in insan TLR541ile transfeced HEK-293 hücrelerindeki TLR5 sinyal yolları aracılığıyla NF-κB transkripsiyon faktörlerini aktive edebildiğini göstermiştir. Bu nedenle, HMGB1-TLR5 sinyalizasyonunun lysate kaplamalı yüzeylerdeki genel NF-κB aktivitesine katkısı bu modelde ihmal edilmiştir. Ayrıca, muhabir makrofajlar ve ebeveyn zorlanma ASC adaptör protein ifade etmez, ve sonuç olarak inflammasomes en türleri formu yok ve inaktif IL-1β veya inaktif IL-18 olgun formları için işleyemez42. Bu nedenle kullandığımız model, asc'ye bağlı inflamatuar aktivitenin ve sonraki otokrin IL-1β ve IL-18 sinyallerinin makrofaj yanıtlarında lysate-adsordi yüzeylere katkısını hesaba katmaz. Sonuç olarak, bu tetkik TLR bağımlı NF-κB aktivasyonunun ön incelemesi olarak tasarlanmıştır ve birincil makrofajlar kullanılarak yapılan sonraki araştırmalar, makrofaj aktivasyonu ve ilgi alanının maddi yüzeylerinde fenotip hakkında daha eksiksiz ve temsili bir anlayış sağlamak için tavsiye edilir.

Alkalen fosfataz teşbi dolaylı olarak muhabir makrofajların NF-кB/AP-1 aktivitesini ölçer. Ancak, NF-кB/AP-1 (örneğin, interlökin-1 reseptörü [IL-1R]43 ve tümör nekroz faktör reseptörü [TNFR]44)içeren TLR dışında birçok sinyal yolları vardır. Bu nedenle tlr2 ve TLR4 sinyallerinin artan NF-кB/AP-1 yanıtındaki katkısının inhibisyon tahlilleri kullanılarak lysate-adsordi yüzeylere katkısının değerlendirilmesi gerekmektedir (Şekil 3). Bu iki yüzey TLR seçmek için mantığı en az 23 DAMPs TLR2 veTLR4 45üzerinden sinyal gösterilmiştir , iyi karakterize HMGB1 dahil olmak üzere, ve her iki reseptör hücre yüzeyinde ifade edilir ve biyomalzeme yüzeyi ile doğrudan etkileşime girebilirsiniz6. TLR2 ve TLR4 inhibisyonu tahlilleri, TLR2 veya TLR4 sinyalizasyonu engellendiğinde, muhabir makrofajlarının adsorbe lysate'ye verdiği nf-кB/AP-1 tepkisinin azaldığını göstererek, her iki yolun da işin içinde olduğunu göstermiştir. Ancak TLR2 sinyalizasyonu etkisiz hale getirildiğinde NF-кB/AP-1 aktivitesinde belirgin bir azalma oldu ve tlr2'nin muhabir makrofajların adsorbe lisate tepkisinde birincil rol oynayabileceğini düşündürdü. TR sinyal yolu ile bazı hedef dışı inhibisyon antikorları ve inhibitörleri nötralize olabileceğini biliyoruz. Bu çalışma sırasında ticari olarak mevcut OLMAYAN TLR2 inhibitör molekülleri olmadığı için TLR2 yolunu inhibe etmek için nötralize edici bir antikor kullanılmıştır.

Burada sunulan yöntemler, DAMP'ların karmaşık bir kaynağı olarak lysate'yi ve Polimerik biyomalzemelere adsorbe edilen diğer proteinlere makrofaj yanıtları için in vitro model olarak NF-κB/AP-1 muhabiri makrofajlarını kullanmaktadır (Şekil 1). Protokolümüzün NF-κB/AP-1 yanıtlarını hızlı bir şekilde analiz etmek ve muhabir makrofajların çeşitli malzemelere (bozunabilir malzemeler, gözenekli iskeleler veya hidrojeller dahil) ve adsordi protein katmanlarına güncel tirajları analiz etmek için kullanılabileceğini tahmin ediyoruz(Şekil 3). Ancak, gözenekli malzemelerin ve hidrojellerin kullanımı sistem içinde karmaşıklık getirecektir, bu adsorbed moleküller ve entrained moleküller arasında ayrım yapmak zor olabilir gibi. Ayrıca bu protokolün nf-кB/AP-1'in (örneğin, C-tipi lektin reseptörleri46 ve nükleotid bağlayıcı oligomerizasyon etki alanı (NOD) benzerireseptörlerinuygun inhibitörlerle olan benzerliğini araştırmak için kolayca uyarlanabileceğini öngörüyoruz. Ayrıca, muhabir makrofajların NF-κB/AP-1 yanıtı farklı malzemeler arasında karşılaştırılabilir, eğer yanıtlar temel hücre aktivitesine normalleştirilir (yani, her yüzeydeki ortam hücrelerinin önceden adsorded proteini olmadan) ve tüm malzemelerin saptanamayan endotoksin düzeyleri vardır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Yazarlar minnetle Kanada Sağlık Araştırma Projesi Enstitüleri (PTJ 162251), Queen's University Senato Danışma Araştırma Komitesi ve Kanada Yenilik John Evan Liderlik Fonu (Proje 34137) ve Araştırma ve Yenilik Ontario Araştırma Fonu (Proje 34137) için altyapı desteği operasyonel fon kabul. L.A.M. Queen's University R. Samuel McLaughlin Bursu, Kanada Kanada Yüksek Lisans Bursu Yüksek Lisans Ödülü ve Ontario Lisansüstü Bursu tarafından desteklendi. Yazarlar NF-κB/AP-1 muhabiri makrofaj hücre hattı ve Dr Michael Blennerhassett ve Sandra Lourenssen kendi jel görüntüleme sistemi ve plaka okuyucu kullanımı için yaptığı cömert hediye için Dr Myron Szewczuk teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture reagents
anti-mouse/human CD282 (TLR2) Biolegend 121802
CLI-095 (TLR4 inhibitor) Invivogen TLRL-CLI95
C57 complement plasma K2 EDTA 10ml, innovative grade US origin InnovativeResearch IGMSC57-K2 EDTA-Compl-10ml Mouse plasma
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Sigma Aldrich D6429-500ML
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Fisher Scientific 14190250 No calcium, no magnesium
Fetal bovine serum (FBS), research grade Wisent 98150
LPS-EK Invivogen TLRL-EKLPS Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12
NIH/3T3 fibroblasts ATCC CRL-1658
Pam3CSK4 Invivogen tlrl-pms Synthetic triacylated lipopeptide - TLR1/2 ligand
Penicillin/streptomycin Sigma Aldrich P4333-100ML
Plasmocin Invivogen ANT-MPP Mycoplasma elimination reagent
RAW-Blue cells Invivogen raw-sp NF-κB/AP-1 reporter macrophage cell line
Trypan blue solution, 0.4% Fisher Scientific 15250061
TrypLE express enzyme (1X) Fisher Scientific 12604021 animal origin-free recombinant cell dissociation enzyme
Zeocin Invivogen ANT-ZN-1
Kits and assays
ELISA precoated plates, mouse IL-6 Biolegend B213022
ELISA precoated plates, mouse TNF-α Biolegend B220233
Endotoxin (Escherichia coli) - Control standard endotoxin (CSE) Associates of Cape Cope Inc. E0005-5 Endotoxin for standard curve in chromogenic endotoxin assay
LAL water, 100 mL Associates of Cape Cope Inc. WP1001 Used with chromogenic endotoxin assay
Micro BCA protein assay Fisher Scientific PI23235
Limulus amebocyte lysate (LAL) Pyrochrome endotoxin test kit Associates of Cape Cope Inc. C1500-5 Chromogenic endotoxin assay reagent
QUANTI-Blue alkaline phosphatase detection medium Invivogen rep-qb2 Alkaline phosphatase assay to indirectly measure NF-κB/AP-1 activity
Polymeric coating reagents
Chloroform, anhydrous Sigma Aldrich 288306-1L
Ethyl alcohol anhydrous Commercial Alcohols P006EAAN Sigma: Reagent alcohol, anhydrous, 676829-1L
Straight tapered fine tip forceps Fisher Scientific 16-100-113
Fluorinert FC-40 solvent Sigma Aldrich F9755-100ML Fluorinated solvent for fPTFE
Cell culture grade water (endotoxin-free) Fisher Scientific SH30529LS
Poly(methyl methacrylate) (PMMA) Sigma Aldrich 182230-25G
Sylgard 184 elastomer kit Fisher Scientific 50822180
Teflon-AF (fPTFE) Sigma Aldrich 469610-1G Poly[4,5-difluoro-2,2-bis(trifluoromethyl)-1,3-dioxole-co-tetrafluoroethylene]
Consumables
Adhesive plate seals Fisher Scientific AB-0580
Axygen microtubes, 1.5 mL Fisher Scientific 14-222-155
Borosilicate glass scintillation vials, with white polypropylene caps Fisher Scientific 03-337-4
Clear PS 48-well plate Fisher Scientific 08-772-52
Clear TCPS 96-well plate Fisher Scientific 08-772-2C
Clear TCPS 48-well plate Fisher Scientific 08-772-1C
Cover glasses, circles Fisher Scientific 12-545-81
Falcon tissue culture treated flasks, T25 Fisher Scientific 10-126-10
sticky-Slide 8 Well Ibidi 80828
Superfrost microscope slides Fisher Scientific 12-550-15
Tissue culture treated flasks, T150 Fisher Scientific 08-772-48

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Seminars in Immunology. 20 (2), 86-100 (2008).
  2. Anderson, J. M., Miller, K. M. Biomaterial biocompatibility and the macrophage. Biomaterials. 5 (1), 5-10 (1984).
  3. Collier, T. O., Anderson, J. M. Protein and surface effects on monocyte and macrophage adhesion, maturation, and survival. Journal of Biomedical Materials Research. 60 (3), 487-496 (2002).
  4. Bianchi, M. E. DAMPs, PAMPs and alarmins: all we need to know about danger. Journal of Leukocyte Biology. 81 (1), 1-5 (2007).
  5. McKiel, L. A., Fitzpatrick, L. E. Toll-like Receptor 2-Dependent NF-κB/AP-1 Activation by Damage-Associated Molecular Patterns Adsorbed on Polymeric Surfaces. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3792-3801 (2018).
  6. Babensee, J. E. Interaction of dendritic cells with biomaterials. Seminars in Immunology. 20 (2), 101-108 (2008).
  7. Sintes, J., Romero, X., de Salort, J., Terhorst, C., Engel, P. Mouse CD84 is a pan-leukocyte cell-surface molecule that modulates LPS-induced cytokine secretion by macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 88 (4), 687-697 (2010).
  8. Tom, J. K., Mancini, R. J., Esser-Kahn, A. P. Covalent modification of cell surfaces with TLR agonists improves and directs immune stimulation. Chemical Communications. 49 (83), 9618-9620 (2013).
  9. Abdulkhalek, S., et al. Neu1 sialidase and matrix metalloproteinase-9 cross-talk is essential for toll-like receptor activation and cellular signaling. Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36532-36549 (2011).
  10. Gorbet, M. B., Sefton, M. V. Endotoxin: The uninvited guest. Biomaterials. 26 (34), 6811-6817 (2005).
  11. Xing, Z., Pabst, M. J., Hasty, K. A., Smith, R. A. Accumulation of LPS by polyethylene particles decreases bone attachment to implants. Journal of Orthopaedic Research. 24 (5), 959-966 (2006).
  12. Ding, H., et al. Comparison of the cytotoxic and inflammatory responses of titanium particles with different methods for endotoxin removal in RAW264.7 macrophages. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 23 (4), 1055-1062 (2012).
  13. Hoogenboom, R., Becer, C. R., Guerrero-Sanchez, C., Hoeppener, S., Schubert, U. S. Solubility and thermoresponsiveness of PMMA in alcohol-water solvent mixtures. Australian Journal of Chemistry. 63 (8), 1173-1178 (2010).
  14. Efimenko, K., Wallace, W. E., Genzer, J. Surface modification of Sylgard-184 poly(dimethyl siloxane) networks by ultraviolet and ultraviolet/ozone treatment. Journal of Colloid and Interface Science. 254 (2), 306-315 (2002).
  15. Godek, M. L., Sampson, J. A., Duchsherer, N. L., McElwee, Q., Grainger, D. W. Rho GTPase protein expression and activation in murine monocytes/macrophages is not modulated by model biomaterial surfaces in serum-containing in vitro cultures. Journal of Biomaterials Science. Polymer Edition. 17 (10), 1141-1158 (2006).
  16. Park, J. S., et al. Involvement of Toll-like Receptors 2 and 4 in Cellular Activation by High Mobility Group Box 1 Protein. Journal of Biological Chemistry. 279 (9), 7370-7377 (2004).
  17. Ohashi, K., Burkart, V., Flohé, S., Kolb, H. Cutting Edge: Heat Shock Protein 60 Is a Putative Endogenous Ligand of the Toll-Like Receptor-4 Complex. The Journal of Immunology. 164 (2), 558-561 (2000).
  18. Wong, T., McGrath, J. A., Navsaria, H. The role of fibroblasts in tissue engineering and regeneration. British Journal of Dermatology. 156 (6), 1149-1155 (2007).
  19. van Wachem, P. B., et al. The influence of protein adsorption on interactions of cultured human endothelial cells with polymers. Journal of Biomedical Materials Research. 21 (6), 701-718 (1987).
  20. Miller, K. M., Anderson, J. M. Human monocyte/macrophage activation and interleukin 1 generation by biomedical polymers. Journal of Biomedical Materials Research. 22 (8), 713-731 (1988).
  21. Bonfield, T. L., Colton, E., Anderson, J. M. Plasma protein adsorbed biomedical polymers: Activation of human monocytes and induction of interleukin 1. Journal of Biomedical Materials Research. 23 (6), 535-548 (1989).
  22. González, O., Smith, R. L., Goodman, S. B. Effect of size, concentration, surface area, and volume of polymethylmethacrylate particles on human macrophages in vitro. Journal of Biomedical Materials Research. 30 (4), 463-473 (1996).
  23. Anderson, J. M., et al. Protein adsorption and macrophage activation on polydimethylsiloxane and silicone rubber. Journal of Biomaterials Science. Polymer Edition. 7 (2), 159-169 (1995).
  24. Lord, M. S., Foss, M., Besenbacher, F. Influence of nanoscale surface topography on protein adsorption and cellular response. Nano Today. 5 (1), 66-78 (2010).
  25. Chen, S., et al. Characterization of topographical effects on macrophage behavior in a foreign body response model. Biomaterials. 31 (13), 3479-3491 (2010).
  26. Shen, M., Horbett, T. A. The effects of surface chemistry and adsorbed proteins on monocyte/macrophage adhesion to chemically modified polystyrene surfaces. Journal of Biomedical Materials Research. 57 (3), 336-345 (2001).
  27. Love, R. J., Jones, K. S. The recognition of biomaterials: Pattern recognition of medical polymers and their adsorbed biomolecules. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101 (9), 2740-2752 (2013).
  28. McNally, A. K., Anderson, J. M. Phenotypic expression in human monocyte-derived interleukin-4-induced foreign body giant cells and macrophages in vitro: Dependence on material surface properties. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (4), 1380-1390 (2015).
  29. Gambhir, V., et al. The TLR2 agonists lipoteichoic acid and Pam3CSK4 induce greater pro-inflammatory responses than inactivated Mycobacterium butyricum. Cellular Immunology. 280 (1), 101-107 (2012).
  30. Suzuki, O., Yagishita, H., Yamazaki, M., Aoba, T. Adsorption of Bovine Serum Albumin onto Octacalcium Phosphate and its Hydrolyzates. Cells and Materials. 5 (1), 45-54 (1995).
  31. Johnston, R. L., Spalton, D. J., Hussain, A., Marshall, J. In vitro protein adsorption to 2 intraocular lens materials. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 25 (8), 1109-1115 (1999).
  32. Jin, J., Jiang, W., Yin, J., Ji, X., Stagnaro, P. Plasma proteins adsorption mechanism on polyethylene-grafted poly(ethylene glycol) surface by quartz crystal microbalance with dissipation. Langmuir. 29 (22), 6624-6633 (2013).
  33. Swartzlander, M. D., et al. Linking the foreign body response and protein adsorption to PEG-based hydrogels using proteomics. Biomaterials. 41, 26-36 (2015).
  34. Chamberlain, M. D., et al. Unbiased phosphoproteomic method identifies the initial effects of a methacrylic acid copolymer on macrophages. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (34), 10673-10678 (2015).
  35. Dillman, W. J., Miller, I. F. On the adsorption of serum proteins on polymer membrane surfaces. Journal of Colloid And Interface Science. 44 (2), 221-241 (1973).
  36. Ishihara, K., Ziats, N. P., Tierney, B. P., Nakabayashi, N., Anderson, J. M. Protein adsorption from human plasma is reduced on phospholipid polymers. Journal of Biomedical Materials Research. 25 (11), 1397-1407 (1991).
  37. Warkentin, P., Wälivaara, B., Lundström, I., Tengvall, P. Differential surface binding of albumin, immunoglobulin G and fibrinogen. Biomaterials. 15 (10), 786-795 (1994).
  38. Berghaus, L. J., et al. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors 2, 3, and 4. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 33 (5), 443-454 (2010).
  39. Zhang, Y., Karki, R., Igwe, O. J. Toll-like receptor 4 signaling: A common pathway for interactions between prooxidants and extracellular disulfide high mobility group box 1 (HMGB1) protein-coupled activation. Biochemical Pharmacology. 98 (1), 132-143 (2015).
  40. Mizel, S. B., Honko, A. N., Moors, M. A., Smith, P. S., West, A. P. Induction of macrophage nitric oxide production by Gram-negative flagellin involves signaling via heteromeric Toll-like receptor 5/Toll-like receptor 4 complexes. Journal of Immunology. 170 (12), 6217-6223 (2003).
  41. Das, N., et al. HMGB1 Activates Proinflammatory Signaling via TLR5 Leading to Allodynia. Cell Reports. 17 (4), 1128-1140 (2016).
  42. Pelegrin, P., Barroso-Gutierrez, C., Surprenant, A. P2X7 Receptor Differentially Couples to Distinct Release Pathways for IL-1β in Mouse Macrophage. The Journal of Immunology. 180 (11), 7147-7157 (2008).
  43. Tak, P. P., Firestein, G. S. NF-κB: A key role in inflammatory diseases. Journal of Clinical Investigation. 107 (1), 7-11 (2001).
  44. Ashkenazi, A., Dixit, V. M. Death receptors: signaling and modulation. Science. 281 (5381), 1305-1308 (1998).
  45. Erridge, C. Endogenous ligands of TLR2 and TLR4: agonists or assistants. Journal of Leukocyte Biology. 87 (6), 989-999 (2010).
  46. Feng, Y., et al. A macrophage-activating, injectable hydrogel to sequester endogenous growth factors for in situ angiogenesis. Biomaterials. 134, 128-142 (2017).
  47. Lonez, C., et al. Cationic lipid nanocarriers activate Toll-like receptor 2 and NLRP3 inflammasome pathways. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 10 (4), 775-782 (2014).

Tags

Biyomühendislik Sayı 155 protein adsorpsiyonu yabancı cisim reaksiyonu makrofaj geçiş ücreti benzeri reseptör inflamasyon polimer biyomalzeme transkripsiyon faktörü hasarla ilişkili moleküler desenler hücre-malzeme etkileşimleri
Polimerik Yüzeylerde Adsorbe Protein Katmanlarında Sinyalizasyonu NF-kB/AP-1 Sinyallerini İnceleyecek Bir Makrofaj Muhabiri Hücre Tetkik
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McKiel, L. A., Woodhouse, K. A.,… More

McKiel, L. A., Woodhouse, K. A., Fitzpatrick, L. E. A Macrophage Reporter Cell Assay to Examine Toll-Like Receptor-Mediated NF-kB/AP-1 Signaling on Adsorbed Protein Layers on Polymeric Surfaces. J. Vis. Exp. (155), e60317, doi:10.3791/60317 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter