माउस ब्रेन/स्पाइनल कॉर्ड से विभिन्न समरूपीकरण विधियों के माध्यम से प्राप्त कई सेल प्रकारों का एक साथ प्रवाह साइटोमेट्रिक लक्षण वर्णन
Summary
हम माउस मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी से प्राप्त विभिन्न कोशिका प्रकारों की पहचान करने के लिए एक प्रवाह साइटोमेट्री विधि प्रस्तुत करते हैं। इस विधि को न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में शुद्ध कोशिका आबादी को अलग करने या चित्रित करने या वायरल वेक्टर या नैनोकणों के वीवो प्रशासन में लक्षित सेल की सीमा की मात्रा निर्धारित करने के लिए शोषण किया जा सकता है।
Abstract
वायरल वेक्टर और नैनोमटेरियल विज्ञान में हाल ही में प्रगति की जांच या केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में हेरफेर करने के लिए नए अत्याधुनिक दृष्टिकोण के लिए रास्ता खोल दिया है । हालांकि, इन प्रौद्योगिकियों के आगे अनुकूलन शरीर में वायरल वैक्टर या नैनोकणों के प्रशासन पर सीएनएस और सेल-विशिष्ट लक्ष्यीकरण की सीमा के तेजी से और सुव्यवस्थित निर्धारण की अनुमति देने वाले तरीकों से लाभान्वित होगा। यहां, हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो प्रवाह साइटोमेट्री की उच्च थ्रूपुट और मल्टीप्लेक्सिंग क्षमताओं का लाभ उठाता है ताकि माउस मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी, अर्थात् माइक्रोग्लिया/मैक्रोफेज, लिम्फोसाइट्स, एस्ट्रोसाइट्स, ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स, न्यूरॉन्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं से अलग विभिन्न सेल उपप्रकारों के एक सीधा मात्राकरण की अनुमति दी जा सके । हम सेल यील्ड, व्यवहार्यता और संरचना के मामले में दो ऊतक समरूपता विधियों के बीच महत्वपूर्ण मतभेदों को उजागर करने के लिए इस दृष्टिकोण को लागू करते हैं। यह उपयोगकर्ता को ब्याज के सेल प्रकार (एस) और विशिष्ट अनुप्रयोग के आधार पर सबसे अच्छी विधि चुनने का निर्देश दे सकता है। यह विधि शारीरिक वितरण के विश्लेषण के लिए अनुकूल नहीं है, क्योंकि ऊतक एकल-कोशिका निलंबन उत्पन्न करने के लिए समरूप है। हालांकि, यह व्यवहार्य कोशिकाओं के साथ काम करने की अनुमति देता है और इसे सेल-छंटाई के साथ जोड़ा जा सकता है, कई अनुप्रयोगों के लिए रास्ता खोल सकता है जो न्यूरोसाइंटिस्ट के हाथों में उपकरणों के प्रदर्शनों की सूची का विस्तार कर सकते हैं, शुद्ध कोशिका आबादी से प्राप्त प्राथमिक संस्कृतियों की स्थापना से लेकर, जीन-अभिव्यक्ति विश्लेषण और जैव रासायनिक या कार्यात्मक रूप से न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के संदर्भ में अच्छी तरह से परिभाषित सेल उपप्रकारों पर, औषधीय उपचार या जीन चिकित्सा पर।
Introduction
जीन और दवा वितरण प्रौद्योगिकियां (जैसे वायरल वेक्टर और नैनोपार्टिकल्स) एक शक्तिशाली उपकरण बन गई हैं जिन्हें न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में बदले गए विशिष्ट आणविक रास्तों पर बेहतर अंतर्दृष्टि प्राप्त करने और अभिनव चिकित्सीयदृष्टिकोणों केविकास के लिए लागू किया जा सकता है 1,2,3। इन उपकरणों का अनुकूलन की मात्रा पर निर्भर करता है: (1) प्रशासन के विभिन्न मार्गों पर सीएनएस में प्रवेश की सीमा और (2) विशिष्ट सेल आबादी को लक्षित करना। हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण आमतौर पर विभिन्न सीएनएस क्षेत्रों में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन या फ्लोरोसेंट-टैग नैनोकणों और विभिन्न सेल प्रकारों में नैनोकणों की कल्पना करने के लिए लागू किए जाते हैं, जो विशिष्ट कोशिका मार्कर4,5के लिए इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा पहचाने जाते हैं। हालांकि यह दृष्टिकोण प्रशासित जीन या दवा वितरण उपकरणों के जैव वितरण के बारे में मूल्यवान जानकारी प्रदान करता है, तकनीक समय लेने वाली और श्रम-तीव्र हो सकती है क्योंकि इसकी आवश्यकता होती है: (1) ऊतक निर्धारण, क्रायोप्रिजर्वेशन या पैराफिन-एम्बेडिंग और टुकड़ा करने की क्रिया; (2) विशिष्ट सेलुलर मार्कर के लिए धुंधला कभी कभी एंटीजन पुनर्प्राप्ति की आवश्यकता होती है; (3) फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा अधिग्रहण, जो आमतौर पर एक ही प्रयोग के भीतर सीमित संख्या में विभिन्न मार्कर के विश्लेषण की अनुमति देता है; (4) ब्याज के संकेत के उचित मात्राकरण की अनुमति देने के लिए छवि प्रसंस्करण।
फ्लो साइटोमेट्री एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीक बन गई है जो सतह या इंट्रासेलर एंटीजन की अभिव्यक्ति के आधार पर कोशिका निलंबन में विभिन्न सेल फेनोटाइप के तेजी से मात्रात्मक मूल्यांकन की अनुमति देने के लिए बहुत विशिष्ट फ्लोरोसेंट मार्कर का लाभ उठाती है, बल्कि कार्यात्मक माप (जैसे, एपोप्टोसिस, प्रसार, सेल चक्र विश्लेषण, आदि की दर) भी है। फ्लोरोसेंट सक्रिय कोशिका छंटाई के माध्यम से कोशिकाओं का शारीरिक अलगाव भी संभव है, जिससे आगे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों (जैसे, सेल संस्कृति, RNAseq, जैव रासायनिक विश्लेषण आदि) की अनुमति मिलती है। 6,7,8.
ऊतक समरूपता विश्वसनीय और प्रजनन योग्य डाउनस्ट्रीम प्रवाह साइटोमेट्रिक मूल्यांकन की अनुमति देने के लिए एक एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए आवश्यक एक महत्वपूर्ण कदम है। वयस्क मस्तिष्क-ऊतक समरूपता के लिए विभिन्न तरीकों का वर्णन किया गया है, मुख्य रूप से माइक्रोग्लिया कोशिकाओं9,10,11को अलग करने के उद्देश्य से ; उन्हें समग्र रूप से दो मुख्य श्रेणियों में वर्गीकृत किया जा सकता है: (1) यांत्रिक विच्छेदन, जो अपने निकस से कोशिकाओं को अलग करने और अपेक्षाकृत समरूप एकल सेल निलंबन बनाने के लिए एक ड्लोव होमोजेनेज़र (डीएच) के माध्यम से पीसने या बाल काटने बल का उपयोग करता है, और (2) एंजाइमोमेटिक पाचन, जो प्रोटेओलिटिक एंजाइमों की उपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस पर कीमा बनाया हुआ ऊतक हिस्सा के ऊष्मायन पर निर्भर करता है, जैसे ट्राइप्सिन या पाकिन, एक काफी समरूप सेल निलंबन बनाने के लिए बाह्य मैट्रिक्स के क्षरण के पक्ष में12.
चाहे जिसविधि का उपयोग किया जाता है, ऊतक समरूपता के बाद एक शुद्धिकरण चरण की सिफारिश की जाती है ताकि डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में जाने से पहले घनत्व ढाल पर या चुंबकीय चयन9,12के माध्यम से मायलिन को हटाया जा सके।
यहां, हम पैकिन पाचन (पीडी) के आधार पर एक ऊतक प्रसंस्करण विधि का वर्णन करते हैं जिसके बाद घनत्व ढाल पर शुद्धि होती है, जो माउस मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी से समय-संवेदनशील तरीके से व्यवहार्य विषम कोशिका निलंबन प्राप्त करने के लिए अनुकूलित होती है और प्रवाह साइटोमेट्री के लिए उपयुक्त होती है। इसके अलावा, हम एक 9 रंग प्रवाह साइटोमेट्री पैनल और गेटिंग रणनीति हम प्रयोगशाला में अपनाया विभिन्न सीएनएस आबादी, रहते है/मृत कोशिकाओं या फ्लोरोसेंट संवाददाताओं के लिए सकारात्मकता जैसे हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन या रोडामिन रंगका की अनुमति का वर्णन । इस प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण को लागू करके, हम सेलुलर व्यवहार्यता और विभिन्न सेल प्रकारों की पैदावार के संरक्षण के मामले में ऊतक प्रसंस्करण के विभिन्न तरीकों की तुलना कर सकते हैं, यानी पीडी बनाम डीएच।
यहां हम जो विवरण प्रदान करते हैं, वह समरूपता प्रोटोकॉल और एंटीबॉडी संयोजन पर निर्णय लेने का निर्देश दे सकता है, जो ब्याज के विशिष्ट सेल प्रकार (एस) और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण (जैसे, तापमान-संवेदनशील) के आधार पर प्रवाह साइटोमेट्री पैनल में उपयोग करने के लिए अनुप्रयोग, विशिष्ट फ्लोरोसेंट मार्कर की ट्रैकिंग, इन विट्रो संस्कृति, कार्यात्मक विश्लेषण)।
Protocol
Representative Results
Discussion
इसमें हम माउस मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी से सबसे प्रासंगिक सीएनएस कोशिकाओं में से कुछ के सह-शुद्धि और समवर्ती प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। परंपरागत रूप से, नैनोक?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन बोस्टन बच्चों के अस्पताल स्टार्ट-अप धन द्वारा एबी, ALSA अनुदान एनआर को वित्त पोषित किया गया था । 17-आईआईपी-३४३ को मप्र, और पुरस्कार संख्या के तहत Amyotrophic पार्श्व स्क्लेरोसिस अनुसंधान कार्यक्रम के माध्यम से स्वास्थ्य मामलों के लिए रक्षा के सहायक सचिव के कार्यालय । W81XWH-17-1-0036 से मप्र हम तकनीकी सहायता के लिए डीएफसीआई फ्लो साइटोमेट्री कोर को स्वीकार करते हैं।
Materials
| 10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free) | Gibco | 14185-052 | |
| 70 mm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody | Miltenyi Biotec | 130-117-535 | APC conjugated |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-1KG | |
| CD11b rat anti-mouse antibody | Invitrogen | 47-0112-82 | APC-eFluor 780 conjugated |
| CD31 rat anti-mouse antibody | BD Bioscience | 562939 | BV421 conjugated |
| CD45 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 103138 | Brilliant Violet 510 conjugated |
| CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 202518 | PE/Cy7 conjugated |
| CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 1005325 | PE/Cy7 conjugated |
| Conical Tubes (15 mL) | CellTreat | 229411 | |
| Conical Tubes (50 mL) | CellTreat | 229422 | |
| Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B) | Sigma-Aldrich | D9063-1SET | |
| Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Benchmark | 100-106 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| O4 anti mouse/rat/human antibody | Miltenyi Biotec | 130-095-895 | Biotin conjugated |
| Percoll | GE Healthcare | 10266569 | sold as not sterile reagent |
| Percoll | Sigma | 65455529 | sterile reagent (to be used for applications requiring sterility) |
| Percoll PLUS | Sigma | GE17-5445-01 | reagent containing very low traces of endotoxin |
| Streptavidin | Invitrogen | S3258 | Alexa Fluor 680 conjugated |
References
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