मस्तिष्क ऊतक में एमिलॉयड प्लेक की लेबलिंग और इमेजिंग प्राकृतिक पॉलीफेनोल करक्यूमिन का उपयोग करते हुए
Summary
Curcumin लेबल और मस्तिष्क के ऊतकों में एमिलॉयड बीटा प्रोटीन प्लेक के इमेजिंग के लिए एक आदर्श fluorophore है क्योंकि एमिलॉयड बीटा प्रोटीन के लिए अपनी अधिमानी बाध्यकारी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अन्य पारंपरिक एमिलॉयड बाध्यकारी रंगों के साथ अपनी संरचनात्मक समानताएं. यह लेबल और छवि amyloid बीटा प्रोटीन प्लेक और अधिक कुशलता से और सस्ते में पारंपरिक तरीकों की तुलना में इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
एमिलॉयड बीटा प्रोटीन (एजेड) का अतिरिक्त और इंट्रासेल्यूलर रिक्त स्थान में जमाव अल्जाइमर रोग (एडी) की पहचान रोगों में से एक है। इसलिए, ई. मस्तिष्क के ऊतकों में एजेड की उपस्थिति का पता लगाने के लिए नए उपचार के विकास के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है ई. की प्रगति को रोकने के लिए. कई शास्त्रीय एमिलॉयड बाइंडिंग रंजक, फ्लोरोक्रोम, इमेजिंग जांच, और एजेड-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग ई. मस्तिष्क के ऊतकों में एजेड हिस्टोकेमिकलली का पता लगाने के लिए किया गया है। एजेड का पता लगाने के लिए इन यौगिकों का उपयोग महंगा है और समय लगता है. हालांकि, इसकी तीव्र फ्लोरोसेंट गतिविधि, उच्च-एफ़िनिटी, और एजेड के लिए विशिष्टता के कारण, साथ ही पारंपरिक एमिलॉयड बाइंडिंग रंगों के साथ संरचनात्मक समानताएं, करक्यूमिन (क्यूर) पोस्टमार्टम में लेबलिंग और इमेजिंग के लिए एक आशाजनक उम्मीदवार है मस्तिष्क ऊतक. यह जड़ी बूटी करक्यूमा लांगासे एक प्राकृतिक पॉलीफेनॉल है . वर्तमान अध्ययन में, क्यूर का उपयोग 5x पारिवारिक अल्जाइमर रोग (5xFAD) के आनुवंशिक माउस मॉडल (5xFAD) और एक मिनट के भीतर मानव विज्ञापन ऊतक से दोनों से हिस्टोकेमिकल लेबल एजेड प्लेक के लिए किया गया था। करर की लेबलिंग क्षमता पारंपरिक एमिलॉयड बाइंडिंग रंगों की तुलना में की गई थी, जैसे कि थिओफ्लेविन-एस (थियो-एस), कांगो लाल (सीआर), और फ्लोरो-जेड सी (एफजेसी), साथ ही एजेड-विशिष्ट एंटीबॉडी (6E10 और A11)। हमने देखा कि इन पारंपरिक रंगों की तुलना में जब क्यूर लेबल और छवि एजेड प्लेक का सबसे सस्ता और तेज तरीका है और एजेड-विशिष्ट एंटीबॉडी के बराबर है। इसके अलावा, क्यूर सबसे एजेड प्रजातियों के साथ बांधता है, जैसे कि ओलिगोमर और फाइब्रिल्स। इसलिए, क्यूर का उपयोग एजेड प्लेक के लिए सबसे अधिक लागत प्रभावी, सरल, और त्वरित फ्लोरोक्रोम डिटेक्शन एजेंट के रूप में किया जा सकता है।
Introduction
अल्जाइमर रोग (एडी) सबसे आम, उम्र से संबंधित, प्रगतिशील न्यूरोलॉजिकल विकारों में से एक है और दुनिया भर में मौत के प्रमुख कारणों में से एक1,2. सीखना, स्मृति, और अनुभूति हानि, neuropsychiatric विकारों के साथ, आम लक्षण ई3में प्रकट कर रहे हैं. यद्यपि ई. के ईटियोलॉजी को पूरी तरह से स्पष्ट नहीं किया गया है, उपलब्ध आनुवंशिक, जैव रासायनिक, और प्रयोगात्मक साक्ष्य इंगित करता है कि एजेड का क्रमिक जमाव ई.4के लिए एक निश्चित बायोमार्कर है। यह गलत गुना प्रोटीन इंट्रासेल्यूलर और एक्स्ट्रासेल्यूलर रिक्त स्थान में जमा होता है और माना जाता है कि यह synaptic हानि में शामिल किया गया है, तंत्रिका सूजन में वृद्धि हुई है, औरमस्तिष्कमें cortical और हिप्पोकैम्पस क्षेत्रों में neurodegeneration ई 5 से प्रभावित . इसलिए, ई. ऊतक में एजेड का हिस्टोकेमिकल पता लगाना ई- प्रगति को रोकने के लिए गैर-विषाक्त, एंटी-अमाइलॉयड दवाओं के विकास में एक महत्वपूर्ण पहला कदम है।
पिछले कुछ दशकों के दौरान, कई रंगों और एंटीबॉडी कई अनुसंधान प्रयोगशालाओं द्वारा इस्तेमाल किया गया है लेबल और मस्तिष्क के ऊतकों में छवि एजेड प्लेक, लेकिन इन तरीकों में से कुछ समय लगता है और रंगों या एंटीबॉडी का इस्तेमाल कर रहे हैं महंगा है, कई गौण की आवश्यकता होती है रसायन. इसलिए, ई. मस्तिष्क में एजेड प्लेक का पता लगाने के एक सस्ती साधन का विकास एक स्वागत योग्य नया उपकरण होगा। कई प्रयोगशालाओं Cur, एक होनहार विरोधी amyloid प्राकृतिक polyphenol का उपयोग शुरू कर दिया, लेबलिंग और इमेजिंग एजेड के लिए, साथ ही साथ ई.केलिए एक चिकित्सीय एजेंट 6,7,8,9. इसकी हाइड्रोफोबिकता और लिपोफिलिक प्रकृति, शास्त्रीय एमिलॉयड बाइंडिंग रंगों के साथ संरचनात्मक समानताएं, मजबूत फ्लोरोसेंट गतिविधि, साथ ही एजेड के साथ बांधने के लिए मजबूत संबंध यह लेबल और ई. ऊतक में एजेड प्लेक की इमेजिंग के लिए एक आदर्श फ्लोरोफोर बनाता है10 . कुर एजेड-प्लाक और ओलिगोमर के साथ बांधता है और इसकी उपस्थिति इंट्राकोशिकीय रिक्त स्थान7,11,12,13में भी पाई जाती है । इसके अलावा, यह दिखाया गया है कि कम से कम मात्रा (1 “10 nM) Cur के 5x पारिवारिक अल्जाइमर रोग (5xFAD) मस्तिष्क ऊतक7में एजेड प्लेक लेबल कर सकते हैं. हालांकि 1 एन एम एकाग्रता एजेड प्लेक की गिनती के लिए इष्टतम फ्लोरोसेंट तीव्रता प्रदान नहीं करता है, एक 10 एनएम या Cur की उच्च एकाग्रता करता है। Ran और उनके सहयोगियों14 ने बताया कि खुराक के रूप में कम के रूप में 0.2 nM difluoroboron-derivatized करी में पता लगा सकते हैं vivo एजेड जमा लगभग के रूप में अच्छी तरह से एक अवरक्त जांच के रूप में. क्या यह खुराक ऊतक में एजेड प्लेक को लेबल करने के लिए पर्याप्त है, अभी भी स्पष्ट नहीं है। सबसे पिछले अध्ययनों में 20 -30 मिनट का उपयोग कर के लिए एजेड प्लेक धुंधला करने के लिए इस्तेमाल किया है, लेकिन इष्टतम धुंधला बहुत कम समय की आवश्यकता हो सकती है.
वर्तमान अध्ययन के लिए कम से कम समय के लिए क्यूर द्वारा आवश्यक का परीक्षण करने के लिए ई. मस्तिष्क के ऊतकों में एजेड प्लेक लेबल और लेबल और मस्तिष्क के ऊतकों में एजेड प्लेक के इमेजिंग के लिए संवेदनशीलता की तुलना करने के लिए डिज़ाइन किया गया था 5xFAD चूहों से मस्तिष्क के ऊतकों में अन्य पारंपरिक के साथ धुंधला के बाद एजेड-बाइंडिंग रंग, जैसे थिओफ्लेविन-एस (थियो-एस), कांगो लाल (सीआर), और फ्लोरो-जेड सी (एफजेसी)। इन शास्त्रीय एमिलॉयड बाइंडिंग रंगों की एजेड लेबलिंग क्षमता की तुलना पैराफिन-एम्बेडेड और क्रायोस्टैट कोरोनल मस्तिष्क वर्गों में 5xFAD चूहों से और वृद्ध-मिलान मानव विज्ञापन और मस्तिष्क के ऊतकों को नियंत्रित करने से की गई थी। निष्कर्षों से पता चलता है कि क्यूर एजेड प्लेक को एजेड-विशिष्ट एंटीबॉडी (6E10) के समान तरीके से लेबल करता है और थियो-एस, सीआर, या एफजेसी की तुलना में मामूली रूप से बेहतर है। इसके अलावा, जब 5xFAD चूहों के इंट्रापेरिटोनल इंजेक्शन 2 डिग्री 5 दिनों के लिए प्रशासित किए गए थे, तो यह रक्त-मस्तिष्क बाधा को पार कर गया और एजेड प्लेक7के साथ बाध्य हुआ। दिलचस्प बात यह है कि क्यूर के नैनोमोलर सांद्रता का उपयोग 5xFAD मस्तिष्क ऊतक7,14में एजेड प्लेक को लेबल करने और छवि बनाने के लिए किया गया है। इसके अलावा, आकृतिकी रूप से अलग एजेड प्लेक, जैसे कोर, न्यूरिटिक, विसरा, और जले हुए प्लेक को अन्य पारंपरिक एमिलॉयड बाइंडिंगरंगोंमें से किसी की तुलना में अधिक कुशलता से करके लेबल किया जा सकता है। कुल मिलाकर, क्यूर को एक आसान और सस्ती तरीके से पशु मॉडल और/या मानव ई. ऊतक से पोस्टमार्टम मस्तिष्क के ऊतकों में लेबल और छवि एजेड प्लेक के लिए लागू किया जा सकता है, एजेड-विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए एक विश्वसनीय विकल्प के रूप में।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमारी परिकल्पना थी कि Cur तेज, आसान के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, और कम से कम महंगा तरीका लेबल और छवि एजेड प्लाक पोस्टमार्टम ई मस्तिष्क के ऊतकों में जब अन्य शास्त्रीय amyloid बाध्यकारी रंगों की तुलना में…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन के लिए समर्थन सेंट मेरी के आरोहण में फील्ड न्यूरोसाइंसेज संस्थान से आया है.
Materials
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | IHC world, Woodstock, MD | ||
| Aanimal model of Alzheimer's disease | Jackson's laboratory, Bar Harbor, ME | ||
| Absolute alcohol | VWR,Radnor, PA | ||
| Alexa 594 | Santacruz Biotech, Dallas, TX | ||
| Antibody 6E10 | Biolegend, San Diego, CA | ||
| Antibody A11 | Millipore, Burlington, MA | ||
| Compound light microscope | Olympus, Shinjuku, Japan | Olympus BX51 | |
| Congo red | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Cryostat | GMI, Ramsey, MN | LeicaCM1800 | |
| Curcumin | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Disodium hydrogen phosphate | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Dystyrene plasticizer xylene | BDH, Dawsonville, GA | ||
| Filter papers | Fisher scientific, Pittsburgh, PA | ||
| Hoechst-33342 | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Inverted fluorescent microscope | Leica, Buffalo Grove, IL | Leica DMI 6000B | |
| Inverted fluorescent microscope | Olympus, Shinjuku, Japan | Olympus 1×70 | |
| Normal goat serum | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Paraffin | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Paraformaldehyde | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Ploy-lysine coated charged glass slide | Globe Scientific Inc, Mahwah, NJ | ||
| Potassium chloride | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium azide | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium chloride | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium hydroxide | EMD Millipore, Burlington, MA | ||
| Sodium pentobarbital | Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI | ||
| Thioflavin-S | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Triton-X-100 | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Xylene | VWR,Radnor, PA |
References
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