Summary
我们提出了一种流式细胞测定方法，用于识别从小鼠大脑或脊髓中检索到的不同细胞类型。该方法可用于分离或描述神经退行性疾病中的纯细胞群，或量化细胞靶向在体内给病毒载体或纳米粒子的靶向范围。
Abstract
病毒载体和纳米材料科学的最新进展为研究或操纵中枢神经系统（CNS）的新方法开辟了道路。然而，这些技术的进一步优化将受益于在体内病毒载体或纳米粒子的培养后，能够快速和简化地确定中枢神经系统和细胞特定靶向的范围的方法。在这里，我们提出一个协议，利用流式细胞学的高通量和多路复用功能，允许从小鼠大脑或脊髓中分离的不同细胞亚型，即微胶质/巨噬细胞、淋巴细胞、星细胞、寡核苷酸细胞、神经元和内皮细胞进行直接定量。我们应用这种方法来突出两个组织均质方法在细胞产量、活力和组成方面的重要差异。这可以指示用户根据感兴趣的单元格类型和特定应用程序选择最佳方法。此方法不适合分析解剖分布，因为组织是同质化的，以产生单细胞悬浮液。然而，它允许与活细胞一起工作，它可以与细胞分类相结合，为几种应用开辟了道路，这些应用可以扩大神经科学家手中的工具范围，从建立从纯细胞种群衍生的初级培养物，到基因表达分析以及神经退行性疾病背景下明确定义的细胞亚型的基因表达或功能测定，在药物治疗或基因治疗时。
Introduction
基因和药物输送技术（如病毒载体和纳米粒子）已成为一个强大的工具，可以应用来获得对神经退行性疾病中改变的特定分子途径的更好见解，并开发创新的治疗方法1，2，3。这些工具的优化取决于以下方面：（1） 不同管理途径在中枢神经系统的渗透程度，以及（2） 针对特定细胞群。组织学分析通常应用于可视化荧光报告基因或荧光标记纳米粒子在不同的CNS区域和不同的细胞类型，通过免疫染色特定细胞标记4，5识别。尽管这种方法提供了关于施用基因或药物输送工具的生物分布的宝贵信息，但该技术可能非常耗时和耗费大量人力，因为它需要：（1） 组织固定、冷冻保存或石蜡嵌入和切片;（2） 组织固定、冷冻保存或石蜡嵌入和切片;（2） 有时需要抗原检索的特定细胞标记物的染色;（3） 通过荧光显微镜采集，通常允许在同一实验中分析有限数量的不同标记;（4）图像处理，允许对感兴趣的信号进行适当的量化。
流式细胞学已成为一种广泛使用的技术，它利用非常特殊的荧光标记，不仅允许根据表面或细胞内抗原的表达对细胞悬浮液中的不同细胞表型进行快速定量评估，而且还允许功能测量（例如，凋亡率、增殖率、细胞周期分析等）。也可以通过荧光活化细胞分类对细胞进行物理分离，从而进一步进行下游应用（例如，细胞培养、RNAeq、生化分析等）6，7，8.
组织均质化是获得单细胞悬浮液以进行可靠和可重复的下游流细胞测量的关键步骤。对成人脑组织均质化有不同的方法，主要目的是分离微胶质细胞9、10、11;它们可分为两大类：（1）机械分离， 它使用研磨或剪切力通过Dce均质剂（DH）撕开细胞从他们的利基，并形成一个相对均质的单细胞悬浮液，和（2）酶消化，它依赖于在37°C的分块组织块在存在蛋白酶，如胰蛋白酶，如胰蛋白酶，如胰蛋白酶，有利于细胞外基质的降解，以创建一个相当均质的细胞悬浮液12。
无论使用哪种方法，在组织均质化后，建议通过密度梯度上的离心或磁选择9、12去除骨髓，然后再转移到下游应用。
在这里，我们描述了一种基于木瓜素消化（PD）的组织处理方法，随后在密度梯度上进行纯化，经过优化，以时间敏感的方式从小鼠大脑或脊髓获得可行的异质细胞悬浮液，并适合流动细胞学。此外，我们描述了一个9色流细胞测定面板和我们在实验室采用的浇注策略，允许同时区分不同的CNS人群、活/死细胞或荧光报告机的积极性，如绿色荧光蛋白或罗达明染料。通过应用这种流式细胞测定分析，我们可以比较不同的组织处理方法，即PD与DH，在保持细胞活力和不同细胞类型的产量方面。
我们本文提供的细节可以指导根据感兴趣的特定细胞类型和下游分析（例如，温度敏感度）在流式细胞测定面板中使用的同质化协议和抗体组合。应用、特定荧光标记的跟踪、体外培养、功能分析）。
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Protocol
此处描述的所有方法均已获得达纳法伯癌症研究所的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（协议号16-024）。
1. 准备实验所需的解决方案
- 用无菌水稀释10xHBSS，制备1x汉克的平衡盐溶液（HBSS）。在冰上预冷溶液。每个样品至少需要25 mL的溶液。
- 通过将 10 倍无菌 HBSS 1：10 与密度梯度介质（即 Percoll）混合，制备等值贴贴胶溶液 （IPS）。在冰上预冷。
注：IPS 可在 4°C 下存储长达 30 天。 - 制备流式细胞学 （FACS） 阻断 （BL） 溶液 （1% 牛血清白蛋白 [BSA]， 5% 胎儿牛血清 [FBS] 在磷酸盐缓冲盐水 [PBS]）。在冰上预冷。
2. 通过心脏内灌注和组织解剖进行动物安乐死
注：实验中使用了8周大的C57BL/6J小鼠，无论是性别还是性别。在进行组织消化之前，使用PBS溶液进行灌注以消除器官的血液污染。
- 使用氯胺酮/木氨酸的混合物（90⁄200毫克/千克氯胺酮，10毫克/千克木兰辛）对小鼠进行麻醉。将鼠标放在其背面，并将每个肢体向下胶带到支架。通过检查戒断反射来验证麻醉的充分深度。
- 在胸腔入口的水平进行中线皮肤切口，以暴露胸骨。使用钳子抓住胸骨的尖端，然后在肋笼的每一侧切开一个1厘米的切口。最后切开隔膜，打开胸骨，足以使心脏形象化。
- 使用钳子轻轻抓住心脏的右心室，并提起到中线和稍微出胸部。
- 将 23 G 蝴蝶针插入左心室的尖端，朝向主塔并牢固地握住。
- 使用 1x PBS 开始灌注。用剪刀刺穿右侧的尿孔，让渗透器退出循环。将PBS的流速设置为3 mL/min。
注：肝脏和肠血管的发泡是良好的灌注迹象。如有必要，预输液量可以增加，直到流出心脏的液体没有血液，此时冲洗线可以停止。 - 灌注后，将大脑从脊髓中切断，用剪刀和钳子将大脑从头骨上取出。去除毛皮，以提高解剖过程中的可见性和控制力，并避免携带头发污染物。使用装有PBS的3 mL注射器将脊髓从柱中冲洗出来。
- 将每个组织转移到一个6孔多孔板的井中，预填充2 mL的冰冷1x HBSS，并保持在冰上直到消化。
- 沿着纵线将大脑和脊髓分成两半。
注：每个组织有一半是均质的（见下文各节），以便进行流动细胞学分析;另一半可分配给不同的处理替代分析（例如，浸在组织学的甲醛固定溶液中）。
3. 脑和脊髓的酶消化
注：本节中描述的体积足以消化半脑或脊髓。
- 用剪刀将纸巾切成1⁄2毫米厚的碎片。
- 用剪刀切割 1000 μL 移液器的尖端，使其足够大，以便收集组织件。用 1x HBSS 预冲洗移液器尖端。然后使用移液器将含有切碎组织的2 mL HBSS溶液转移到15 mL锥形管中。
注意：移液器尖端的预浸水对于防止吸头内组织块粘附很重要。 - 用额外的2 mL冰冷1x HBSS清洗油井，并将溶液转移到含有组织片的相应15 mL锥形管中。
- 在4°C下，在250 x g下将每个样品离心5分钟。
- 制备神经组织分离试剂盒（NTDK;材料表）将50μL的酶P与每个样品的1900μL缓冲X混合。在水浴中，在37°C下将热酶混合1。在37°C下孵育酶1，在使用前至少10分钟，以便完全激活酶。
- 从15 mL锥形管中吸出上清液，并将1.95 mL的酶混合1到每个样品中。轻轻涡旋，确保颗粒重新悬浮。
- 在 37°C 下在车轮或摇床上孵育样品 15 分钟。
- 同时，通过将酶A的10μL与每个样品20μL的缓冲Y混合，制备NTDK的酶混合物2;在水浴中37°C预加热溶液。
- 在用酶混合1孵育结束时，在每个样品中加入30μL的酶混合物2。
- 通过使用 1x HBSS 预冲洗的 1000 μL 移液器尖端，轻轻混合样品。
- 在 37°C 下在车轮或摇床上孵育样品 15 分钟。
- 孵育后，在每个管中加入10 mL的冰冷1x HBSS，以灭活酶混合物1和酶混合2。
- 在4°C下，在320 x g下将每个样品离心10分钟。
- 丢弃上清液;在每个管子中加入冰冷的1x HBSS，最终体积达到7 mL，并通过涡旋轻轻重新悬浮颗粒。
- 继续第 5 节清除碎屑。
4. 大脑和脊髓的机械均质化
注：本节中描述的体积足以使半脑或脊髓均匀化。本节中描述的协议可用作第 3 节中所述协议的方法替代方法，具体取决于下面讨论的用户需求。
- 预冷在冰上的达克斯组织磨床的玻璃砂浆（材料表）。
- 在砂浆中加入 3 mL 的预冷却 1x HBSS。
- 将组织（大脑或脊髓）从 6 孔板的井转移到玻璃砂浆中，确保将其浸入 1x HBSS 中，并位于砂浆底部。
- 轻轻粉碎组织与10冲程的刺A，然后10中风的虫子B.转移同质混合到一个新的15 mL锥形管。
- 使用预冷却的 1x HBSS 和离心机在 4 °C 下以 320 x g的速度将管注入 10 mL 的最终体积。
- 吸出上清液，将冰冷的 1x HBSS 添加到每根管中，最终体积为 7 mL，并通过涡旋轻轻重新悬浮颗粒。
- 继续第 5 节清除碎屑。
5. 清除碎片
注：去除主要由未消化组织和骨髓护套组成的碎屑，是使组织均质物有效染色以进行后续流式细胞测定的关键步骤。
- 通过70μm细胞过滤器过滤每个样品，以去除任何未消化的组织块。这一步尤其重要，特别是在处理脊髓组织时，因为这些样本更有可能包含未消化的神经片段或脑膜，可能会影响后续步骤。
- 确保每个样品管的最终体积为 7 mL。如果没有，请加注冰冷 1x HBSS，最高为 7 mL。
- 在每个样品中加入3 mL的预冷却IPS，使含有密度梯度培养基的溶液的最终体积为10 mL，最终浓度为30%。轻轻涡旋样品，以确保它们均匀混合。
- 在18°C下在700 x g下进行15分钟的离心样品，确保离心机的加速度设置为7，制动器设置为0。
注：离心大约需要 30 分钟。 - 从离心机中小心地取出样品。
注：由碎屑和骨髓组成的白色圆盘应可见漂浮在溶液表面。在管的底部应可见颗粒（包含感兴趣的细胞）。 - 小心地吸出所有白色碎屑盘，然后吸出上清液的其余部分，确保不会移开颗粒。将约 100 μL 溶液留在细胞颗粒顶部，以避免无意中将其移开的风险。
- 加入 1 mL 的 FACS BL，用 1000 μL 移液器尖端上下移液来重新悬浮颗粒，并将样品转移到 1.5 mL 管中。
- 在室温 （RT） 下，在 450 x g下离心 5 分钟。
- 轻轻吸出上清液，并将颗粒重新悬浮在与下游分析兼容的适当缓冲液中（参见第 6 节，了解用于多种细胞类型的流式细胞测量的协议）。
6. 用于多种细胞类型的流式细胞测定的染色
- 用350 μL的FACS BL重新悬浮步骤5.9中获得的颗粒。以5μg/mL的最终浓度向每个样品添加Fc-block。
注：至少100 μL的样品应用于一个染色，以确保处理足够的细胞，以便进行可靠的分析。 - 在继续染色之前，在4°C下孵育样品10分钟。
- 根据表1准备抗体混合物。
- 将抗体混合物加入每根管中，涡旋5秒，在黑暗中4°C下孵育样品15分钟。
- 在RT处以450 x g向每管、涡流和离心机添加1 mL的PBS5分钟。
- 同时根据表1准备链球菌混合剂。
- 丢弃上清液，并在步骤 6.6 中准备的链球蛋白混合物中重新悬浮颗粒。对于每个样品，使用与步骤 6.4 中用于染色的体积相同的体积。
- 涡旋5秒，在黑暗中4°C下孵育样品10分钟。
- 在RT处以450 x g向每管、涡流和离心机添加1 mL的PBS5分钟。
- 丢弃上清液，在FACS BL中重新悬浮颗粒。对于每100μL的样品染色，使用300μL的FACS BL。
- 在每个样品中加入7-氨基-actinocin D（7-AAD）溶液。对于步骤 6.10 中制备的每 300 μL 样品，使用 5 μL 的 7-AAD。
- 在黑暗中将样品储存在4°C下，直到进行细胞氟化分析。从样品制备开始16小时内进行分析，保证大于60%的细胞活力。
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Representative Results
我们比较了应用于小鼠大脑和脊髓的两种不同的均质化方法（DH与PD），以测试检索适合下游应用的不同可行细胞类型的效率。为此，我们利用了一个9色流细胞测定面板，设计成在同一样本中，包括微胶质、淋巴细胞、神经元、星形细胞、寡核苷酸和内皮球在内的不同中枢神经系统细胞类型。
从不同的小鼠（n = 6）中检索大脑和脊髓组织，纵向分成两半，使用Duce均质器（DH方法）进行机械干扰，或者使用基于木瓜（PD方法）的商业NTDK（图1A）轻轻切碎和消化酶。清除碎片后，将大脑或脊髓中的细胞分别稀释1/10或1⁄2+1/5，以Trypan蓝色确定细胞产量和活力，使用Neubauer室（图1B，C）。总体而言，DH 方法从大脑和脊髓中产生更高的细胞产量。然而，大部分被检索到的细胞都死了，结果大脑中只有13.8%~3.3%的活细胞，脊髓中只有10.5%~1.5%（图1B）。许多死细胞形成聚集体（图1C）;这种现象可能是由于存在高度互联的细胞网络（如中枢神经系统血管内膜和胶质细胞），这些细胞网络不能用DH施加的剪切力来分解。这些死亡细胞的聚集体很可能没有被密度梯度去除，最终形成用于细胞氟化分析的最终细胞颗粒。相反，PD 方法决定了细胞活力的整体更好保存（90.6% - 0.6% 在大脑中，85.2% = 2.8% 在脊髓）。Papain 能够有效地消化细胞外基质和细胞与细胞之间的结，从而实现更均匀的单细胞悬浮。在切碎过程中死亡的一些细胞可以被木瓜进一步消化，导致形成细胞碎片，这些碎片通过密度梯度更有效地分离。总体而言，这很可能决定更好地保存细胞活力与PD方法，尽管细胞产量略低于DH方法。
大脑和脊髓细胞悬浮液的100μL的等分与抗体混合物（表1）一起染色，并通过流式细胞仪与9色面板进行分析。图 2A显示了用于识别大脑和脊髓细胞悬浮液的不同细胞类型的门控策略。简而言之，第一个门根据正向散射 （FSC） 和侧散射 （SSC） 标识一般总体，不包括小细胞碎片。然后识别活（7-AAD-）细胞。在总活细胞群中，CD45+和CD45-细胞高亮显示。在CD45+门内，识别CD45[CD11b]微胶质/巨噬细胞和CD45_CD11b-淋巴细胞。在CD45-门内，细胞根据ACSA2（星形细胞）或O4（核苷酸细胞）的积极性进行区分。CD45-ACS2-O4-细胞根据Thy1（神经元）或CD31（内皮）的积极性进一步细分。剩余的Thy1-CD31-细胞被归类为"其他细胞类型"，没有由我们的抗体组合计算。
如图2B所示，使用DH方法，从大脑检索到的活细胞中约有38%，从脊髓中检索到的存活细胞中约有32%是造血原型（CD45+）。另一方面，PD方法允许在两个组织中检索出高产量的活细胞，其中很大一部分由非造血CD45-细胞（大脑中约82%，脊髓92%）表示。值得注意的是，CD45[CD11b]微胶质/巨噬细胞代表最丰富的活细胞分数与DH方法（图2C）。然而，PD方法产生了细胞类型的异构表示形式，包括ACSA®星形细胞、O4+寡核苷酸细胞、CD31+内皮细胞和Thy1+神经元（图2C）。有趣的是，活的神经元和内皮细胞很难用DH方法检测出来。
DH方法依靠在玻璃虫和砂浆之间的组织机械研磨，使组织均质化。这可能导致一些剪切应力，可能会损害和影响大或非常敏感的细胞，如神经元或神经血管细胞的生存能力。我们评估了通过抗体面板识别的每个细胞亚群中的细胞活力（7-AAD-细胞的百分比）（图3）。从大脑和脊髓分离的造血细胞（CD45+），包括微胶质/巨噬细胞（CD45[CD11b+）和其他非骨髓细胞（CD45_Cd11b-），与所使用的均质化方法（图3A）不同，表现出非常高的生存能力（图3A）。相反，DH方法确定了CD45-群的可生存性显著降低（图3B），而PD方法确定了不同CNS细胞类型的广泛保存。具体来说，神经元和内皮细胞是受DH影响最大的亚群，并且通过PD方法保存。
图4概述了正确样品制备和有效清除碎屑所需关键步骤的示意图。
图1：从大脑和脊髓中检索到的细胞的产生受均质方法的影响。
（A） 实验大纲.小鼠被麻醉，心内注入PBS，以去除血管内循环血细胞。大脑和脊髓被仔细解剖，纵向分成两半。组织使用大数质化（DH）或木瓜消化（PD）进行均质化，如主文本中详述的。然后，在30%密度梯度培养溶液中通过离心去除Myelin和组织碎片，从而产生一种包含不同细胞类型的异质细胞悬浮液，可以通过流式细胞学进行分析。（B） 直方图显示从大脑或脊髓中检索到的细胞在组织与DH或PD方法同质化时的产生。表示每个条件至少 6 个动物的平均值 = SEM。（C） 代表光明场显微镜显微显影从大脑或脊髓中检索到的Trypan蓝色正（死）和负（活）细胞的显微显影。比例尺 = 100 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：从CNS检索到的不同细胞类型的相对比例受组织均质方法的影响。
（A） 代表性流式细胞测定图，显示从大脑或脊髓获得的细胞制剂中识别不同细胞亚群的门控策略：细胞群在FSC和SSC物理参数上封闭，然后选择7-AAD-活细胞;然后根据CD45标记的正性对细胞进行区分;微胶质/巨噬细胞在CD45+部分内被确定为CD11b+细胞，而淋巴细胞为CD11b-。在CD45-内，星形细胞、寡核苷酸细胞、内皮细胞和神经元细胞分别被识别为ACSA2+、O4+、CD31+或Thy1+细胞。（B） 直方图显示CD45+和CD45-细胞在与DH或PD方法同质化时在总活细胞或死细胞群中、大脑或脊髓中的百分比。表2报告了图表中显示的结果的统计分析。（C） 饼图显示与DH或PD方法同质时，在总细胞群、大脑或脊髓中不同可存活细胞亚型的百分比。还报告了死亡细胞总数的百分比。N = 6。CD45[CD11b] = 微胶质/巨噬细胞;CD45_CD11b-= 淋巴细胞/非骨髓细胞;CD45-ACSA2+ = 星形细胞;CD45-O4+ = 寡核苷酸;CD45-Thy1+ = 神经元;CD45-CD31+ = 内皮细胞;其他 = 单元格对上述所有标记都呈阴性。表2报告了图表中显示的结果的统计分析。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：不同CNS细胞类型的细胞生存能力受应用均质方法的影响。
（A） 直方图显示CD45+造血细胞群中7-AAD-活细胞的百分比，包括CD11b®微胶质/巨噬细胞和CD11b-非骨髓细胞。（B） 直方图显示CD45-非造血细胞群中7-AAD-活细胞的百分比，包括星形细胞、寡核苷酸、神经元、内皮和其他细胞类型。[ ] p < 0.05， = p < 0.01， DH 和 PD 之间的曼-惠特尼.请点击此处查看此图的较大版本。
图4：正确组织处理所需的关键步骤的原理图表示。
图中列出了进行适当组织处理和有效清除碎屑所需的最关键步骤。在 30% 密度梯度上对样品离心后形成的碎屑盘（黑色箭头）和细胞颗粒（蓝色箭头）非常重要。碎屑盘，连同上清液的其余部分，必须小心地清除吸入，不要移开细胞颗粒，以避免样品损失。请点击此处查看此图的较大版本。
| 抗体混合物 | 初始浓度（μg/mL） | 最终浓度（μg/mL） | 稀释因子 |
| 防 CD45/BV510 | 200 | 2 | 100 |
| 防 CD11b/APC.780 | 200 | 2 | 100 |
| 防 CD31/BV421 | 200 | 2 | 100 |
| 防 ACSA2/APC | 150 | 0.75 | 200 |
| 抗O4/生物锡 | 那 | 那 | 40 |
| 防 CD90.2/PE。赛7 | 200 | 2 | 100 |
| 链球菌混合 | 初始浓度（μg/mL） | 最终浓度（μg/mL） | 稀释因子 |
| 链球菌/亚历克萨 680 | 1000 | 1 | 1000 |
表1：用于制备流式细胞染色混合物的配方。该表描述了用于允许对多种细胞类型的流动细胞测定分析的抗体和链球菌素的最佳浓度。有关表中提及的每个试剂的目录编号的详细信息，请参阅材料表。
| 图 2B 的统计信息 | ||||||||||
| 脑（百分比细胞） | ||||||||||
| CD45+ | CD45- | |||||||||
| 住 | 死 | 住 | 死 | |||||||
| 方法 | 意味 着 | • SEM | 意味 着 | • SEM | 意味 着 | • SEM | 意味 着 | • SEM | ||
| Dh | 15.20 | ≤ 2.32 | 1.90 | ± 0.30 | 24.78 | ≤ 4.045 | 51.58 | ≤ 6.033 | ||
| Pd | 15.20 | ≤ 2.65 | 2.33 | ± 1.10 | 68.53 | ≤ 3.618 | 13.93 | ≤ 2.180 | ||
| 曼-惠特尼 | Ns | Ns | *** | ** | ||||||
| p 值 | 0.9989 | 0.738 | 0.0006 | 0.0015 | ||||||
| 脊柱细胞（百分比细胞） | ||||||||||
| CD45+ | CD45- | |||||||||
| 住 | 死 | 住 | 死 | |||||||
| 方法 | 意味 着 | • SEM | 意味 着 | • SEM | 意味 着 | • SEM | 意味 着 | • SEM | ||
| Dh | 15.00 | ≤ 8.21 | 1.41 | ± 0.11 | 31.64 | ≤ 8.21 | 51.95 | ≤ 16.52 | ||
| Pd | 7.49 | ≤ 4.99 | 1.15 | ± 0.68 | 84.27 | € 9.39 | 7.09 | ≤ 3.75 | ||
| 曼-惠特尼 | Ns | Ns | * | Ns | ||||||
| p 值 | 0.5548 | 0.7236 | 0.0438 | 0.1144 | ||||||
| 图 2C 的统计信息 | |||||||||||||||||
| 脑（百分比细胞） | |||||||||||||||||
| CD45+ | CD45- | ||||||||||||||||
| CD11b* | CD11b- | ACSA2 | O4 | Thy1 | CD31 | 其他 | 死 | ||||||||||
| 方法 | 意味 着 | • SEM | 意味 着 | • SEM | 意味 着 | • SEM | 意味 着 | • SEM | 意味 着 | • SEM | 意味 着 | • SEM | 意味 着 | • SEM | 意味 着 | • SEM | |
| Dh | 19.32 | ≤ 3.88 | 1.17 | ± 0.27 | 9.52 | ≤ 2.68 | 3.41 | ≤ 1.01 | 1.39 | ± 0.77 | 0.48 | ± 0.29 | 10.52 | ≤ 4.49 | 53.83 | ≤ 5.79 | |
| Pd | 10.88 | ≤ 2.03 | 1.65 | ± 0.48 | 8.17 | ≤ 2.66 | 6.54 | ± 0.76 | 6.37 | ≤ 1.76 | 8.27 | ≤ 1.25 | 33.28 | ≤ 6.34 | 23.72 | ≤ 5.31 | |
| 曼-惠特尼 | Ns | Ns | Ns | * | ** | *** | ** | ** | |||||||||
| p 值 | 0.1206 | 0.4819 | 0.5894 | 0.0264 | 0.0093 | 0.0003 | 0.0084 | 0.0022 | |||||||||
| 脊柱细胞（百分比细胞） | |||||||||||||||||
| CD45+ | CD45- | ||||||||||||||||
| CD11b* | CD11b- | ACSA2 | O4 | Thy1 | CD31 | 其他 | 死 | ||||||||||
| 方法 | 意味 着 | • SEM | 意味 着 | • SEM | 意味 着 | • SEM | 意味 着 | • SEM | 意味 着 | • SEM | 意味 着 | • SEM | 意味 着 | • SEM | 意味 着 | • SEM | |
| Dh | 21.23 | ≤ 6.25 | 2.51 | ± 0.57 | 4.26 | ≤ 2.34 | 9.40 | ≤ 1.89 | 2.82 | ≤ 1.51 | 0.97 | ± 0.50 | 22.74 | ≤ 9.04 | 35.28 | ≤ 1.89 | |
| Pd | 9.63 | ≤ 1.67 | 2.77 | ± 0.48 | 4.23 | ≤ 1.59 | 28.62 | ≤ 3.57 | 1.26 | ± 0.49 | 6.94 | ≤ 2.14 | 26.39 | ≤ 8.17 | 19.09 | ≤ 4.76 | |
| 曼-惠特尼 | Ns | Ns | Ns | * | Ns | * | Ns | Ns | |||||||||
| p 值 | 0.1905 | >0.9999 | 0.7302 | 0.0159 | 0.7302 | 0.0317 | 0.7302 | 0.1111 | |||||||||
表2：应用DH或PD方法检索到的不同人群的统计分析。该表描述了图2B和图2C所示的图表的统计数据。表示至少六个独立样本的平均和 SEM。还报告了适用于每次比较的统计检验的p值和详细信息。
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Discussion
本文介绍一种协议，用于对小鼠大脑和脊髓中一些最相关的CNS细胞进行共纯化和并发流细胞学分析。传统上，组织学分析已应用于描述纳米粒子的分布或病毒载体在CNS5，13的转导效率，或提供在病理学或药理治疗期间特定细胞类型发生的形态和分子变化的见解14。然而，组织学缺乏过程性，由于可以同时分析的标记数量有限，因此无法全面检查同一组织学样本中的多个特征。我们的方法可以补充传统的组织学分析，它可以与几个下游应用（分类、初级培养、生化或下一代测序分析）相结合，以扩大从单个样本中获取的信息的汇编。但是，必须考虑下面列出的一些关键因素，因为它们会严重影响这种方法的成功：
- 起始组织的数量。我们已经优化了细胞分离，从一半脊髓或半脑开始。根据我们的经验，使用 PD 方法处理来自 8 周大成人小鼠的半脑或半脊髓，从大脑中产生 1⁄6 x 106个活细胞，在密度梯度步骤后从脊髓中产生大约 0.1±0.5 x 106个活细胞。在新生儿或8周以下小鼠的组织中应用PD法后，我们没有测量细胞的产生。然而，在我们的手中，结果与起始组织的重量成正比。因此，对于年轻的动物（例如10天大的幼崽），整个大脑或脊髓应进行处理，以确保良好的细胞产量，以便进行可靠的下游分析。如有必要，汇集来自多种动物的组织将有助于提高细胞产量。根据我们的经验，只要尊重起始组织每个重量的试剂比例，也可以在不作修改的情况下应用该协议，从大鼠的大脑或脊髓中分离细胞。对于重量超过250mg的组织，建议在多个样本（每个重量为<250mg）中将组织向上缩放或分裂。
- 在密度梯度之前去除脑膜炎/残留组织块。根据我们的经验，PD 方法无法有效消化脑膜或非常高的骨髓组织，如从脊髓中产生的神经和神经根。当这些组织存在时，一些未消化的粘性碎片可能留在酶消化步骤后检索到的细胞悬浮液中，然后清除碎片。通过70μm细胞过滤器过滤溶液（如步骤5.1中建议）来去除这些块对于成功的细胞制备至关重要。事实上，如果不去除，脑膜炎或组织片将阻碍有效的密度梯度分离，导致细胞产量下降。
- 定时、温度和不育。使用建议的正确温度设置和孵育，及时执行所有步骤非常重要。这对于确保样品的高细胞活力和完整性至关重要。根据下游应用，可能需要在无菌罩下使用无菌试剂执行所有步骤（例如，建立主细胞培养物）。在酶消化溶液中延长孵育时间超过建议的时间（第3节）可能导致细胞活力下降。一些表面抗原的表位可能对木瓜敏感，导致流式细胞测定信号丢失。对于需要本文所述其他标记的特定应用，建议在开始实验之前测试不同抗体克隆的性能。据报道，密度梯度培养基可能含有一些内毒素的痕迹，可能触发免疫细胞（微胶质/巨噬细胞）的激活。每当分析这些人群时，实验中应始终添加适当的内部控制，以排除程序引起的可能的影响。坚持建议的温度和洗涤密度梯度介质剩余后立即碎片清除步骤通常足以避免明显免疫细胞激活。但是，如果下游应用（例如RNAeq或功能分析）受此步骤影响，用户应切换到低内毒素密度梯度介质制备（材料表中建议）。
- FACS 抗体和机器。特此提出的流式细胞染色方案利用了抗体浓度和颜色结合，这些抗体浓度和颜色结合与我们的实验室经验和我们研究所提供的FACS机器检索到的细胞产量效果最佳。在开始新的实验之前，用户应先将抗体放在手上，因为浓度可能需要稍微调整。此外，我们鼓励在每个实验中始终使用单色染色控制，以验证所有抗体和 FACS 机器的补偿设置是否正常工作。需要注意的是，用于检测神经元的CD90（Thy）抗原存在于两种不同的等型中，即CD90.2或CD90.1取决于小鼠菌株：最常用的小鼠菌株，如C57BL6/J表达CD90.2;小鼠应变，如 AKR/J、PL 和 FVB/N 快件 CD90.1。因此，在开始实验之前，用户应仔细验证小鼠菌株，并选择适当的抗CD90抗体（如材料表中的建议）。
总之，这里提出的协议利用了温和的酶消化，然后是9色的染色，允许从小鼠大脑和脊髓对不同细胞类型进行高效的同步流动细胞测量。该协议可以利用，以简化和全面的方式监测在CNS15中施用的纳米粒子或病毒载体的细胞靶向效率。此外，该协议还可轻松应用于非常精细的下游应用，如细胞分拣、前体亚培养、单细胞RNAAseq，这不仅对治疗性细胞靶向的临床前评估至关重要，而且对神经退行性疾病病理过程的深入表征也至关重要。
整个CNS细胞群的一小部分不受此协议的歧视（参见图2中的"其他"单元类型）;这可以通过存在于CNS中但不被我们使用的抗体捕获的其他细胞亚型来解释。在我们的初步分析中，大约14%的"其他细胞"分数对CD73呈阳性，CD73是一种在神经血管中丰富的中位细胞标记，并参与几个神经炎症过程16，17。此外，我们假设"其他细胞"部分也可以包括分化程度较低的细胞，如处于不同成熟阶段的祖细胞，如nestin® 神经干细胞、nestin® vimentin® 径向胶原体祖细胞、双皮质® 神经祖细胞、NG2® 寡核苷酸前体细胞等。通过应用我们的流式细胞测定协议，可以很容易地研究这些细胞亚类型，因为我们选择了荧光染料的配置，允许容纳多达两个额外的细胞标记与荧光素异氰酸酯 （FITC） 或植物性乙酸酯 （PE） 荧光草结合。
总体而言，我们的方法可以为在CNS（健康和疾病）背景下进行更全面的调查提供新的工具，利用整合良好的技术，允许定性和高通量定量评估如流式细胞测定仪。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究由波士顿儿童医院的启动基金资助给A.B.，ALSA赠款nr.17-IIP-343 到 M.P.，以及助理国防部长办公室通过肌萎缩性侧索硬化研究计划，根据第 No.W81XWH-17-1-0036 到 M.P.我们感谢 DFCI 流式细胞学核心的技术支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free) | Gibco | 14185-052 | |
| 70 mm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody | Miltenyi Biotec | 130-117-535 | APC conjugated |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-1KG | |
| CD11b rat anti-mouse antibody | Invitrogen | 47-0112-82 | APC-eFluor 780 conjugated |
| CD31 rat anti-mouse antibody | BD Bioscience | 562939 | BV421 conjugated |
| CD45 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 103138 | Brilliant Violet 510 conjugated |
| CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 202518 | PE/Cy7 conjugated |
| CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 1005325 | PE/Cy7 conjugated |
| Conical Tubes (15 mL) | CellTreat | 229411 | |
| Conical Tubes (50 mL) | CellTreat | 229422 | |
| Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B) | Sigma-Aldrich | D9063-1SET | |
| Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Benchmark | 100-106 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| O4 anti mouse/rat/human antibody | Miltenyi Biotec | 130-095-895 | Biotin conjugated |
| Percoll | GE Healthcare | 10266569 | sold as not sterile reagent |
| Percoll | Sigma | 65455529 | sterile reagent (to be used for applications requiring sterility) |
| Percoll PLUS | Sigma | GE17-5445-01 | reagent containing very low traces of endotoxin |
| Streptavidin | Invitrogen | S3258 | Alexa Fluor 680 conjugated |
References
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