Summary
हम माउस मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी से प्राप्त विभिन्न कोशिका प्रकारों की पहचान करने के लिए एक प्रवाह साइटोमेट्री विधि प्रस्तुत करते हैं। इस विधि को न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में शुद्ध कोशिका आबादी को अलग करने या चित्रित करने या वायरल वेक्टर या नैनोकणों के वीवो प्रशासन में लक्षित सेल की सीमा की मात्रा निर्धारित करने के लिए शोषण किया जा सकता है।
Abstract
वायरल वेक्टर और नैनोमटेरियल विज्ञान में हाल ही में प्रगति की जांच या केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में हेरफेर करने के लिए नए अत्याधुनिक दृष्टिकोण के लिए रास्ता खोल दिया है । हालांकि, इन प्रौद्योगिकियों के आगे अनुकूलन शरीर में वायरल वैक्टर या नैनोकणों के प्रशासन पर सीएनएस और सेल-विशिष्ट लक्ष्यीकरण की सीमा के तेजी से और सुव्यवस्थित निर्धारण की अनुमति देने वाले तरीकों से लाभान्वित होगा। यहां, हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो प्रवाह साइटोमेट्री की उच्च थ्रूपुट और मल्टीप्लेक्सिंग क्षमताओं का लाभ उठाता है ताकि माउस मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी, अर्थात् माइक्रोग्लिया/मैक्रोफेज, लिम्फोसाइट्स, एस्ट्रोसाइट्स, ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स, न्यूरॉन्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं से अलग विभिन्न सेल उपप्रकारों के एक सीधा मात्राकरण की अनुमति दी जा सके । हम सेल यील्ड, व्यवहार्यता और संरचना के मामले में दो ऊतक समरूपता विधियों के बीच महत्वपूर्ण मतभेदों को उजागर करने के लिए इस दृष्टिकोण को लागू करते हैं। यह उपयोगकर्ता को ब्याज के सेल प्रकार (एस) और विशिष्ट अनुप्रयोग के आधार पर सबसे अच्छी विधि चुनने का निर्देश दे सकता है। यह विधि शारीरिक वितरण के विश्लेषण के लिए अनुकूल नहीं है, क्योंकि ऊतक एकल-कोशिका निलंबन उत्पन्न करने के लिए समरूप है। हालांकि, यह व्यवहार्य कोशिकाओं के साथ काम करने की अनुमति देता है और इसे सेल-छंटाई के साथ जोड़ा जा सकता है, कई अनुप्रयोगों के लिए रास्ता खोल सकता है जो न्यूरोसाइंटिस्ट के हाथों में उपकरणों के प्रदर्शनों की सूची का विस्तार कर सकते हैं, शुद्ध कोशिका आबादी से प्राप्त प्राथमिक संस्कृतियों की स्थापना से लेकर, जीन-अभिव्यक्ति विश्लेषण और जैव रासायनिक या कार्यात्मक रूप से न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के संदर्भ में अच्छी तरह से परिभाषित सेल उपप्रकारों पर, औषधीय उपचार या जीन चिकित्सा पर।
Introduction
जीन और दवा वितरण प्रौद्योगिकियां (जैसे वायरल वेक्टर और नैनोपार्टिकल्स) एक शक्तिशाली उपकरण बन गई हैं जिन्हें न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में बदले गए विशिष्ट आणविक रास्तों पर बेहतर अंतर्दृष्टि प्राप्त करने और अभिनव चिकित्सीयदृष्टिकोणों केविकास के लिए लागू किया जा सकता है 1,2,3। इन उपकरणों का अनुकूलन की मात्रा पर निर्भर करता है: (1) प्रशासन के विभिन्न मार्गों पर सीएनएस में प्रवेश की सीमा और (2) विशिष्ट सेल आबादी को लक्षित करना। हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण आमतौर पर विभिन्न सीएनएस क्षेत्रों में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन या फ्लोरोसेंट-टैग नैनोकणों और विभिन्न सेल प्रकारों में नैनोकणों की कल्पना करने के लिए लागू किए जाते हैं, जो विशिष्ट कोशिका मार्कर4,5के लिए इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा पहचाने जाते हैं। हालांकि यह दृष्टिकोण प्रशासित जीन या दवा वितरण उपकरणों के जैव वितरण के बारे में मूल्यवान जानकारी प्रदान करता है, तकनीक समय लेने वाली और श्रम-तीव्र हो सकती है क्योंकि इसकी आवश्यकता होती है: (1) ऊतक निर्धारण, क्रायोप्रिजर्वेशन या पैराफिन-एम्बेडिंग और टुकड़ा करने की क्रिया; (2) विशिष्ट सेलुलर मार्कर के लिए धुंधला कभी कभी एंटीजन पुनर्प्राप्ति की आवश्यकता होती है; (3) फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा अधिग्रहण, जो आमतौर पर एक ही प्रयोग के भीतर सीमित संख्या में विभिन्न मार्कर के विश्लेषण की अनुमति देता है; (4) ब्याज के संकेत के उचित मात्राकरण की अनुमति देने के लिए छवि प्रसंस्करण।
फ्लो साइटोमेट्री एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीक बन गई है जो सतह या इंट्रासेलर एंटीजन की अभिव्यक्ति के आधार पर कोशिका निलंबन में विभिन्न सेल फेनोटाइप के तेजी से मात्रात्मक मूल्यांकन की अनुमति देने के लिए बहुत विशिष्ट फ्लोरोसेंट मार्कर का लाभ उठाती है, बल्कि कार्यात्मक माप (जैसे, एपोप्टोसिस, प्रसार, सेल चक्र विश्लेषण, आदि की दर) भी है। फ्लोरोसेंट सक्रिय कोशिका छंटाई के माध्यम से कोशिकाओं का शारीरिक अलगाव भी संभव है, जिससे आगे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों (जैसे, सेल संस्कृति, RNAseq, जैव रासायनिक विश्लेषण आदि) की अनुमति मिलती है। 6,7,8.
ऊतक समरूपता विश्वसनीय और प्रजनन योग्य डाउनस्ट्रीम प्रवाह साइटोमेट्रिक मूल्यांकन की अनुमति देने के लिए एक एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए आवश्यक एक महत्वपूर्ण कदम है। वयस्क मस्तिष्क-ऊतक समरूपता के लिए विभिन्न तरीकों का वर्णन किया गया है, मुख्य रूप से माइक्रोग्लिया कोशिकाओं9,10,11को अलग करने के उद्देश्य से ; उन्हें समग्र रूप से दो मुख्य श्रेणियों में वर्गीकृत किया जा सकता है: (1) यांत्रिक विच्छेदन, जो अपने निकस से कोशिकाओं को अलग करने और अपेक्षाकृत समरूप एकल सेल निलंबन बनाने के लिए एक ड्लोव होमोजेनेज़र (डीएच) के माध्यम से पीसने या बाल काटने बल का उपयोग करता है, और (2) एंजाइमोमेटिक पाचन, जो प्रोटेओलिटिक एंजाइमों की उपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस पर कीमा बनाया हुआ ऊतक हिस्सा के ऊष्मायन पर निर्भर करता है, जैसे ट्राइप्सिन या पाकिन, एक काफी समरूप सेल निलंबन बनाने के लिए बाह्य मैट्रिक्स के क्षरण के पक्ष में12.
चाहे जिसविधि का उपयोग किया जाता है, ऊतक समरूपता के बाद एक शुद्धिकरण चरण की सिफारिश की जाती है ताकि डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में जाने से पहले घनत्व ढाल पर या चुंबकीय चयन9,12के माध्यम से मायलिन को हटाया जा सके।
यहां, हम पैकिन पाचन (पीडी) के आधार पर एक ऊतक प्रसंस्करण विधि का वर्णन करते हैं जिसके बाद घनत्व ढाल पर शुद्धि होती है, जो माउस मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी से समय-संवेदनशील तरीके से व्यवहार्य विषम कोशिका निलंबन प्राप्त करने के लिए अनुकूलित होती है और प्रवाह साइटोमेट्री के लिए उपयुक्त होती है। इसके अलावा, हम एक 9 रंग प्रवाह साइटोमेट्री पैनल और गेटिंग रणनीति हम प्रयोगशाला में अपनाया विभिन्न सीएनएस आबादी, रहते है/मृत कोशिकाओं या फ्लोरोसेंट संवाददाताओं के लिए सकारात्मकता जैसे हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन या रोडामिन रंगका की अनुमति का वर्णन । इस प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण को लागू करके, हम सेलुलर व्यवहार्यता और विभिन्न सेल प्रकारों की पैदावार के संरक्षण के मामले में ऊतक प्रसंस्करण के विभिन्न तरीकों की तुलना कर सकते हैं, यानी पीडी बनाम डीएच।
यहां हम जो विवरण प्रदान करते हैं, वह समरूपता प्रोटोकॉल और एंटीबॉडी संयोजन पर निर्णय लेने का निर्देश दे सकता है, जो ब्याज के विशिष्ट सेल प्रकार (एस) और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण (जैसे, तापमान-संवेदनशील) के आधार पर प्रवाह साइटोमेट्री पैनल में उपयोग करने के लिए अनुप्रयोग, विशिष्ट फ्लोरोसेंट मार्कर की ट्रैकिंग, इन विट्रो संस्कृति, कार्यात्मक विश्लेषण)।
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Protocol
यहां वर्णित सभी तरीकों को दाना फारबर कैंसर इंस्टीट्यूट (प्रोटोकॉल संख्या 16-024) की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया है।
1. प्रयोग के लिए आवश्यक समाधान ों की तैयारी
- बाँझ पानी के साथ 10x एचबीएसको कमजोर करके 1x हैंक का संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएसएस) तैयार करें। बर्फ पर समाधान को पूर्व-ठंडा करना। प्रत्येक नमूने के लिए समाधान के कम से कम 25 मीटर की आवश्यकता होती है।
- 10x बाँझ एचबीएसएसएस 1:10 को घनत्व ढाल माध्यम (यानी, पर्कॉल) के साथ मिलाकर आइसोटोनिक पर्कॉलस सॉल्यूशन (आईपीएस) तैयार करें। बर्फ पर पूर्व ठंडा।
नोट: आईपीएस 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 दिनों तक के लिए संग्रहीत किया जा सकता है। - फास्फेट-बफर्ड लवण [पीबीएस]) में फ्लो साइटोमेट्री (एफएसीएस) ब्लॉकिंग (बीएल) समाधान (1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन [बीएसए], 5% भ्रूण गोजातीय सीरम [एफबीएस] तैयार करें। बर्फ पर पूर्व ठंडा।
2. इंट्राकार्डियक परफ्यूजन और ऊतक विच्छेदन द्वारा पशु इच्छामृत्यु
नोट: आठ सप्ताह पुराने C57BL/6J चूहों, या तो सेक्स, प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया । ऊतक पाचन के साथ आगे बढ़ने से पहले, अंगों से रक्त संदूषण को खत्म करने के लिए पीबीएस समाधान के साथ परफ्यूजन किया जाता है।
- केटामाइन/जाइलाज़ीन (90−200 मिलीग्राम/किलो केटामाइन, 10 मिलीग्राम/किलो जाइलाज़ीन) के मिश्रण का उपयोग करके माउस को एनेस्थेटिज़ करें। माउस को उसकी पीठ पर रखें और प्रत्येक अंग को समर्थन के लिए नीचे टेप करें। निकासी पलटा की जांच करके संज्ञाहरण की पर्याप्त गहराई सत्यापित करें।
- उरोस्थि को बेनकाब करने के लिए छाती के इनलेट के स्तर पर मिडलाइन त्वचा चीरा बनाएं। उरोस्थि की नोक को समझने के लिए संदंश का उपयोग करें, फिर रिब पिंजरे के प्रत्येक तरफ एक 1 सेमी चीरा बनाएं। अंत में डायाफ्राम के माध्यम से काट दिया और दिल की कल्पना करने के लिए व्यापक रूप से पर्याप्त उरोस्थि खोलें।
- दाएं वेंट्रिकल द्वारा दिल को धीरे-धीरे समझने के लिए संदंश का उपयोग करें और इसे मिडलाइन पर उठाएं और छाती से थोड़ा बाहर जाएं।
- महाधमनी की ओर बाएं वेंट्रिकल की नोक में 23 ग्राम तितली सुई डालें और मजबूती से पकड़ें।
- 1x पीबीएस के साथ परफ्यूजन शुरू करें। सही auricle के माध्यम से पियर्स कैंची का उपयोग करने के लिए perfusate परिसंचरण से बाहर निकलने की अनुमति है । ऊतकों को स्पष्ट करने के लिए 1x पीबीएस के कम से 15 mL के साथ 3 mL/min पर पीबीएस की प्रवाह दर निर्धारित करें।
नोट: जिगर और मेसेंडेरिक रक्त वाहिकाओं की ब्लैंचिंग अच्छे perfusion के लक्षण हैं । यदि आवश्यक हो, तो प्रीफ्यूजन की मात्रा तब तक बढ़ सकती है जब तक कि दिल से बाहर निकलने वाला तरल पदार्थ रक्त से स्पष्ट न हो जाए, जिस बिंदु पर फ्लश लाइन को रोका जा सकता है। - परफ्यूजन के बाद रीढ़ की हड्डी से दिमाग को तोड़ कर साइकेन और संदंश से खोपड़ी से मस्तिष्क को हटा दें। विच्छेदन के दौरान दृश्यता और नियंत्रण बढ़ाने के लिए और बालों के संदूषकों पर ले जाने से बचने के लिए फर को हटा दें। पीबीएस से भरी 3 मिलीसी सिरिंज का उपयोग करके रीढ़ की हड्डी को अपने कॉलम से बाहर निकालें।
- प्रत्येक ऊतक को 6-अच्छी तरह से बहु-अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं में स्थानांतरित करें जो बर्फ-ठंडा 1x एचबीएसएसएस के 2 मिलील से भरा हुआ है और पाचन तक बर्फ पर रखें।
- मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी को दो हिस्सों में विभाजित करें, देशीयरेखा के साथ।
नोट: प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण की अनुमति देने के लिए प्रत्येक ऊतक का आधा समरूप है (नीचे दिए गए अनुभाग देखें); दूसरे आधे को वैकल्पिक विश्लेषण ों के लिए विभिन्न प्रसंस्करण के लिए सौंपा जा सकता है (उदाहरण के लिए, हिस्टोलॉजी के लिए पैराफॉर्मलडिहाइड फिक्सिव सॉल्यूशन में डूबा हुआ)।
3. मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी का एंजाइमैटिक पाचन
नोट: इस खंड में वर्णित मात्रा एक आधा मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी के पाचन के लिए पर्याप्त हैं।
- ऊतकों को 1−2 मिमी मोटे टुकड़ों में कीमा बनाने के लिए कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करें।
- ऊतक के टुकड़ों के संग्रह की अनुमति देने के लिए इसे पर्याप्त रूप से बड़ा बनाने के लिए कैंची की एक जोड़ी के साथ 1000 माइक्रोन पिपेट की नोक को काटें। 1x एचबीएसके साथ पिपेट टिप को प्री-कुल्ला करें। फिर एक 15 मिलील शंकुट्यूब के लिए कीमा बनाया हुआ ऊतक युक्त HBSS समाधान के 2 mL हस्तांतरण करने के लिए पिपेट का उपयोग करें ।
नोट: टिप के अंदर ऊतक के टुकड़ों की चिपचिपाहट को रोकने के लिए पिपेट टिप का पूर्व-रिंसिंग महत्वपूर्ण है। - बर्फ-ठंडा 1x एचबीएसएसएस के अतिरिक्त 2 मिलील के साथ अच्छी तरह से धोएं और ऊतक के टुकड़ों वाले संबंधित 15 मिलील शंकुीय ट्यूब के समाधान को स्थानांतरित करें।
- 5 मिन के लिए प्रत्येक नमूना 4 डिग्री सेल्सियस पर 250 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
- तंत्रिका ऊतक विच्छेदन किट (एनटीडीके) के एंजाइम मिश्रण 1 तैयार करें; सामग्री की तालिका) प्रति नमूना बफर एक्स के 1900 μL के साथ एंजाइम पी के 50 μL मिश्रण करके। गर्म एंजाइम पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिश्रण। इनक्यूबेट एंजाइम एंजाइम के पूर्ण सक्रियण के लिए अनुमति देने के लिए उपयोग से पहले कम से कम 10 00 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिश्रण करें।
- 15 मिलीएल शंकुई ट्यूब से अधिवनात को एस्पिरेट करें और प्रत्येक नमूने में 1.95 मिलीएल एंजाइम मिश्रण 1 जोड़ें। धीरे भंवर सुनिश्चित करने के लिए गोली फिर से निलंबित कर दिया है ।
- नमूनों को 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिन के लिए व्हील या शेकर पर इनक्यूबेट करते हैं।
- इस बीच, प्रति नमूना बफर वाई के 20 माइक्रोन के साथ एंजाइम ए के 10 माइक्रोन को मिलाकर एनटीडीके के एंजाइम मिक्स 2 तैयार करें; पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर समाधान को पूर्व-गर्म करना।
- एंजाइम मिक्स 1 के साथ ऊष्मायन के अंत में, प्रत्येक नमूने में एंजाइम मिक्स 2 के 30 माइक्रोन जोड़ें।
- धीरे से 1x एचबीएसएसएस के साथ 1000 माइक्रोन पिपेट टिप पूर्व कुल्ला के साथ ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा नमूनों को मिलाएं।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 सीन के लिए एक पहिए या शेकर पर नमूना इनक्यूबेट।
- ऊष्मायन के बाद एंजाइम मिक्स 1 और एंजाइम मिक्स 2 को निष्क्रिय करने के लिए प्रत्येक ट्यूब में 10 मिलीएल बर्फ-ठंडा 1x एचबीएसएस जोड़ें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 320 x ग्राम पर 10 मिन के लिए प्रत्येक नमूना अपकेंद्रित्र।
- अधिनेता को त्यागें; 7 mL की अंतिम मात्रा तक प्रत्येक ट्यूब में बर्फ-ठंडा 1x एचबीएसS जोड़ें और धीरे से भंवर द्वारा गोली को फिर से निलंबित करें।
- मलबा हटाने के लिए धारा 5 जारी रखें।
4. मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी का यांत्रिक समरूपीकरण
नोट: इस खंड में वर्णित मात्रा एक आधा मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी के समरूपीकरण के लिए पर्याप्त हैं। इस अनुभाग में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग नीचे चर्चा किए गए उपयोगकर्ता की आवश्यकता के आधार पर धारा 3 में वर्णित एक विधि विकल्प के रूप में किया जा सकता है।
- बर्फ पर सेट डाउंस टिश्यू ग्राइंडर(सामग्री की तालिका)के कांच के मोर्टार को प्री-चिल करें।
- मोर्टार में प्री-ठंडा 1x एचबीएसएसएस के 3 मिलील जोड़ें।
- ऊतक (मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी) को ग्लास मोर्टार में 6-अच्छी तरह से प्लेट के कुएं से स्थानांतरित करें, यह सुनिश्चित करें कि यह 1x एचबीएसएस में डूबा हुआ है और मोर्टार के तल पर बैठता है।
- धीरे मूसल के 10 स्ट्रोक के साथ ऊतक तोड़ एक मूसल बी के 10 स्ट्रोक के बाद एक नया 15 mL शंकुट्यूब में समरूप मिश्रण हस्तांतरण ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 320 x ग्राम पर 320 x ग्राम पर 10 मीटर के लिए प्री-चिल्ड 1x एचबीएसएसएस और अपकेंद्री का उपयोग करके 10 मिलीग्राम की अंतिम मात्रा में ट्यूब भरें।
- अधिनायक को एस्पिरेट करें और प्रत्येक ट्यूब में बर्फ-ठंडा 1x एचबीएसएसएस 7 मिलीएल की अंतिम मात्रा तक जोड़ें और भंवर द्वारा गोली को धीरे से फिर से निलंबित करें।
- मलबा हटाने के लिए धारा 5 जारी रखें।
5. मलबा हटाने
नोट: मलबे को हटाना, मुख्य रूप से पचाए गए ऊतक और मायलिन म्यान से बना है, बाद के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषणों के लिए ऊतक के कुशल धुंधला होने की अनुमति देने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है।
- किसी भी पचा ऊतक हिस्सा को दूर करने के लिए एक 70 μm सेल छलनी के माध्यम से प्रत्येक नमूना फ़िल्टर करें। यह कदम विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, खासकर जब रीढ़ की हड्डी के ऊतकों के साथ काम कर रहे हैं क्योंकि इन नमूनों में अपाच्य तंत्रिका टुकड़े या मेनिंग्स होने की संभावना अधिक होती है जो बाद के चरणों को प्रभावित कर सकती हैं।
- सुनिश्चित करें कि अंतिम मात्रा प्रत्येक नमूना ट्यूब में 7 mL है। यदि नहीं, तो 7 मीटर तक बर्फ-ठंडा 1x एचबीएसएसएस से भरें।
- 30% अंतिम एकाग्रता पर घनत्व ढाल माध्यम युक्त समाधान के 10 मिलील की अंतिम मात्रा बनाने के लिए प्रत्येक नमूने में पूर्व-ठंडा आईपीएस के 3 मिलील जोड़ें। धीरे भंवर नमूनों को यकीन है कि वे समरूप रूप से मिश्रित कर रहे हैं ।
- 18 डिग्री सेल्सियस पर 700 x ग्राम पर 15 मिन के लिए सेंट्रलाइज नमूने से सेंट्रलाइज का त्वरण 7 और ब्रेक से 0 तक सेट करना सुनिश्चित हो गया है।
नोट: सेंट्रलिफायरेशन में लगभग 30 00 लगना चाहिए। - नाजुक रूप से अपकेंद्रित्र से नमूनों को हटा दें।
नोट: मलबे और मायलिन से बना एक सफ़ेद डिस्क समाधान की सतह पर तैरते हुए दिखाई देनी चाहिए। एक गोली (ब्याज की कोशिकाओं युक्त) ट्यूब के तल पर दिखाई देना चाहिए। - ध्यान से मलबे के सभी सफ़ेद डिस्क और फिर अतिशयोक्ति के बाकी यकीन है कि गोली उखाड़ फेंकना नहीं बनाने के बाकी aspirate । अनजाने में इसे उखाड़ फेंकने के जोखिम से बचने के लिए सेल पैलेट के शीर्ष पर समाधान के बारे में 100 माइक्रोन छोड़ दें।
- FACS बीएल के 1 mL जोड़ें, एक १००० μL पिपेट टिप के साथ ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा गोली को फिर से निलंबित करें और १.५ mL ट्यूबों के लिए नमूने हस्तांतरण ।
- कमरे के तापमान (आरटी) पर 450 x ग्राम पर 5 न्यूनतम के लिए सेंट्रलाइज।
- धीरे-धीरे सुपरनेटेंट को फिर से अस्मेय करें और डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के साथ उपयुक्त बफर संगत में गोली को फिर से निलंबित करें (कई सेल प्रकारों के प्रवाह साइटोमेट्रिक मूल्यांकन के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल के लिए धारा 6 देखें)।
6. कई सेल प्रकारों के प्रवाह साइटोमेट्रिक मूल्यांकन के लिए धुंधला
- FACS बीएल के ३५० μL के साथ चरण ५.९ में प्राप्त गोली को फिर से निलंबित करें । 5 μg/mL की अंतिम एकाग्रता पर प्रत्येक नमूने में एफसी ब्लॉक जोड़ें ।
नोट: नमूना के कम से कम 100 μL एक धुंधला के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, विश्वसनीय विश्लेषण की अनुमति के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को संसाधित करने के लिए सुनिश्चित करें। - धुंधला के साथ आगे बढ़ने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 min के लिए नमूना इनक्यूबेट।
- टेबल 1के अनुसार एंटीबॉडी मिक्स तैयार करें।
- प्रत्येक ट्यूब में एंटीबॉडी मिक्स, 5 एस के लिए भंवर और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 min के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें।
- आरटी में 450 x ग्राम पर 5 मिन के लिए प्रत्येक ट्यूब, भंवर और अपकेंद्री के लिए पीबीएस के 1 mL जोड़ें।
- इस बीच टेबल 1के अनुसार स्ट्रेप्टाविडिन मिक्स तैयार करें ।
- अतिशयोक्ति को त्यागें और चरण 6.6 में तैयार स्ट्रेप्टाविडिन मिश्रण में गोली को फिर से निलंबित करें। प्रत्येक नमूने के लिए, चरण 6.4 में धुंधला के लिए उपयोग किए जाने वाले समान मात्रा का उपयोग करें।
- 5 एस के लिए भंवर और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए नमूने इनक्यूबेट।
- आरटी में 450 x ग्राम पर 5 मिन के लिए प्रत्येक ट्यूब, भंवर और अपकेंद्री के लिए पीबीएस के 1 mL जोड़ें।
- सुपरनेटेंट को त्यागें और एफएसीएस बीएल में पैलेट को फिर से सस्पेंड करें। 100 माइक्रोन के लिए एफएसीएस बीएल के 300 माइक्रोन का इस्तेमाल करें।
- प्रत्येक नमूने में 7-अमीनो-ऐक्टिनोमाइसिन डी (7-एएडी) समाधान जोड़ें। चरण 6.10 में तैयार नमूने के प्रत्येक 300 माइक्रोन के लिए 7-एएडी के 5 माइक्रोन का उपयोग करें।
- साइटोफ्लोरीमेट्रिक विश्लेषण तक अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने स्टोर करें। नमूना तैयारी से 16 घंटे के भीतर विश्लेषण करें, गारंटी और 60% सेल व्यवहार्यता के लिए।
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Representative Results
हमने डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त विभिन्न व्यवहार्य कोशिका प्रकारों को पुनः प्राप्त करने में दक्षता का परीक्षण करने के लिए माउस मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी पर लागू दो अलग-अलग समरूपता विधियों (डीएच बनाम पीडी) की तुलना की। ऐसा करने के लिए, हमने एक ही नमूने में, माइक्रोग्लिया, लिम्फोसाइट्स, न्यूरॉन्स, एस्ट्रोसाइट्स, ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स और एंडोथेलियम सहित विभिन्न सीएनएस सेल प्रकारों को चित्रित करने के लिए डिज़ाइन किए गए 9-रंग प्रवाह साइटोमेट्री पैनल का शोषण किया।
मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के ऊतकों को विभिन्न चूहों (एन ‧ 6) से प्राप्त किया गया था, दो हिस्सों में विभाजित देशांतर, तौला और या तो यांत्रिक व्यवधान लागू करने के द्वारा समानांतर में संसाधित Dounce समरूपता (DH विधि) या धीरे कीमा बनाया हुआ है और जंजामेटिक रूप से पाओपाइन (पीडी विधि)(चित्र ा 1ए)के आधार पर वाणिज्यिक NTDK का उपयोग कर । मलबे को हटाने के बाद, मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी से कोशिकाओं को क्रमशः 1/10 या 1/2−1/5 पतला किया गया था, Tripan नीले रंग में एक Neubauer कक्ष के साथ सेल उपज और व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए(चित्रा 1बी, सी)। डीएच विधि कुल मिलाकर मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी दोनों से एक उच्च कोशिका उपज का उत्पादन किया । हालांकि, प्राप्त कोशिकाओं के बहुमत मर चुके थे, मस्तिष्क में व्यवहार्य कोशिकाओं के केवल 13.8% ± 3.3% और रीढ़ की हड्डी में 10.5% ± 1.5%(चित्रा 1बी)के परिणामस्वरूप। मृत कोशिकाओं के कई कुल का गठन(चित्रा 1सी); यह घटना अत्यधिक परस्पर सेल नेटवर्क (सीएनएस वैस्कुलचर को अस्तर करने वाली एंडोथेलियल और ग्लियल कोशिकाओं की उपस्थिति के कारण हो सकती है) जिसे डीएच के साथ लागू बाल काटने वाले बल द्वारा अलग नहीं किया जा सकता था। मृत्यु कोशिकाओं के इन समुचुओं की संभावना घनत्व ढाल द्वारा नहीं हटाया गया था और साइटोफ्लोरीमेट्रिक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल अंतिम सेल गोली में समाप्त हो गया । इसके विपरीत, पीडी विधि ने सेलुलर व्यवहार्यता (मस्तिष्क में 90.6% ± 0.6% और रीढ़ की हड्डी में 85.2% ± 2.8%) का समग्र बेहतर संरक्षण निर्धारित किया। पापिन बाह्य मैट्रिक्स और सेल-टू-सेल जंक्शनों को कुशलतापूर्वक पचाने में सक्षम है, जिससे अधिक समान एकल सेल निलंबन होता है। कीमा बनाने की प्रक्रिया के दौरान मरने वाली कुछ कोशिकाओं को पाकिन द्वारा और पचाया जा सकता है जिससे कोशिका मलबे का गठन होता है जो घनत्व ढाल के माध्यम से अधिक कुशलता से अलग होते हैं। कुल मिलाकर, इस संभावना पीडी विधि के साथ सेल व्यवहार्यता का एक बेहतर संरक्षण निर्धारित किया है, DH विधि के साथ तुलना में थोड़ा कम सेल उपज के बावजूद ।
मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी की कोशिका निलंबन से 100 माइक्रोन का एक एलिकोट एंटीबॉडी मिश्रण(टेबल 1)से दाग दिया गया था और 9-रंग पैनल के साथ प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया गया था। चित्रा 2ए मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी कोशिका निलंबन से विभिन्न कोशिका प्रकारों की पहचान करने के लिए उपयोग की जाने वाली गेटिंग रणनीति को दर्शाता है। संक्षेप में, पहला गेट छोटे सेल मलबे को छोड़कर फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी) और साइड स्कैटर (एसएससी) के अनुसार सामान्य आबादी की पहचान करता है। फिर लाइव (7-AAD-) कोशिकाओं की पहचान की जाती है। कुल लाइव सेल आबादी के भीतर, सीडी 45 + और सीडी 45-कोशिकाओं पर प्रकाश डाला जाता है। CD45 + गेट के भीतर, CD45+CD11b + माइक्रोग्लिया/मैक्रोफेज और CD45+CD11b-लिम्फोसाइट्स की पहचान की जाती है। सीडी45-गेट के भीतर, कोशिकाओं को ACSA2 (एस्ट्रोसाइट्स) या O4 (ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स) के लिए सकारात्मकता के अनुसार भेदभाव किया जाता है। CD45-ACS2-O4- कोशिकाओं को आगे Thy1 (न्यूरॉन्स) या CD31 (एंडोथेलियम) के लिए सकारात्मकता के अनुसार विभाजित कर रहे हैं। शेष Thy1-CD31- कोशिकाओं को "अन्य सेल प्रकार" के रूप में वर्गीकृत किया जाता है, जो हमारे एंटीबॉडी मिश्रण द्वारा हिसाब नहीं देते हैं।
जैसा कि चित्रा 2बीमें दिखाया गया है, डीएच विधि के साथ मस्तिष्क से प्राप्त व्यवहार्य कोशिकाओं का लगभग 38% और रीढ़ की हड्डी से प्राप्त व्यवहार्य कोशिकाओं में से लगभग 32% हेमेटोपोइटिक मूल (सीडी45 +) के थे। दूसरी ओर, पीडी विधि ने दोनों ऊतकों में व्यवहार्य कोशिकाओं की काफी उच्च उपज को पुनः प्राप्त करने की अनुमति दी, जिसमें गैर-हेमेटोपोइटिक सीडी 45-कोशिकाओं (मस्तिष्क में लगभग 82% और रीढ़ की हड्डी में 92%) द्वारा प्रतिनिधित्व किया गया एक बहुत बड़ा अंश है। उल्लेखनीय है, CD45+CD11b + माइक्रोग्लिया/मैक्रोफेज डीएच विधि(चित्रा 2सी)के साथ सबसे प्रचुर मात्रा में व्यवहार्य सेल अंश का प्रतिनिधित्व किया । हालांकि, पीडी विधि ने सेल प्रकारों का अधिक विषम प्रतिनिधित्व तैयार किया, जिसमें एसीएसए + एस्ट्रोसाइट्स, ओ4 + ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स, सीडी 31 + एंडोथेलियल कोशिकाएं और थाय1 + न्यूरॉन्स(चित्रा 2सी)शामिल हैं। दिलचस्प बात यह है कि डीएच विधि के साथ व्यवहार्य न्यूरॉन्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं का शायद ही पता लगाया जा सकता था।
डीएच विधि ऊतक समरूपता प्राप्त करने के लिए कांच की मूसल और ड्रोग समरूपता के मोर्टार के बीच ऊतक के यांत्रिक पीसने पर निर्भर करती है। यह कुछ कतरनी तनाव का कारण बन सकता है जो न्यूरोवकुलचर की न्यूरॉन्स या कोशिकाओं जैसे बड़े या बहुत संवेदनशील कोशिकाओं की व्यवहार्यता को नुकसान और प्रभावित करेगा। हमने एंटीबॉडी पैनल(चित्रा 3)के माध्यम से पहचाने गए प्रत्येक सेल उपजनसंख्या के भीतर सेलुलर व्यवहार्यता (7-AAD-कोशिकाओं का प्रतिशत) का मूल्यांकन किया। मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी से अलग हेमेटोपोइटिक कोशिकाएं (सीडी45 +) माइक्रोग्लिया/मैक्रोफेज (सीडी45 +सीडी11बी+) और अन्य गैर-माइलॉयड कोशिकाओं (सीडी45 +CD11b-) सहित, जिसका उपयोग किया गया था(चित्रा 3ए)। इसके विपरीत, डीएच विधि ने सीडी 45-आबादी(चित्रा 3बी)की व्यवहार्यता में उल्लेखनीय कमी का निर्धारण किया जबकि पीडी विधि ने विभिन्न सीएनएस सेल प्रकारों का व्यापक संरक्षण निर्धारित किया। विस्तार से, न्यूरॉन्स और एंडोथेलियल कोशिकाएं डीएच से सबसे अधिक प्रभावित होने वाली उपआबादी थीं और पीडी विधि द्वारा संरक्षित थीं।
उचित नमूना तैयार करने और कुशल मलबे को हटाने के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण कदमों की एक योजनाबद्ध प्रस्तुति चित्र4में संक्षेप में प्रस्तुत की जाती है ।
चित्रा 1: मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी से प्राप्त कोशिकाओं की उपज समरूपता विधि से प्रभावित होती है।
(A)प्रायोगिक रूपरेखा। चूहों को इंट्रा-वैस्कुलर परिसंचारी रक्त कोशिकाओं को हटाने के लिए पीबीएस के साथ एनेस्थेटाइज्ड और इंट्राकार्डियकैली किया गया था। मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी को ध्यान से विच्छेदित किया गया था और दो हिस्सों में देशीयरूप से विभाजित किया गया था। ऊतकों को मुख्य पाठ में विस्तृत रूप से या तो Dounce होमोजेनेज़र (डीएच) या पाकिन पाचन (पीडी) का उपयोग करके समरूप किया गया था। इसके बाद मायलिन और टिश्यू मलबे को 30% घनत्व ढाल माध्यम समाधान में केंद्रीकरण द्वारा हटा दिया गया जिसके परिणामस्वरूप एक विषम कोशिका निलंबन जिसमें विभिन्न सेल प्रकार होते हैं जिनका उपयोग प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा किया जा सकता है। (ख)हिस्टोग्राम डीएच या पीडी विधि के साथ ऊतक समरूपता पर मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी से प्राप्त कोशिकाओं की उपज दिखारहा है । प्रति शर्त कम से कम 6 जानवरों के मतलब ± एसईएम का प्रतिनिधित्व किया जाता है। (ग)ट्रीपैन ब्लू पॉजिटिव (डेड) के रिप्रेजेंटेटिव ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप फोटोमाइक्रोग्राफ और दो तरीकों से मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी से प्राप्त नकारात्मक (लाइव) कोशिकाएं । स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: सीएनएस से प्राप्त विभिन्न सेल प्रकारों के सापेक्ष अनुपात ऊतक समरूपता विधि से प्रभावित होते हैं।
(A)मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी से प्राप्त सेल तैयारियों के भीतर विभिन्न सेल उपजनसंख्या की पहचान करने के लिए गेटिंग रणनीति दिखाने वाले प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री भूखंड: कोशिका आबादी एफएससी और एसएससी भौतिक मापदंडों पर गेट की जाती है, जिसके बाद 7-AAD-लाइव कोशिकाओं के लिए चयन होता है; फिर कोशिकाओं को सीडी 45 मार्कर के लिए सकारात्मकता के अनुसार भेदभाव किया जाता है; माइक्रोग्लिया/मैक्रोफेज की पहचान सीडी45 + अंश के भीतर CD11b + कोशिकाओं के रूप में की जाती है जबकि लिम्फोसाइट्स CD11b-होते हैं । एस्ट्रोसाइट्स, ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स, एंडोथेलियल और न्यूरोनल कोशिकाओं की पहचान क्रमशः सीडी45-के भीतर ACSA2+, O4+, CD31+ या Thy1+ कोशिकाओं के रूप में की जाती है। (ख)एचएच या पीडी विधि के साथ समरूपीकरण पर मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी में, कुल जीवित या मृत कोशिका आबादी के भीतर CD45 + और CD45-कोशिकाओं के प्रतिशत को दर्शाते हुए हिस्टोग्राम। रेखांकन ों में दिखाए गए परिणामों का सांख्यिकीय विश्लेषण तालिका 2में बताया गया है । (ग)पाई चार्ट कुल कोशिका आबादी के भीतर विभिन्न व्यवहार्य कोशिका उपप्रकारों के प्रतिशत को दिखाते हुए, मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी में डीएच या पीडी विधि के साथ समरूपता पर। कुल मृत कोशिकाओं का प्रतिशत भी बताया गया है। एन ♫ 6. CD45+CD11b+ = माइक्रोग्लिया/मैक्रोफेज; CD45+CD11b- = लिम्फोसाइट्स/नॉन-मायलाइड सेल; CD45-ACSA2 + = एस्ट्रोसाइट्स; CD45-O4 + = ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स; CD45-Thy1 + = न्यूरॉन्स; CD45-CD31+ = एंडोथेलियल कोशिकाएं; अन्य = कोशिकाओं को उपरोक्त सभी मार्कर के लिए नकारात्मक। रेखांकन ों में दिखाए गए परिणामों का सांख्यिकीय विश्लेषण तालिका 2में बताया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: विभिन्न सीएनएस सेल प्रकारों की सेलुलर व्यवहार्यता लागू समरूपता विधि से प्रभावित होती है।
(A)सीडी45 + हेमेटोपोइटिक आबादी के भीतर 7-AAD-लाइव कोशिकाओं का प्रतिशत दिखाते हुए हिस्टोग्राम जिसमें CD11b + माइक्रोग्लिया/मैक्रोफेज और CD11b-गैर-माइलॉयड कोशिकाएं शामिल हैं । (ख)हिस्टोग्राम सीडी 45 के भीतर 7-AAD-लाइव कोशिकाओं का प्रतिशत दिखाता है- एस्ट्रोसाइट्स, ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स, न्यूरॉन्स, एंडोथेलियल और अन्य सेल प्रकारों सहित गैर-हेमेटोपोइटिक आबादी। * = पी एंड एलटी; 0.05, **= पी एंड एलटी; 0.01, डीएच और पीडी के बीच मान-व्हिटनी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: उचित ऊतक प्रसंस्करण के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण चरणों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व।
उचित ऊतक प्रसंस्करण और मलबे को कुशल हटाने के लिए आवश्यक सबसे महत्वपूर्ण चरणों की एक सूची दिखाई गई है। 30% घनत्व ढाल पर नमूनों के केंद्रीकरण के बाद गठित मलबे डिस्क (काला तीर) और सेल पैलेट (नीला तीर) की ठीक से पहचान करना महत्वपूर्ण है। मलबे डिस्क, एक साथ अलौकिक के बाकी के साथ, ध्यान से नमूना नुकसान से बचने के लिए सेल गोली उखाड़ फेंकने के बिना आकांक्षा द्वारा हटा दिया जाना चाहिए । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| एंटीबॉडी मिक्स | प्रारंभिक एकाग्रता (μg/mL) | अंतिम एकाग्रता (μg/mL) | कमजोर पड़ने का कारक |
| विरोधी CD45/BV510 | 200 | 2 | 100 |
| विरोधी CD11b/APC.780 | 200 | 2 | 100 |
| विरोधी CD31/BV421 | 200 | 2 | 100 |
| विरोधी ACSA2/एपीसी | 150 | 0.75 | 200 |
| विरोधी O4/बायोटिन | ना | ना | 40 |
| विरोधी CD90.2/पीई । Cy7 | 200 | 2 | 100 |
| स्ट्रेप्टाविडिन मिक्स | प्रारंभिक एकाग्रता (μg/mL) | अंतिम एकाग्रता (μg/mL) | कमजोर पड़ने का कारक |
| स्ट्रेप्टाविडिन/एलेक्सा 680 | 1000 | 1 | 1000 |
तालिका 1: प्रवाह साइटोमेट्री धुंधला के लिए घोला जा सकता है की तैयारी के लिए नुस्खा। तालिका कई सेल प्रकारों के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषणों की अनुमति देने के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी और स्ट्रेप्टाविडिन की इष्टतम सांद्रता का वर्णन करती है। कृपया तालिका में उल्लिखित प्रत्येक अभिकर्ता की सूची संख्याओं पर विवरण के लिए सामग्री की तालिका का उल्लेख करें।
| चित्रा 2B के लिए आंकड़े | ||||||||||
| मस्तिष्क (% कोशिकाएं) | ||||||||||
| सीडी45+ | सीडी45- | |||||||||
| रहना | मृत | रहना | मृत | |||||||
| विधि | मतलब | ± एसईएम | मतलब | ± एसईएम | मतलब | ± एसईएम | मतलब | ± एसईएम | ||
| Dh | 15.20 | ± 2.32 | 1.90 | ± 0.30 | 24.78 | ± 4.045 | 51.58 | ± 6.033 | ||
| पीडी | 15.20 | ± 2.65 | 2.33 | ± 1.10 | 68.53 | ± 3.618 | 13.93 | ± 2.180 | ||
| मान-व्हिटनी | एन एस | एन एस | *** | ** | ||||||
| पी-वैल्यू | 0.9989 | 0.738 | 0.0006 | 0.0015 | ||||||
| रीढ़ की हड्डी (% कोशिकाएं) | ||||||||||
| सीडी45+ | सीडी45- | |||||||||
| रहना | मृत | रहना | मृत | |||||||
| विधि | मतलब | ± एसईएम | मतलब | ± एसईएम | मतलब | ± एसईएम | मतलब | ± एसईएम | ||
| Dh | 15.00 | ± 8.21 | 1.41 | ± 0.11 | 31.64 | ± 8.21 | 51.95 | ± 16.52 | ||
| पीडी | 7.49 | ± 4.99 | 1.15 | ± 0.68 | 84.27 | ± 9.39 | 7.09 | ± 3.75 | ||
| मान-व्हिटनी | एन एस | एन एस | * | एन एस | ||||||
| पी-वैल्यू | 0.5548 | 0.7236 | 0.0438 | 0.1144 | ||||||
| चित्रा 2C के लिए आंकड़े | |||||||||||||||||
| मस्तिष्क (% कोशिकाएं) | |||||||||||||||||
| सीडी45+ | सीडी45- | ||||||||||||||||
| CD11b + | CD11b- | ACSA2 | O4 | तेय1 | सीडी31 | अन्य | मृत | ||||||||||
| विधि | मतलब | ± एसईएम | मतलब | ± एसईएम | मतलब | ± एसईएम | मतलब | ± एसईएम | मतलब | ± एसईएम | मतलब | ± एसईएम | मतलब | ± एसईएम | मतलब | ± एसईएम | |
| Dh | 19.32 | ± 3.88 | 1.17 | ± 0.27 | 9.52 | ± 2.68 | 3.41 | ± 1.01 | 1.39 | ± 0.77 | 0.48 | ± 0.29 | 10.52 | ± 4.49 | 53.83 | ± 5.79 | |
| पीडी | 10.88 | ± 2.03 | 1.65 | ± 0.48 | 8.17 | ± 2.66 | 6.54 | ± 0.76 | 6.37 | ± 1.76 | 8.27 | ± 1.25 | 33.28 | ± 6.34 | 23.72 | ± 5.31 | |
| मान-व्हिटनी | एन एस | एन एस | एन एस | * | ** | *** | ** | ** | |||||||||
| पी-वैल्यू | 0.1206 | 0.4819 | 0.5894 | 0.0264 | 0.0093 | 0.0003 | 0.0084 | 0.0022 | |||||||||
| रीढ़ की हड्डी (% कोशिकाएं) | |||||||||||||||||
| सीडी45+ | सीडी45- | ||||||||||||||||
| CD11b + | CD11b- | ACSA2 | O4 | तेय1 | सीडी31 | अन्य | मृत | ||||||||||
| विधि | मतलब | ± एसईएम | मतलब | ± एसईएम | मतलब | ± एसईएम | मतलब | ± एसईएम | मतलब | ± एसईएम | मतलब | ± एसईएम | मतलब | ± एसईएम | मतलब | ± एसईएम | |
| Dh | 21.23 | ± 6.25 | 2.51 | ± 0.57 | 4.26 | ± 2.34 | 9.40 | ± 1.89 | 2.82 | ± 1.51 | 0.97 | ± 0.50 | 22.74 | ± 9.04 | 35.28 | ± 1.89 | |
| पीडी | 9.63 | ± 1.67 | 2.77 | ± 0.48 | 4.23 | ± 1.59 | 28.62 | ± 3.57 | 1.26 | ± 0.49 | 6.94 | ± 2.14 | 26.39 | ± 8.17 | 19.09 | ± 4.76 | |
| मान-व्हिटनी | एन एस | एन एस | एन एस | * | एन एस | * | एन एस | एन एस | |||||||||
| पी-वैल्यू | 0.1905 | 0.9999 | 0.7302 | 0.0159 | 0.7302 | 0.0317 | 0.7302 | 0.1111 | |||||||||
तालिका 2: डीएच या पीडी विधि लागू करके प्राप्त विभिन्न आबादी का सांख्यिकीय विश्लेषण। तालिका चित्र ा 2बी और चित्रा 2सीमें दिखाए गए रेखांकन के आंकड़ों का वर्णन करती है । औसत और कम से छह स्वतंत्र नमूनों के SEM का प्रतिनिधित्व किया है। प्रत्येक तुलना के लिए लागू सांख्यिकीय परीक्षण पर पी मूल्य और विवरण की भी सूचना दी जाती है।
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Discussion
इसमें हम माउस मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी से सबसे प्रासंगिक सीएनएस कोशिकाओं में से कुछ के सह-शुद्धि और समवर्ती प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। परंपरागत रूप से, नैनोकणों के वितरण या सीएनएस5,13में वायरल वैक्टर की ट्रांसड्यूक्शन दक्षता का वर्णन करने या पैथोलॉजी के दौरान या औषधीय उपचार14पर विशिष्ट कोशिका प्रकारों में होने वाले रूपात्मक और आणविक परिवर्तनों पर अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण लागू किए गए हैं। हालांकि, हिटोलॉजी में प्रक्रियाका अभाव है और यह एक ही हिस्टोलॉजिकल नमूनों में कई सुविधाओं की व्यापक जांच की अनुमति नहीं देता है, मार्कर की सीमित संख्या के कारण जिसे समवर्ती रूप से विश्लेषण किया जा सकता है। हमारा दृष्टिकोण पारंपरिक हिस्टोलॉजिक विश्लेषणों के पूरक हो सकते हैं और इसे व्यक्तिगत नमूनों से प्राप्त की जा सकने वाली जानकारी के संकलन का विस्तार करने के लिए कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों (छंटाई, प्राथमिक संस्कृति, जैव रासायनिक या अगली पीढ़ी के अनुक्रमण विश्लेषण) के साथ जोड़ा जा सकता है। हालांकि, नीचे सूचीबद्ध कुछ प्रमुख कारकों पर विचार किया जाना चाहिए क्योंकि वे इस दृष्टिकोण की सफलता को गंभीर रूप से प्रभावित कर सकते हैं:
- ऊतक शुरू करने की मात्रा। हमने सेल अलगाव को आधा रीढ़ की हड्डी या आधा मस्तिष्क के साथ शुरू करने के लिए अनुकूलित किया है। हमारे अनुभव में, पीडी विधि के साथ वयस्क 8 सप्ताह पुराने माउस से आधा मस्तिष्क या आधा रीढ़ की हड्डी प्रसंस्करण मस्तिष्क से 1−6 x 106 व्यवहार्य कोशिकाओं और घनत्व ढाल चरण के बाद रीढ़ की हड्डी से लगभग 0.1−0.5 x 106 व्यवहार्य कोशिकाओं की पैदावार करता है। हम 8 सप्ताह से छोटे नवजात शिशु या चूहों से ऊतकों पर पीडी विधि लागू करने के बाद कोशिकाओं उपज मापा नहीं है । हालांकि, हमारे हाथों में, परिणाम शुरू ऊतक के वजन के आनुपातिक है । इस प्रकार, छोटे जानवरों के लिए (जैसे, 10 दिन पुराने पिल्ले) पूरे मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी विश्वसनीय डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए एक अच्छा सेल उपज की गारंटी के लिए संसाधित किया जाना चाहिए । यदि आवश्यक हो, तो कई जानवरों से ऊतकों को पूल करने से सेल की पैदावार बढ़ाने में मदद मिलेगी। हमारे अनुभव में, इस प्रोटोकॉल को चूहों के मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी से कोशिकाओं को अलग करने के लिए संशोधनों के बिना भी लागू किया जा सकता है, जहां तक ऊतक शुरू करने के प्रति वजन का उपयोग किया अभिकर्मकों के अनुपात का सम्मान किया जाता है। ऊतकों के लिए 250 मिलीग्राम से अधिक वजन, कई नमूनों में ऊतक को स्केलिंग या विभाजित करने का सुझाव दिया जाता है (प्रत्येक भार और 250 मिलीग्राम) का सुझाव दिया जाता है।
- घनत्व ढाल से पहले मेनिंग्स/अवशिष्ट ऊतक का हिस्सा हटाना । हमारे अनुभव में, पीडी विधि इसके द्वारा वर्णित कुशलता से meninges या बहुत अत्यधिक myelinated ऊतकों जैसे नसों और तंत्रिका रीढ़ की हड्डी से उभरने जड़ों को पचाने में सक्षम नहीं है । जब ये ऊतक मौजूद होते हैं, तो मलबे को हटाने से पहले, एंजाइमैटिक पाचन चरणों के बाद प्राप्त सेल निलंबन में कुछ अपाच्य चिपचिपा टुकड़े रह सकते हैं। एक 70 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से समाधान को फ़िल्टर करके इन टुकड़ों को हटाना (जैसा कि चरण 5.1 में सुझाया गया है) एक सफल सेल तैयारी के लिए महत्वपूर्ण है। वास्तव में, यदि हटाया नहीं जाता है, तो मेनिंग्स या ऊतक टुकड़े कुशल घनत्व ढाल जुदाई में बाधा डालेंगे जिसके परिणामस्वरूप खराब सेल पैदावार होगी।
- समय, तापमान और बंध्यता। सुझाव के रूप में सही तापमान सेटिंग्स और ऊष्मायन का उपयोग करके समय पर फैशन में सभी चरणों का प्रदर्शन करना बहुत महत्वपूर्ण है। यह नमूने की उच्च कोशिका व्यवहार्यता और अखंडता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन के आधार पर, एक बाँझ हुड के नीचे और बाँझ रिएजेंट्स के साथ सभी चरणों का प्रदर्शन आवश्यक हो सकता है (उदाहरण के लिए, प्राथमिक कोशिका संस्कृतियों की स्थापना)। सुझाए गए समय (धारा 3) से परे एंजाइमैटिक पाचन समाधान में विस्तारित ऊष्मायन के परिणामस्वरूप कोशिका व्यवहार्यता की एक बूंद हो सकती है। कुछ सतह एंटीजन के एपिटोप पैपिन के प्रति संवेदनशील हो सकते हैं जिसके परिणामस्वरूप प्रवाह साइटोमेट्री में सिग्नल की हानि होती है। इस लेख में वर्णित लोगों के अलावा अतिरिक्त मार्कर की आवश्यकता वाले विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए, प्रयोग शुरू करने से पहले विभिन्न एंटीबॉडी क्लोन के प्रदर्शन का परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है। यह बताया गया है कि घनत्व ढाल माध्यम में एंडोटॉक्सिन के कुछ निशान हो सकते हैं जो प्रतिरक्षा कोशिकाओं (माइक्रोग्लिया/मैक्रोफेज) की सक्रियता को ट्रिगर कर सकते हैं। जब भी इन आबादी का विश्लेषण किया जाता है, तो प्रक्रिया द्वारा प्रेरित संभावित प्रभावों को बाहर करने के लिए, जब भी इन आबादी का विश्लेषण किया जाता है, तो उचित आंतरिक नियंत्रण हमेशा प्रयोगों में जोड़े जाने चाहिए। मलबे को हटाने के कदम के तुरंत बाद सुझाए गए तापमान और वाशिंग डेंसिटी ग्रेडिएंट मध्यम बचा के साथ चिपके हुए आमतौर पर खुलकर प्रतिरक्षा कोशिकाओं को सक्रियण से बचने के लिए पर्याप्त है। हालांकि, यदि डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन (उदाहरण के लिए, RNAseq या कार्यात्मक विश्लेषण) इस चरण से प्रभावित होते हैं, तो उपयोगकर्ता को कम एंडोटॉक्सिन घनत्व ढाल माध्यम तैयारी (सामग्री की तालिकामें सुझाया) पर स्विच करना चाहिए।
- FACS एंटीबॉडी और मशीन। प्रवाह साइटोमेट्री धुंधला प्रोटोकॉल इसके द्वारा प्रस्तुत एंटीबॉडी सांद्रता और रंग conjugations का उपयोग करता है जो हमारी प्रयोगशाला अनुभव में प्राप्त कोशिका पैदावार के साथ सबसे अच्छा काम करता है और हमारे संस्थान में उपलब्ध FACS मशीनों के साथ। उपयोगकर्ता को एक नया प्रयोग शुरू करने से पहले अपने हाथों में एंटीबॉडी को टिटर करना चाहिए, क्योंकि एकाग्रता को थोड़ा समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, हम प्रत्येक प्रयोग में हमेशा एकल रंग धुंधला नियंत्रण का उपयोग करने के लिए सत्यापित करें कि सभी एंटीबॉडी और क्षति मशीन के मुआवजा सेट-अप पर्याप्त रूप से काम कर रहा है प्रोत्साहित करते हैं । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि न्यूरॉन्स का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाने वाला सीडी90 (तेरा) एंटीजन माउस तनाव के आधार पर दो अलग-अलग आइसोटाइप, अर्थात् CD90.2 या CD90.1 में मौजूद है: सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले माउस उपभेदों, जैसे C57BL6/J एक्सप्रेस CD90.2; माउस उपभेदों जैसे AKR/J, पीएल, और FVB/N एक्सप्रेस CD90.1 । इस प्रकार, उपयोगकर्ता को प्रयोग शुरू करने से पहले माउस तनाव को सावधानीपूर्वक सत्यापित करना चाहिए और उचित एंटी-सीडी90 एंटीबॉडी (सामग्री की तालिकामें सुझाव दिया गया) चुनना चाहिए।
संक्षेप में, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक सौम्य एंजाइमैटिक पाचन का लाभ लेता है जिसके बाद 9-रंग धुंधला होजाता है जो माउस मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी से विभिन्न कोशिका प्रकारों के कुशल एक साथ प्रवाह साइटोमेट्रिक मूल्यांकन की अनुमति देता है। सीएनएस15में प्रशासित नैनोकणों या वायरल वैक्टर द्वारा लक्षित कोशिका की दक्षता को सुव्यवस्थित और व्यापक तरीके से निगरानी करने के लिए प्रोटोकॉल का दोहन किया जा सकता है । इसके अलावा, प्रोटोकॉल को बहुत नाजुक डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए आसानी से अपनाया जा सकता है, जैसे सेल छंटाई, पूर्व वीवो उपसंस्कृति, एकल सेल RNAseq, जिसके परिणामस्वरूप न केवल चिकित्सा विज्ञान द्वारा कोशिका-लक्ष्यीकरण के पूर्वनैदानिक मूल्यांकन के लिए बल्कि न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में रोग प्रक्रियाओं के गहन लक्षण वर्णन के लिए भी अत्यंत महत्वपूर्ण है।
पूरे सीएनएस सेल आबादी का एक अंश इस प्रोटोकॉल द्वारा भेदभाव नहीं किया जाता है (चित्रा 2में "अन्य" सेल प्रकार देखें); इसे अन्य सेल उपप्रकारों की उपस्थिति से समझाया जा सकता है जो सीएनएस में मौजूद हैं लेकिन हमारे द्वारा उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी द्वारा कैप्चर नहीं किए जाते हैं। हमारे प्रारंभिक विश्लेषणों में, "अन्य कोशिकाओं" अंश का लगभग 14% सीडी73 के लिए सकारात्मक है, न्यूरोवास्कुलचर में समृद्ध एक मेसेंचिमल सेल मार्कर और कई न्यूरोभड़काऊ प्रक्रियाओं16,17में शामिल है। इसके अलावा, हम परिकल्पना करते हैं कि "अन्य कोशिकाओं" अंश में कम विभेदित कोशिकाएं भी शामिल हो सकती हैं, जैसे परिपक्वता के विभिन्न चरणों में संतान, जैसे नेटिन + तंत्रिका स्टेम सेल, नेस्टिन + विमेंटिन + रेडियल ग्लिया प्रोजेनिटर, डबलकॉर्टिन + तंत्रिका जनक, NG2 + ओलिगोडेन्ट्रोसाइट प्रीस्प्रिटर सेल, अन्य लोगों के बीच। इन सेल उप-प्रकारों की हमारे प्रवाह साइटोमेट्री प्रोटोकॉल को लागू करके आसानी से जांच की जा सकती है, क्योंकि हमने फ्लोरोसेंट रंगों का विन्यास चुना है जो फ्लोरोसेसिन आइसोथिओसाइनेट (एफएफसी) या फाइकोरिथ्रिन (पीई) फ्लोरोफोरस के साथ संयुग्मित दो अतिरिक्त कोशिका मार्कर को समायोजित करने की अनुमति देता है।
कुल मिलाकर, हमारा दृष्टिकोण सीएनएस (स्वास्थ्य और रोग में) के संदर्भ में अधिक व्यापक जांच के लिए एक नया उपकरण प्रदान कर सकता है जो गुणात्मक और उच्च-थ्रूपुट मात्रात्मक आकलन दोनों की अनुमति देने वाली एक अच्छी तरह से समेकित तकनीक का लाभ उठा सकता है जैसे प्रवाह साइटोमेट्री।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस अध्ययन बोस्टन बच्चों के अस्पताल स्टार्ट-अप धन द्वारा एबी, ALSA अनुदान एनआर को वित्त पोषित किया गया था । 17-आईआईपी-३४३ को मप्र, और पुरस्कार संख्या के तहत Amyotrophic पार्श्व स्क्लेरोसिस अनुसंधान कार्यक्रम के माध्यम से स्वास्थ्य मामलों के लिए रक्षा के सहायक सचिव के कार्यालय । W81XWH-17-1-0036 से मप्र हम तकनीकी सहायता के लिए डीएफसीआई फ्लो साइटोमेट्री कोर को स्वीकार करते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free) | Gibco | 14185-052 | |
| 70 mm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody | Miltenyi Biotec | 130-117-535 | APC conjugated |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-1KG | |
| CD11b rat anti-mouse antibody | Invitrogen | 47-0112-82 | APC-eFluor 780 conjugated |
| CD31 rat anti-mouse antibody | BD Bioscience | 562939 | BV421 conjugated |
| CD45 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 103138 | Brilliant Violet 510 conjugated |
| CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 202518 | PE/Cy7 conjugated |
| CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 1005325 | PE/Cy7 conjugated |
| Conical Tubes (15 mL) | CellTreat | 229411 | |
| Conical Tubes (50 mL) | CellTreat | 229422 | |
| Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B) | Sigma-Aldrich | D9063-1SET | |
| Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Benchmark | 100-106 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| O4 anti mouse/rat/human antibody | Miltenyi Biotec | 130-095-895 | Biotin conjugated |
| Percoll | GE Healthcare | 10266569 | sold as not sterile reagent |
| Percoll | Sigma | 65455529 | sterile reagent (to be used for applications requiring sterility) |
| Percoll PLUS | Sigma | GE17-5445-01 | reagent containing very low traces of endotoxin |
| Streptavidin | Invitrogen | S3258 | Alexa Fluor 680 conjugated |
References
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