Vevskonstruert graft for omkrets esophageal rekonstruksjon hos rotter
Summary
Esophageal rekonstruksjon er en utfordrende prosedyre, og utvikling av en vev-konstruert spiserør som muliggjør regenerering av esophageal mucosa og muskel, og som kan implanteres som en kunstig pode er nødvendig. Her presenterer vi vår protokoll for å generere en kunstig spiserør, inkludert stillasproduksjon, bioreaktordyrking og ulike kirurgiske teknikker.
Abstract
Bruk av biokompatible materialer for omkrets esophageal rekonstruksjon er en teknisk utfordrende oppgave hos rotter og krever en optimal implantatteknikk med ernæringsmessig støtte. Nylig har det vært mange forsøk på esophageal vev engineering, men suksessraten har vært begrenset på grunn av vanskeligheter i tidlig epitelisering i det spesielle miljøet av peristaltikk. Her utviklet vi en kunstig spiserør som kan forbedre regenerering av esophageal slimhinnen og muskellag gjennom en tolags rørformet stillas, en mesenchymal stamcellebasert bioreaktor system, og en bypass fôring teknikk med modifisert gastrostomi. Stillaset er laget av polyuretan (PU) nanofibre i en sylindrisk form med en tredimensjonal (3D) trykt polycaprolactone strand viklet rundt ytterveggen. Før transplantasjon ble menneskeavledede mesenchymale stamceller sådd inn i lumen av stillaset, og bioreaktordyrking ble utført for å forbedre cellulær reaktivitet. Vi forbedret graft overlevelsesraten ved å bruke kirurgisk anastomose og dekker den implanterte protesen med skjoldbruskkjertelklaff, etterfulgt av midlertidig nonoral gastrostomi fôring. Disse grafts var i stand til å rekapitulere funnene av første epitelisering og muskel regenerering rundt implanterte nettsteder, som demonstrert av histologisk analyse. I tillegg ble det observert økte elastinfibre og neovaskularisering i periferien av transplantatet. Derfor presenterer denne modellen en potensiell ny teknikk for omkrets esophageal rekonstruksjon.
Introduction
Behandlingen av esophageal lidelser, som medfødte misdannelser og esophageal karsinommer, kan føre til strukturell segmenttap av spiserøret. I de fleste tilfeller har autologe erstatningstransplantater, for eksempel magetrekkingsrør eller kolonforlag, blitt utført1,2. Imidlertid har disse esophageal erstatninger en rekke kirurgiske komplikasjoner og reoperasjon risiko3. Dermed kan bruk av vevskonstruerte spiserørstillasettere den innfødte spiserøret være en lovende alternativ strategi for til slutt å regenerere tapte vev4,5,6.
Selv om en vevskonstruert spiserør potensielt tilbyr et alternativ til dagens behandlinger av esophageal defekter, er det betydelige barrierer for sin in vivo søknad. Postoperativ anastomotisk lekkasje og nekrose i det implanterte spiserøret stillas fører uunngåelig til en dødelig infeksjon i det omkringliggende aseptiske rommet, for eksempel mediastinum7. Derfor er det ekstremt viktig å forhindre mat eller spyttforurensning i såret og nasogastrisk rør. Gastrostomi eller intravenøs ernæring bør vurderes til primær sårheling er fullført. Hittil har esophageal tissue engineering blitt utført i store dyremodeller fordi store dyr bare kan mates ved intravenøs hyperalimentasjon i 2-4 uker etter implantasjon avstillaset 8. En slik ikke-oral fôringsmodell er imidlertid ikke fastslått for tidlig overlevelse etter esophageal transplantasjon hos små dyr. Dette er fordi dyrene var ekstremt aktive og ukontrollerbare, slik at de ikke kunne holde fôringsrøret i magen i en lengre periode. Av denne grunn har det vært få tilfeller av vellykket esophageal transplantasjon hos små dyr.
I lys av omstendighetene rundt esophageal vev engineering, designet vi en to-lags rørformede stillas bestående av elektrospun nanofiber (indre lag; Figur 1A) og en 3D-trykt tråd (ytre lag; Figur 1B) inkludert en modifisert gastrostomiteknikk. Den interne nanofiber er laget av PU, en ikke-nedbrytbar polymer, og forhindrer lekkasje av mat og spytt. De eksterne 3D-trykte trådene er laget av biologisk nedbrytbar polykaprolacton (PCL), som kan gi mekanisk fleksibilitet og tilpasse seg peristaltisk bevegelse. Human adipose-avledet mesenchymal stamceller (hAD-MSCs) ble seeded på det indre laget av stillaset for å fremme re-epitelization. Nanofiberstrukturen kan lette innledende mucosal regenerering ved å gi et strukturelt ekstracellulær matrise (ECM) miljø for cellemigrasjon.
Vi har også økt overlevelsesraten og bioaktiviteten til de inokulerte cellene gjennom bioreaktordyrking. Det implanterte stillaset var dekket med en skjoldbruskkjertelklaff for å muliggjøre mer stabil regenerering av spiserøret smukosog muskellag. I denne rapporten beskriver vi protokoller for esophageal vev engineering teknikker, inkludert stillas produksjon, mesenchymal stamcellebasert bioreaktor dyrking, en bypass fôring teknikk med modifisert gastrostomi, og en modifisert kirurgisk anastomose teknikk for omkrets esophageal rekonstruksjon i en rotte modell.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eksisterende dyrestudier på kunstig eøser er fortsatt begrenset av flere kritiske faktorer. Det ideelle kunstige esophageal stillaset bør være biokompatibelt og ha gode fysiske egenskaper. Det bør være i stand til å regenerere slimhinneepitelet i tidlig postoperativ periode for å forhindre anastomotisk lekkasje. Regenerering av de indre sirkulære og ytre langsgående muskellagene er også viktig for funksjonell peristaltikk12,13.
<p class="jove_conte…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet av Korea Health Technology R&D Project gjennom Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finansiert av Helse- og velferdsdepartementet, Republikken Korea (stipendnummer: HI16C0362) og Basic Science Research Program gjennom National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av Kunnskapsdepartementet (2017R1C1B2011132). Bioprøvene og dataene som ble brukt i denne studien ble levert av Biobank of Seoul National University Hospital, medlem av Korea Biobank Network.
Materials
| Metabolic cage | TEUNGDO BIO & PLANT | JD-C-66 | |
| Zoletil (50 mg/g dose) | Virbac | 1000000188 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| 2% xylazine hydrochloride (Rumpun) | Byely | Q-0615-035 | |
| 4% paraformaldehyde | BIOSOLUTION | BP031 | |
| 4-0 Vicryl | ETHICON | W9443 | |
| 9-0 Vicryl | ETHICON | W2813 | |
| Antibiotic gentamicin (Septopal). | Septopal | 0409-1207-03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 5470 | |
| Citrate Buffer, ph6.0, 10X | Sigma | C9999 | |
| DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT | VECTOR | SK4100 | |
| Desmin | Santa Cruz | sc-23879 | |
| Elastic stain kit | ScyTeK | ETS-1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethanol | Merck | 64-17-5 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11001 | |
| Heparin cap | Hyupsung Medical | HS-T-05 | |
| hMSC (STEMPRO) / growth medium (MesenPRO RSTM) |
Invitrogen | R7788-110 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain) | VECTOR | PK7800 | |
| Hydrogen peroxide | JUNSEI | 7722-84-1 | |
| Keratin13 | Novus | NBP1-97797 | |
| LIVE/DEAD Viability Assay Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| Matrigel | Corning | 354262 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma | 227056 | |
| Nonadherent 24-well tissue culture plates. |
Corning | 3738 | |
| OsO4 | Sigma | O5500 | |
| Petri dish | Eppendorf | 3072115 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 10X | BIOSOLUTION | BP007a | |
| Polycaprolactone (PCL) polymer | Sigma | 440744 | |
| Polyurethane (PU+A2:A24) polymer | Lubrizol | 2363-80AE | |
| Power Supply | NanoNC | HV100 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Rumpun | Bayer | Q-0615-035 | |
| Silicone T-tube | Sewoon Medical | 2206-005 | |
| Terramycin Eye Ointment | Pfizer Pharmaceutical Korea | W01890011 | |
| Tiletamine/Zolazepam (Zoletil) | Virbac Laboratories | Q-0042-058 | |
| Trichrome stain kit | ScyTeK | TRM-1 | |
| von Willebrand Factor (vWF) | Santa Cruz | sc 14014 |
References
- Irino, T., et al. Long-term functional outcomes after replacement of the esophagus with gastric, colonic, or jejunal conduits: a systematic literature review. Diseases of the Esophagus. 30 (12), 1-11 (2017).
- Flanagan, J. C., et al. Esophagectomy and Gastric Pull-through Procedures: Surgical Techniques, Imaging Features, and Potential Complications. Radiographics. 36 (1), 107-121 (2016).
- Liu, J., Yang, Y., Zheng, C., Dong, R., Zheng, S. Surgical outcomes of different approaches to esophageal replacement in long-gap esophageal atresia: A systematic review. Medicine. (Baltimore). 96 (21), e6942 (2017).
- Luc, G., et al. Decellularized and matured esophageal scaffold for circumferential esophagus replacement: Proof of concept in a pig model. Biomaterials. 175, 1-18 (2018).
- Wang, F., Maeda, Y., Zachar, V., Ansari, T., Emmersen, J. Regeneration of the oesophageal muscle layer from oesophagus acellular matrix scaffold using adipose-derived stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (1), 271-277 (2018).
- La Francesca, S., et al. Long-term regeneration and remodeling of the pig esophagus after circumferential resection using a retrievable synthetic scaffold carrying autologous cells. Scientific Reports. 8 (1), 4123 (2018).
- Ponten, J. E., et al. Early severe mediastinal bleeding after esophagectomy: a potentially lethal complication. Journal of Thoracic Disease. 5 (2), E58-E60 (2013).
- Catry, J., et al. Circumferential Esophageal Replacement by a Tissue-engineered Substitute Using Mesenchymal Stem Cells: An Experimental Study in Mini Pigs. Cell Transplant. 26 (12), 1831-1839 (2017).
- Lee, S. J., et al. Characterization and preparation of bio-tubular scaffolds for fabricating artificial vascular grafts by combining electrospinning and a 3D printing system. Physical Chemistry Chemical Physics. 17 (5), 2996-2999 (2015).
- Kim, I. G., et al. Tissue-Engineered Esophagus via Bioreactor Cultivation for Circumferential Esophageal Reconstruction. Tissue Engineering Part A. , (2019).
- Wu, Y., et al. Combinational effects of mechanical forces and substrate surface characteristics on esophageal epithelial differentiation. Journal of Biomedical Materials Research A. 107, 552-560 (2019).
- Jensen, T., et al. Polyurethane scaffolds seeded with autologous cells can regenerate long esophageal gaps: An esophageal atresia treatment model. Journal of Pediatric Surgery. 3468 (18), 30685-30687 (2018).
- Nakase, Y., et al. Intrathoracic esophageal replacement by in situ tissue-engineered esophagus. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136 (4), 850-859 (2008).
- Kwiatek, M. A., et al. Mechanical properties of the esophagus in eosinophilic esophagitis. Gastroenterology. 140 (1), 82-90 (2011).
- Anjum, F., et al. Biocomposite nanofiber matrices to support ECM remodeling by human dermal progenitors and enhanced wound closure. Scientific Reports. 7 (1), 10291 (2017).
- Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. PCL and PCL-gelatin nanofibers as esophageal tissue scaffolds: optimization, characterization and cell-matrix interactions. Journal of Biomedical Nanotechnology. 9 (9), 1540-1555 (2013).
