Summary
Özofagus rekonstrüksiyonu zorlu bir işlemdir ve özofagus mukozası ve kasının yenilenmesini sağlayan ve yapay greft olarak implante edilebilen doku mühendisliğiöz bir özofagusun geliştirilmesi gereklidir. Burada, iskele imalatı, biyoreaktör ekimi ve çeşitli cerrahi teknikler de dahil olmak üzere yapay bir özofagus oluşturmak için protokolümüzü saklı yız.
Abstract
Çevresel özofagus rekonstrüksiyonu için biyouyumlu malzemelerin kullanılması sıçanlarda teknik olarak zorlu bir görevdir ve beslenme desteği ile optimal bir implant tekniği gerektirir. Son zamanlarda, özofagus doku mühendisliği birçok girişimleri olmuştur, ancak peristalsis özel ortamda erken epitelizasyon zorluk nedeniyle başarı oranı sınırlı olmuştur. Burada, iki katmanlı tübüler iskele, mezenkimal kök hücre tabanlı biyoreaktör sistemi ve modifiye edilmiş baypas besleme tekniği ile özofagus mukozası ve kas tabakalarının yenilenmesini iyileştirebilen yapay bir özofagus geliştirdik. gastrostomi. İskele poliüretan yapılır (PU) üç boyutlu (3D) baskılı polikaprolakon iplikçik dış duvara sarılmış silindirik bir şekil nanofibers. Transplantasyondan önce, insan kaynaklı mezenkimal kök hücreler iskelenin lümenine tohumlanmış ve hücresel reaktiviteyi artırmak için biyoreaktör ekimi yapılmıştır. Cerrahi anastomoz uygulayarak ve implante edilen protezi tiroid bezi flebi ile kaplayarak greft sağkalım oranını artırdık ve ardından geçici oral olmayan gastrostomi beslenmesi yaptık. Bu greftler histolojik analizde gösterildiği gibi implante edilen bölgelerin çevresinde ilk epitelizasyon ve kas rejenerasyonu bulgularını tekrar ortaya çıkarabildiler. Buna ek olarak, greft çevresinde artmış elastin lifleri ve nevasaskülarizasyon gözlendi. Bu nedenle, bu model çevresel özofagus rekonstrüksiyonu için potansiyel yeni bir teknik sunar.
Introduction
Konjenital malformasyonlar ve özofagus karsinomları gibi özofagus bozukluklarının tedavisi özofagusun yapısal segment kaybına yol açabilir. Çoğu durumda, gastrik pull-up kanalları veya kolon interpozisyonları gibi otolog replasman greftleri1,2yapılmıştır. Ancak bu özofagus replasmanlarının çeşitli cerrahi komplikasyonları ve reoperasyon risklerivardır 3. Böylece, doku mühendislik özofagus iskeleleri yerli özofagus taklit kullanımı sonuçta kayıp dokuların yenilenmesi için umut verici bir alternatif strateji olabilir4,5,6.
Doku ile tasarlanmış bir özofagus, özofagus defektlerinin mevcut tedavilerine potansiyel olarak bir alternatif sunsa da, in vivo uygulaması için önemli engeller vardır. Postoperatif anastomoz kaçağı ve implante özofagus iskelesi nekroz kaçınılmaz mediasten 7 gibi çevreleyen aseptik alan, ölümcül bir enfeksiyona yol . Bu nedenle yara ve nazogastrik tüpte gıda veya tükürük kontaminasyonunu önlemek son derece önemlidir. Primer yara iyileşmesi tamamlanana kadar gastrostomi veya intravenöz beslenme düşünülmelidir. Büyük hayvanlar iskele8implantasyonundan sonra 2-4 hafta boyunca sadece intravenöz hiperalimentasyon ile beslenebilir, çünkü bugüne kadar, özofagus doku mühendisliği büyük hayvan modellerinde yapılmıştır . Ancak küçük hayvanlarda özofagus nakli sonrası erken sağkalım için böyle bir oral olmayan beslenme modeli oluşturulmamıştır. Bunun nedeni hayvanların son derece aktif ve kontrol edilemeyen olmalarıdır, bu yüzden beslenme tüpünü uzun süre midelerinde tutamamışlardır. Bu nedenle küçük hayvanlarda az sayıda özofagus nakli vakası olmuştur.
Özofagus doku mühendisliği koşulları göz önüne alındığında, elektrospun nanofibers (iç tabaka; Şekil 1A) ve 3B baskılı iplikçik (dış tabaka; Şekil 1B) modifiye gastrostomi tekniği ni de içeren. Dahili nanofiber PU yapılır, bir un-gradable polimer, ve gıda ve tükürük sızıntısı nı önler. Dış 3D baskılı iplikçikler biyobozunur polikaprolakondan yapılmıştır (PCL), mekanik esneklik sağlayabilir ve peristaltik harekete uyum. İnsan yağtüretilmiş mezenkimal kök hücreler (hAD-MSCs) yeniden epitelizasyonu teşvik etmek için iskelenin iç tabakasında tohumlandı. Nanofiber yapısı hücre göçü için yapısal bir hücre dışı matriks (ECM) ortamı sağlayarak ilk mukozal rejenerasyonu kolaylaştırabilir.
Ayrıca biyoreaktör ekimi yoluyla aşılanmış hücrelerin sağkalım oranını ve biyoaktivitesini artırdık. İmplante edilen iskele, özofagus mukozası ve kas tabakasının daha istikrarlı bir şekilde yenilenmesini sağlamak için tiroid bezi flebi ile kaplandı. Bu raporda, iskele imalatı, mezenkimal kök hücre bazlı biyoreaktör ekimi, modifiye gastrostomi ile baypas besleme tekniği ve modifiye cerrahi dahil olmak üzere özofagus doku mühendisliği teknikleri için protokoller açıklanmaktadır. bir sıçan modelinde çevresel özofagus rekonstrüksiyonu için anastomoz tekniği.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm yöntemler, Seul Ulusal Üniversitesi Hastanesi'nin Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC No. 17-0164-S1A0) tarafından onaylanmıştır.
1. İskele İmalatı
NOT: İki katmanlı özofagus iskeleleri elektrospinning ve 3D baskı birleştirilerek üretilmektedir. Boru iskelesinin iç zarı elektrospinning poliüretan (PU) ile üretilen ve dönen paslanmaz çelik mandreller ile9.
- Tübüler PU nanofiberlerin hazırlanması için, oda sıcaklığında 8 saat boyunca N,N-dimethylformamide (DMF) karıştırılarak PU polimerin %20 (w/v) çözeltisini hazırlayın.
- Pu çözeltisini künt metal iğne (22 G) ile şırınganın üzerine yerleştirin ve dönen paslanmaz çelik mandrellere (çap = 2 mm) iğne ucu ile dönen kolektör arasında 30 cm mesafede elektrospin yerleştirin.
NOT: Güç kaynağı 15 kV potansiyelyüksek voltajlı doğru akıma ayarlanır. Çözeltinin besleme hızı şırınga pompası kullanılarak 0,5 mL/h olarak sabitlenir. - Mandrel'in yüzeyinde 3,14 m/s'de dönen boruhalinde bir nanofiber tabaka yapın.
- Artık çözücünün tamamen temizlenmesi için PU nanofiber'i bir gecede 40 °C'de bir vakum fırınında kurutun.
NOT: Özofagus iskelesinin 3Boyutlu baskılı dış duvarı hızlı bir prototipleme sistemi kullanılarak hazırlanır. 3D baskı ekipmanı bir dağıtıcı, meme, sıkıştırma/ısı denetleyicisi, 3 eksenli dönüştürme aşaması ve yazılım sisteminden oluşur. - PCL peletler 100 °C'de ısıtma silindirinde çözülür ve biyoplotting sisteminin kontrolü altında yüksek basınçta (7 bar) nanofiberlerin yüzeyine basılır. Nozul boyutu 300 μm ve iplikçik mesafesi 700 μm'dir.
- Mandrel iki katmanlı iskele çıkardıktan sonra, ultraviyole ışık altında% 70 etanol ıslatarak sterilize.
NOT: Daha önceki çalışmalarda iskelenin daha ayrıntılı özellikleri bildirilmiştir10.
2. Greftlerde Hücre Tohumlama ve Biyoreaktör Yetiştiriciliği
NOT: Bir şirketten satın alınan insan yağtürtül mezenkimal kök hücreleri (hMSCs) değişiklik yapılmadan kullanılmıştır.
- Hücre naklinden önce, 3D baskılı yemek borusunu ultraviyole ışık altında 1 saat sterilize edin, 10 dakika etanolile ıslayın ve fosfat tamponlu salin (PBS) ile 3 kat yıkayın.
- Kültür ve büyüme orta (bazal orta / büyüme takviyesi) hMSCs genişletmek. İki katmanlı borulu iskeleler nonadherent 24 kuyu doku kültür plakaları transfer edildi.
- Hücreleri iskelenin iç yüzeyine takmak için hMSC süspansiyonu büyüme ortamını içeren bazal membran matrisinde 1 x 106 hücre/mL yoğunlukta hafifçe ekleyin.
- İki katmanlı borulu iskelenin iç yüzeyine aynı şekilde bodrum membran matris süspansiyonuna birikintisi yatırın.
- HMSC tohumlu boru iskelesini, pulsatil akış biyoreaktör sistemi kullanarak biyoreaktörün kültür odasındaki akrilik tutucuya sıkıca sabitle.
NOT: Özel olarak tasarlanmış biyoreaktör sistemi bir pompa, kabarcık kapanı, akış odası, basınç göstergesi, kontrol edilebilir vana ve orta rezervuaroluşur. Kültür odasında kesme stresi uygularken, 1-2 dk11dinlenme süresi sağlar. - Kültür odasına büyüme ortamı ekleyin ve %5 CO210içeren nemli bir atmosfer altında 0,1 dyne/cm2 akışa bağlı kesme gerilimi uygulayın.
NOT: Akışa bağlı kesme stresinin değeri, insan vücudundan elde edilen özofagus dokusunun peristalsisinin simüle edilerek hesaplanmıştır10. - Üreticinin talimatlarına göre live/DEAD Canlılık Teşp kiti kullanarak 5 gün sonra biyoreaktör ekimi yapılmadan iki katmanlı borulu iskelelerin iç yüzeylerinde hücre yanıtlarını belirleyin. Z-stack aracını kullanarak konfokal mikroskopi ile görüntü alın.
- Üçüncü gün, taramalı elektron mikroskobu (SEM) aracılığıyla hMSC tohumlu boru iskelesinin yüzey morfolojisini gözlemleyin.
- 24 saat için %2,5 glutaraldehit ve OsO4 ile hMSC ile kuluçkaya yatan iskeleyi düzeltin ve etanol ile susuz kalın.
- Argon atmosferik koşullarda bir sputter coater kullanarak platin ile sabit hMSCs kat ve 25 kV hızlanan voltajda SEM görüntüleri elde.
3. Hayvan Cerrahisi için Cerrahi Hazırlık
NOT: Hem gastrostomi hem de özofagus transplantasyonu ndan önce cerrahi preparatlar uygulanır.
- Steril cerrahi aletleri kurun: Neşter bıçak, Weitlaner retraktör, mikroiğne tutucu, mikrosutür forceps, mikrodoku forceps, mikrosisör, Mayo-Hegar iğne tutucu, çalışma makas, iris makas, pansuman, doku forceps, kıymık forceps, iris forceps, 5 mL şırınga (21 G iğne), 10 mL şırınga (22 G iğne), 9-0 poliamid sütür, 4-0 poliglactin sütür.
- Kiremit/zolazepam (50 mg/g doz) ve %2 ksilazin hidroklorür (2 mg/kg doz) intramüsküler enjeksiyonu ile hayvanı anestezi edin.
NOT: Özofagus naklinde 398-420 g ağırlığında erişkin Sprague-Dawley (SD) sıçanlar kullanıldı. - Cerrahi örtüye geçmeden önce, kuyruk larını çengelle çimdikleyerek hayvanın uygun anestezik durumunu kontrol edin.
- Hayvanı steril örtüye bir supine pozisyonda yerleştirin ve kılları boyundan (özofagus ekimi için) veya karından (gastrostomi için) çıkarmak için makas kullanın. Sonra betadine ve% 70 etanol ile cerrahi site ovmak.
- Kesiden önce, ağrı kesici için buprenorfin (0.05-0.1 mg/kg) gibi bir analjezik deri altı enjekte edin.
4. Gastrostomi Cerrahisi Sıçanlarda T-tüp kullanma
NOT: Tüm deneysel hayvanlarda geçici bypass nonoral tüp beslemesi için modifiye gastrostomi yapıldı (n = 5).
- Ameliyattan bir gün önce fareleri oruçlun. Bölüm 3'te olduğu gibi ameliyat hazırlayın.
- Anestezi li sıçanların deri ve karın kaslarının orta hat kesisi ile mide maruz.
- Bir neşter bıçak ile ön mide duvarında 3 mm delik oluşturun.
- Silikon T-tüpünün ucunu defekt bölgesine takın ve mide duvarına sabitle.
- T-tüpün mide duvarından ayrılmasın diye düzgün bir şekilde dikiş atın.
- İmplante edilen T-tüpün distal ucunu subkutan tünelden boynun arkasına doğru götürün.
- Mide içeriğinin geriye doğru akmasını önlemek için heparin kapağını T-tüpün ucuna takın.
NOT: T-tüpün ucunu heparin kapağına bağlamak için anjiyokateter kullanın. - 4-0 poliglactin sütür kullanarak karın duvarı ve cilt tüm katmanları dikiş.
- Gastrostomi tamamlandıktan sonra tüm deneysel sıçanları metabolik bir kafeste ayrı tutun.
5. Özofagus Transplantasyonu
NOT: İki katmanlı boru lu iskelenin özofagus nakli gastrostomiden 1 hafta sonra yapılır (n = 5). Transplantasyondan önce, hMSC'leri (hücre yoğunluğu: bazal membran matrisinde 1 x 106 hücre/mL) her iskelenin iç duvarına aşılayın ve biyoreaktör sisteminde 3 gün kuluçkaya yatırın. Cerrahi işlem aşağıdaki gibidir.
- Model hayvanların boyun kıllarını çıkarın ve aseptik cerrahi için cerrahi alanın standart draping yapmak.
NOT: Hayvan üzerinde şüpheci cerrahi korumak için büyük bir tıraş alanı oluşturmak önerilir. - Boynun anterior median insizyonu sonra, kayış kasları ayırmak ve trakeoözofageal yapısını ortaya çıkarmak.
- Segmenti kesmeden önce ağız dan vagus sinirini kesip, aksi takdirde hayvanın solunumtehlikeye.
- Büyütme altında, trakea yemek borusunun sol tarafı izole ve dikkatle tiroid bezinden üst kısmını ayırın.
- Cerrahi makas kullanarak yemek borusunun tüm katmanlarını içeren 5 mm uzunluğunda tam çevresel defekt oluşturun.
NOT: Özofagus naklinden önce, hazırlanan iskeleleri, nakil bölgesinin uzunluğuna uyacak şekilde cerrahi makas kullanarak kesin. - Mikroskop altında, 9-0 dikiş ipliği kullanarak distal özofagus defektinin her iki ucunda mikroanastomoz yapın. Üst özofagus kalıntısı ve iskelesağ inferoposterior marjı arasında ilk sütür yerleştirin. Üst özofagus kalıntısı ile iskele arasında sağdan sola doğru dikiş atmaya devam edin. Alt yemek borusu kalıntısının üst kenar boşluğu yla aynı şekilde iskeleyi anastomozlayın.
NOT: Özofagus transplantasyonu için klinik cerrahide kullanılan mikrovasküler anastomoz u yapın. İmplant bölgesinin hassas ve su geçirmez dikişleri için bir mikroskopla çalışın. - Daha sonra, greftler için istikrarlı bakım ve vasküler kaynağı sağlamak için nakledilen site üzerinde çevreleyen tiroid bezi flebi yatıyordu.
- Transplantasyondan sonra deri altı kas ve deri dokusunu 4-0 vicryl sütür ile dikin.
- Tüm deneysel sıçanları tek tek metabolik kafeslerde tutun.
6. Ameliyat sonrası prosedürler
NOT: Postoperatif işlemler hem gastrostomi hem de özofagus transplantasyonu sonrası yapılır.
- Karın yarası kapatıldıktan sonra, bireysel metabolik kafesler içine sıçan koymak ve hipotermi önlemek için kızılötesi ısınma cihazları üzerine kafesler yerleştirin.
- Onlar elde edene kadar hayvanları izlemek ve sternal recumbency korumak (yani, göğüs üzerinde dik yatarken).
- Cerrahi bölgede iltihabı en aza indirmek için, antibiyotik gentamisin (20 mg / kg) sıçanlara günlük uygulayın.
- Çalışmanın bitiş noktasına kadar üçüncü postoperatif günde oral sıvı beslemeye başlayın. Tüm beslenme formülünü (20.6 g/100 ml [g%] karbonhidrat, %3.8 protein, %0.2 gr yağ) ameliyattan sonra güne başlayan heparin kapağı ile günde 3kat tedarik edin.
- Hayvanların görünümünü ve vücut ağırlığını her gün kontrol edin. Kendine zarar veren kesi bölgesi veya tüp alımına karşı direnç gibi davranışların yanı sıra çeşitli cerrahi komplikasyonları yönetin. Sıçan modellerinin vücut ağırlığı hızla azaldığında 20% veya daha fazla, CO2 inhalasyon ile ötenazi gerçekleştirin.
7. Histoloji ve immünohistokimya
NOT: Histolojik analiz için ötanazi yapılan hayvanların özofagus dokusunun tamamı cerrahi makas kullanılarak elde edilir. Hematoksilin ve eozin boyama ve Masson'un trikrom boyama sı standart histolojik teknikler kullanılarak yapıldı. İmmünohistokimya aşağıdaki protokole göre yapıldı.
- Nakledilen bölgeleri içeren tüm yemek borusunu %4 paraformaldehitle düzeltin. Bir parafin bloğu oluşturun ve 4 μm kalınlığında kesin.
- Doku bölümlerini deparafinize ve bir etanol serisi onları dehydrate. Sitrat tampon ve mikrodalga 10 dakika boyunca ısı doku slaytlar batırın. Hücreleri 20 dk soğuk PBS ile soğutun. 6 dk için %3 hidrojen peroksit batırın ve 10 dk PBS ile yıkayın.
- Doku bölümlerinin nonspesifik reaksiyonlarını engellemek için oda sıcaklığında 1 saat boyunca %3 büyükbaş serum albumin (BSA) inkübül.
- 5 dk. Desmin (1:200'e seyreltilmiş), keratin 13 (1:100'e seyreltilmiş) ve von Willebrand Factor (vWF; 1:100'e seyreltilmiş) 4 °C'de bir gecede primer antikorlarla 3 kat Yıkayın.
- 15 dakika PBS ile 3x yıkayın. Oda sıcaklığında Desmin ve Keratin 13 için 1:500 konsantrasyonda uygun ikincil antikor ile incubate. Daha sonra slaytları PBS ile iki kez 10 dakika yıkayın.
NOT: vWF için doku bölümleri horseradish peroksidaz konjuge kit kullanılarak inkübe edildi (Malzeme Tablosunabakınız) ve daha sonra 3,3'-diaminobenzidin (DAB) kullanılarak görselleştirildi. - Montaj ortamı içeren bir cam kapak ve 4',6-diamidino-2-fenolindole (DAPI) kullanarak monte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, PU-PCL iki katmanlı borulu iskelenin üretim sürecinin şematik diyagramını göstermektedir. PU çözeltisi 18 G iğneden 200 μm kalınlığında silindirik bir iç yapı yapmak için elektrospun edildi. Daha sonra, erimiş PCL düzenli aralıklarla PU nanofiber dış duvarına basıldı. Tamamlanmış boru iskelesinin iç ve dış duvarlarının yüzey morfolojisi taramalı elektron mikroskopi görüntülerinde görülebilir.
Şekil 2 dış besin kaynağı için bir sıçan bir gastrostomi tüpü ekleme sürecini gösterir (Şekil 2A). T şeklindeki silikon tüp mide duvarına yerleştirildi ve dikildi (Şekil 2B). Tüp daha sonra subkutan tünelden boynun arkasına taşındı ve heparin kapağıile bağlandı (Şekil 2C). Tüp sıvı gıda enjeksiyonu kolaylaştırır. Ayrıca tüpler aracılığıyla mide içeriğinin ters akışını yasaklar.
Şekil 3, iskelenin iç duvarında hücre aşılama işlemini, biyoreaktör ekimini ve özofagus naklini göstermektedir. hMSC gömülü bazal membran matris enjeksiyon yoluyla iskelenin iç duvarına eşit olarak uygulandı (Şekil 3A). SEM görüntüsü hücreye bağlı iç yüzeyin morfolojisini gösterir. Canlı /ölü boyama iki katmanlı borulu iskele (luminal yüzey) üzerinde hücre canlılığını analiz etmek için çoğu hücre canlı olduğunu gösterdi, ve onlar 5 gün içinde nanofiber yapısı üzerinde iyi yayıldı. Hücrelerle aşılanmış iskele biyoreaktöre sabitlendi ve kesme gerilimi pompa tarafından uygulandı (Şekil 3B). Biyoreaktör ekimi de dahil olmak üzere hMSC tohumlu boru lu iskeleler mikrosutür teknikleri ile tam çevresel özofagus defektleri ile sıçanlara nakledildi. Greft, implante edilen alanın stabil fiksasyonu ve vasküler kaynağı için tiroid bezi flebi ile kaplandı(Şekil 3C). Nakil sonrası sıçanların kilo değişimi deney sonuna kadar gözlendi. Özofagus nakli yapılan sıçanlar 9. Sonuç olarak, çoğu hayvan 15 gün içinde öldü.
Şekil 4 greft implantasyonu sonrası özofagus rejenerasyonu göstermektedir. Sıçanların çoğunda saç toplarının neden olduğu neoözofageal obstrüksiyon gelişmesine rağmen, herhangi bir deneysel sıçanda perforasyon, fistül ile anastomoz sızıntısı, seroma birikimi, apse oluşumu veya çevresindeki yumuşak doku nekrozu gibi brüt bir bulgu yoktu. Transplantasyon bölgesinin reepitelizasyonu keratin 13 için immünoresans boyama ile doğrulandı. Kollajen tabakasının morfolojisi ve elastin lifleri rejenerasyon alanında açıkça doğrulandı. Bol elastin ve kollajen liflerin varlığı daha iyi mekanik özelliklere katkıda bulunabilir. Özofagus kas tabakasının rejenerasyonu desmin immünohistokimya sı yiti ve bu bölgede bol miktarda nekolasializasyon gözlendi.
Şekil 1: 2 katmanlı borulu iskelelerin imalatında kullanılan sürecin şematik illüstrasyonu. PU(A)kullanarak elektrospinning ile iç membran imal edildikten sonra, boru iskelesinin yapısal gücü solventsiz bir 3D baskı sistemi kullanılarak membranın dış yüzeyine iplikler eklenerek pekiştirilmiştir(B). SEM görüntüsü, 2 katmanlı borulu iskelenin iç ve dış katmanlarının morfolojisini gösterir. (Kısaltmalar: PU = poliüretan). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Gastrostomi. (A) Mide duvarına T-tüp takılması yoluyla gastrostomi tekniklerini gösteren şematik bir diyagram. (B) Ön midenin ortasında bir delik oluşur ve T-tüpü ucu ön mideye yerleştirilir. (C) T-tüpünün giriş kısmı occiputun ortasında heparin kapağı ile yer alır. Aşağıdaki şekil farklı bileşenleri ile bir T-tüp gastrostomi cihazı gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Özofagus transplantasyonu. (A) Bazal membran matrisinde kapsüllenen hMSC'ler, iki katmanlı borulu iskelenin iç katmanlarıüzerine tohumlandı. SEM görüntüsü iç duvardaki hMSC'lerin morfolojisini gösterir. Aşılanmış hücrelerin canlılığı da canlı ölü boyama (yeşil = canlı hücreler) ile doğrulandı. HMSC tohumlu iskeleler hemen bir biyoreaktör sisteminde kuluçkaya yatırıldı(B), ve daha sonra doku mühendisliği özofagus servikal özofagus içine implante edildi(C). İmplante edilen bölge stabil özofagus rekonstrüksiyonu (oklar) için tiroid bezi flebi ile kaplandı. (D) Özofagus transplantasyonu sonrası kilo kaybı çalışmaları. Kilo kaybı sıçanların ilk kilo mutlak değişim olarak belirlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Ortotopik iskele implantasyonundan 2 hafta sonra yeniden inşa edilen özofagusun tüm histolojisi. Masson'un trikrom boyama implante edilen bölgelerin etrafındaki kollajen birikimini gösteriyor. Özofagus kası ve mukoza tabakalarının rejenerasyonu sırasıyla desmin (yeşil) ve keratin 13 (kırmızı) immünboyama ile doğrulandı. Ayrıca, neovaskülerizasyon (oklar) açıkça rejenere mukozal tabaka çevresinde gözlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yapay özofaji üzerinde mevcut hayvan çalışmaları hala çeşitli kritik faktörler ile sınırlıdır. İdeal yapay özofagus iskelesi biyouyumlu olmalı ve mükemmel fiziksel özelliklere sahip olmalıdır. Anastomoz sızıntısını önlemek için erken postoperatif dönemde mukozal epiteli yenileyebilmeli. İç dairesel ve dış boylamsal kas tabakalarının yenilenmesi de fonksiyonel peristalsis için önemlidir12,13.
Yemek borusunun mekanik özellikleri önemlidir, çünkü yemek borusu solunum sırasında çöker ve yutma sırasında açılır, bir geri tepme fenomeni ile maksimal germe sürekli maruz kalma ile14. İmplante edilen iskele de bu mekanik özelliklere sahip olmalıdır. İmplante edilen özofagusun viskoelastisi, özofagus yoluyla peristaltik hareketin tekrarlayan rampa gevşemesi için yeterli olmalıdır. Çok zayıf olan iskeleler yırtılabilir veya sızabilir ve alıcıda ciddi durumlara (örn. mediastinit) neden olabilir. Buna karşılık, çok sert bir iskele özofagus lümen içine şişkinlik ve gıda geçişini önlemek olabilir. Electrospun nanofibers özofagus rekonstrüksiyonu için çok olumlu fiziksel özelliklere sahiptir. ECM'nin topografik yapısı, özofagus tabakalarında epitel hücrelerinin göçü ve farklılaşması için elverişli bir ortam sağlar15. Ayrıca tükürük ve çeşitli patojenlerin sızıntısını önleyen bir nanopore yapısı vardır16. Ancak, elektrospun nanofibers yapılmış iskeleler yumuşak mekanik özellikleri nedeniyle sınırlı kullanıma sahiptir. Bu sorunu çözmek için, 3D baskı teknolojisini kullanarak mekanik mukavemetlerini geliştirdik. Nanofiber'in dış tabakasındaki 3Boyutlu baskılı iplikçik 780 μm genişliğe sahiptir ve iç gözenek yapısı oldukça geniştir. Çevre dokuların yenilenmesine rehberlik etmek yerine özofagus girişimleri için fiziksel destek sağlar.
Bu çalışmada, çevresel özofagus defektleri biyoreaktör kültür greftlerinde 2 haftaya kadar tamamen iyileşti, ancak tüm deneysel sıçanlar ameliyattan sonraki 15 gün içinde öldü. Ölümlerin çoğu anastomoz bölgesine yakın gıda ve tükürük sızıntıları nedeniyle peritonit ve yetersiz beslenme neden oldu. Tüm hayvanlar bir haftaya kadar serbestçe sıvı diyet tüketirken, yara iyileşmesi ilerledikçe, saç topu yutma nedeniyle yeniden inşa edilen yemek borusunda istenmeyen mekanik tıkanıklık oluştu. Bu fenomen implante olmayan dinamik olmayan iskeleler içinde tam sindirim bozukluğuneden olduğu gösterilmiştir. Bu teknik sorunların üstesinden gelmek için çeşitli seçenekler vardır. İlk olarak, özofagus peristalsistaklit edebilir son derece elastik özofagus implantı gelişimi. İkincisi, saç yutma önlemek için tüysüz fareler kullanarak hayvan çalışmaları. Üçüncü olarak, safra stent implant çökmesi ve anastomoz hasarı en aza indirmek için iskele ile aynı anda uygulanabilir. Ayrıca, özofagus iskelesi implantasyonuna mikrovasküler anastomoz uygulaması tükürük sızıntısını tamamen önlemek için önemlidir. Çıplak gözleri kullanarak geleneksel dikiş tekniği sıçan modellerinde su geçirmez yapmak son derece zordur.
Güvenilir bir vasküler araç besin için gereklidir, büyüme faktörleri, ve yenilenme erken aşamalarında oksijen kaynağı. Tiroid bezi yemek borusunun yakınında bulunan vasküler dokudur. Biz sıçan modelinde kolay erişilebilirlik nedeniyle çevresel özofajektomi sonrası tiroid bezi flebi kullanılır. Sonuç olarak, sıçan modelinde özofagus rekonstrüksiyonunun zorluklarının üstesinden gelmek için çeşitli preklinik teknikler öneriyoruz. Bu çalışma, geleneksel küçük hayvan özofagus ekimi sınırlamaları aşmak için iyi bir alternatif sunuyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bu çalışma için tasarlanan biyoreaktör sistemi ticarileştirilmiştir (model numarası: ACBF-100).
Acknowledgments
Bu araştırma, Kore Sağlık Endüstrisi Geliştirme Enstitüsü (KHIDI) aracılığıyla Kore Sağlık Teknolojisi Ar-Ge Projesi tarafından desteklenmiştir, Sağlık ve Refah Bakanlığı tarafından finanse edilen, Kore Cumhuriyeti (hibe numarası: HI16C0362) ve Temel Bilim Araştırma Eğitim Bakanlığı tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) programı (2017R1C1B2011132). Bu çalışmada kullanılan biyoörnekler ve veriler Kore Biobank Network üyesi Olan Seul Ulusal Üniversitesi Hastanesi Biyobankası tarafından sağlanmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Metabolic cage | TEUNGDO BIO & PLANT | JD-C-66 | |
| Zoletil (50 mg/g dose) | Virbac | 1000000188 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| 2% xylazine hydrochloride (Rumpun) | Byely | Q-0615-035 | |
| 4% paraformaldehyde | BIOSOLUTION | BP031 | |
| 4-0 Vicryl | ETHICON | W9443 | |
| 9-0 Vicryl | ETHICON | W2813 | |
| Antibiotic gentamicin (Septopal). | Septopal | 0409-1207-03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 5470 | |
| Citrate Buffer, ph6.0, 10X | Sigma | C9999 | |
| DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT | VECTOR | SK4100 | |
| Desmin | Santa Cruz | sc-23879 | |
| Elastic stain kit | ScyTeK | ETS-1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethanol | Merck | 64-17-5 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11001 | |
| Heparin cap | Hyupsung Medical | HS-T-05 | |
| hMSC (STEMPRO) / growth medium (MesenPRO RSTM) |
Invitrogen | R7788-110 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain) | VECTOR | PK7800 | |
| Hydrogen peroxide | JUNSEI | 7722-84-1 | |
| Keratin13 | Novus | NBP1-97797 | |
| LIVE/DEAD Viability Assay Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| Matrigel | Corning | 354262 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma | 227056 | |
| Nonadherent 24-well tissue culture plates. |
Corning | 3738 | |
| OsO4 | Sigma | O5500 | |
| Petri dish | Eppendorf | 3072115 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 10X | BIOSOLUTION | BP007a | |
| Polycaprolactone (PCL) polymer | Sigma | 440744 | |
| Polyurethane (PU+A2:A24) polymer | Lubrizol | 2363-80AE | |
| Power Supply | NanoNC | HV100 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Rumpun | Bayer | Q-0615-035 | |
| Silicone T-tube | Sewoon Medical | 2206-005 | |
| Terramycin Eye Ointment | Pfizer Pharmaceutical Korea | W01890011 | |
| Tiletamine/Zolazepam (Zoletil) | Virbac Laboratories | Q-0042-058 | |
| Trichrome stain kit | ScyTeK | TRM-1 | |
| von Willebrand Factor (vWF) | Santa Cruz | sc 14014 |
References
- Irino, T., et al. Long-term functional outcomes after replacement of the esophagus with gastric, colonic, or jejunal conduits: a systematic literature review. Diseases of the Esophagus. 30 (12), 1-11 (2017).
- Flanagan, J. C., et al. Esophagectomy and Gastric Pull-through Procedures: Surgical Techniques, Imaging Features, and Potential Complications. Radiographics. 36 (1), 107-121 (2016).
- Liu, J., Yang, Y., Zheng, C., Dong, R., Zheng, S. Surgical outcomes of different approaches to esophageal replacement in long-gap esophageal atresia: A systematic review. Medicine. (Baltimore). 96 (21), e6942 (2017).
- Luc, G., et al. Decellularized and matured esophageal scaffold for circumferential esophagus replacement: Proof of concept in a pig model. Biomaterials. 175, 1-18 (2018).
- Wang, F., Maeda, Y., Zachar, V., Ansari, T., Emmersen, J. Regeneration of the oesophageal muscle layer from oesophagus acellular matrix scaffold using adipose-derived stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (1), 271-277 (2018).
- La Francesca, S., et al. Long-term regeneration and remodeling of the pig esophagus after circumferential resection using a retrievable synthetic scaffold carrying autologous cells. Scientific Reports. 8 (1), 4123 (2018).
- Ponten, J. E., et al. Early severe mediastinal bleeding after esophagectomy: a potentially lethal complication. Journal of Thoracic Disease. 5 (2), E58-E60 (2013).
- Catry, J., et al. Circumferential Esophageal Replacement by a Tissue-engineered Substitute Using Mesenchymal Stem Cells: An Experimental Study in Mini Pigs. Cell Transplant. 26 (12), 1831-1839 (2017).
- Lee, S. J., et al. Characterization and preparation of bio-tubular scaffolds for fabricating artificial vascular grafts by combining electrospinning and a 3D printing system. Physical Chemistry Chemical Physics. 17 (5), 2996-2999 (2015).
- Kim, I. G., et al. Tissue-Engineered Esophagus via Bioreactor Cultivation for Circumferential Esophageal Reconstruction. Tissue Engineering Part A. , (2019).
- Wu, Y., et al. Combinational effects of mechanical forces and substrate surface characteristics on esophageal epithelial differentiation. Journal of Biomedical Materials Research A. 107, 552-560 (2019).
- Jensen, T., et al. Polyurethane scaffolds seeded with autologous cells can regenerate long esophageal gaps: An esophageal atresia treatment model. Journal of Pediatric Surgery. 3468 (18), 30685-30687 (2018).
- Nakase, Y., et al. Intrathoracic esophageal replacement by in situ tissue-engineered esophagus. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136 (4), 850-859 (2008).
- Kwiatek, M. A., et al. Mechanical properties of the esophagus in eosinophilic esophagitis. Gastroenterology. 140 (1), 82-90 (2011).
- Anjum, F., et al. Biocomposite nanofiber matrices to support ECM remodeling by human dermal progenitors and enhanced wound closure. Scientific Reports. 7 (1), 10291 (2017).
- Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. PCL and PCL-gelatin nanofibers as esophageal tissue scaffolds: optimization, characterization and cell-matrix interactions. Journal of Biomedical Nanotechnology. 9 (9), 1540-1555 (2013).
