Summary
La curcumina es un fluoróforo ideal para el etiquetado y la toma de imágenes de placas de proteína beta amiloide en el tejido cerebral debido a su unión preferencial a la proteína beta amiloide, así como sus similitudes estructurales con otros colorantes de unión amiloide tradicionales. Se puede utilizar para etiquetar e imágenes de placas de proteína beta amiloide de manera más eficiente y económica que los métodos tradicionales.
Abstract
La deposición de la proteína beta amiloide (A) en espacios extra e intracelulares es una de las patologías distintivas de la enfermedad de Alzheimer. Por lo tanto, la detección de la presencia de A en el tejido cerebral AD es una herramienta valiosa para el desarrollo de nuevos tratamientos para prevenir la progresión de la AD. Se han utilizado varios colorantes clásicos de unión amiloide, fluorocromo, sondas de imagen y anticuerpos específicos de A- para detectar histoquímicamente A en el tejido cerebral AD. El uso de estos compuestos para la detección de A es costoso y consume mucho tiempo. Sin embargo, debido a su intensa actividad fluorescente, alta afinidad y especificidad para A, así como similitudes estructurales con los colorantes tradicionales de unión amiloide, la curcumina (Cur) es un candidato prometedor para el etiquetado y la toma de imágenes de placas de A en postmortem tejido cerebral. Es un polifenol natural de la hierba Curcuma longa. En el presente estudio, Cur se utilizó para etiquetar histoquímicamente placas A- tanto de un modelo genético de ratón de la enfermedad de Alzheimer 5x familial (5xFAD) como del tejido AD humano en un minuto. La capacidad de etiquetado de Cur se comparó con los colorantes de unión amiloide convencionales, como el tioflavina-S (Thio-S), el rojo del Congo (CR) y el Fluoro-jade C (FJC), así como con los anticuerpos específicos de A- (6E10 y A11). Observamos que Cur es la forma más económica y rápida de etiquetar e imágenes de placas A- en comparación con estos colorantes convencionales y es comparable a los anticuerpos específicos de A. Además, Cur se une a la mayoría de las especies de A, como los oligómeros y las fibrillas. Por lo tanto, Cur podría ser utilizado como el agente de detección de fluorocromo más rentable, simple y rápido para placas A.
Introduction
La enfermedad de Alzheimer es uno de los trastornos neurológicos progresivos más comunes, relacionados con la edad y una de las principales causas de muerte en todo el mundo1,2. El aprendizaje, la memoria y el deterioro de la cognición, junto con los trastornos neuropsiquiátricos, son los síntomas comunes manifestados en ad3. Aunque la etiología de la AD no ha sido completamente aclarada, la evidencia genética, bioquímica y experimental disponible indica que la deposición gradual de A es un biomarcador definitivo para AD4. Esta proteína minimizada se acumula en espacios intracelulares y extracelulares y se cree que está implicada en la pérdida sináptica, aumento de la neuroinflamación y neurodegeneración en las regiones corticales y del hipocampo en el cerebro afectado por el centro de la enfermedad5. Por lo tanto, la detección histoquímica de A en el tejido AD es un primer paso crucial en el desarrollo de fármacos antiamiloides no tóxicos para prevenir la progresión de la AD.
Durante las últimas décadas, varios colorantes y anticuerpos han sido utilizados por muchos laboratorios de investigación para etiquetar e imágenes de placas A en el tejido cerebral, pero algunos de estos métodos consumen mucho tiempo y los colorantes o anticuerpos utilizados son caros, lo que requiere varios accesorios Productos químicos. Por lo tanto, el desarrollo de un medio barato de detección de placas A en el cerebro AD sería una nueva herramienta bienvenida. Muchos laboratorios comenzaron a utilizar Cur, un prometedor polifenol natural antiamiloide, para el etiquetado y la imagen A, así como un agente terapéutico para AD6,7,8,9. Su hidrofobicidad y naturaleza lipolólica, similitudes estructurales con colorantes clásicos de unión amiloide, fuerte actividad fluorescente, así como una fuerte afinidad para unirse con A, lo convierten en un fluoróforo ideal para el etiquetado y la toma de imágenes de placas A- en el tejido AD10 . Cur se une a las placas y oligómeros A- y su presencia también se detecta en los espacios intracelulares7,11,12,13. Además, se ha demostrado que cantidades mínimas (1-10 nM) de Cur pueden etiquetar placas a a en 5 x tejido cerebral de la enfermedad de Alzheimer familiar (5xFAD)7. Aunque la concentración de 1 nM no proporciona la intensidad de fluorescencia óptima para el recuento de placas de A, una concentración de 10 nM o superior de Cur sí lo hace. Ran y sus colegas14 informaron que dosis tan bajas como 0,2 nM de Cur difluoroboron-derivatizado pueden detectar depósitos in vivo A, casi así como una sonda infrarroja. Aún no está claro si esta dosis es suficiente para etiquetar las placas a a- en el tejido. La mayoría de los estudios previos han utilizado de 20 a 30 minutos para manchar placas de A con Cur, pero la tinción óptima puede requerir mucho menos tiempo.
El presente estudio fue diseñado para probar el tiempo mínimo requerido por Cur para etiquetar las placas a-a en el tejido cerebral AD y para comparar la sensibilidad para el etiquetado y la toma de imágenes de placas A en el tejido cerebral de los ratones 5xFAD después de manchar con Cur con otros Colorantes de unión A, como Thioflavin-S (Thio-S), rojo congoso (CR) y Fluoro-jade C (FJC). La capacidad de etiquetado A de estos colorantes clásicos de unión amiloide se comparó con la tinción de Cur en secciones cerebrales coronales incrustadas en parafina y criostatos de ratones 5xFAD y de AD humano emparejados con edad y tejido cerebral de control. Los hallazgos sugieren que Cur etiqueta las placas A- de una manera similar a los anticuerpos específicos de A - (6E10) y moderadamente mejor que Thio-S, CR, o FJC. Además, cuando se administraron inyecciones intraperitoneales de ratones Cur a 5xFAD durante 2 a 5 días, cruzó la barrera hematoencefálica y se une con placasA- 7. Curiosamente, las concentraciones nanomolares de Cur se han utilizado para etiquetar e imágenes de placas A en el tejido cerebral 5xFAD7,14. Por otra parte, las placas morfológicamente distintas de A, como las placas de núcleo, néríticas, difusas y quemadas pueden ser etiquetadas por Cur de manera más eficiente que con cualquiera de los otros colorantes de unión amiloide convencionales7. En general, Cur se puede aplicar a las placas de la etiqueta y de la imagen a-A en el tejido cerebral postmortem de los modelos animales AD y/o tejido AD humano de una manera fácil y barata, como una alternativa confiable a los anticuerpos específicos de A.
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Protocol
Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales (ACUC) de la Universidad Estatal del Valle de Saginaw. El tejido humano se obtuvo de un banco cerebral establecido en el Instituto Banner Sun Health en Arizona15,16.
1. Perfusión de los animales
- Prepare los búferes fijador y de perfusión.
- Preparar un tampón de fosfato sódico de 0,1 M añadiendo 80 g de cloruro sódico (NaCl), 2 g de cloruro de potasio (KCl), 21,7 g de fosfato de hidrógeno disódico (Na2HPO4x 7H2O), 2,59 g de fosfato de dihidrógeno potásico (KH2PO4 ), y agua destilada doble para hacer un total de 1 L.
- Preparar un 4% de paraformaldehida (PFA).
- Añadir 40 g de paraformaldehyde a 1 L de PBS (0,1 M, pH 7,4).
- Calentar la solución de PFA a 60 o65 oC y mezclar con un agitador magnético.
NOTA: La temperatura no debe exceder los 65 oC. - Agregue unas gotas de NaOH (1 N) con un cuentagotas para disolver el PFA por completo.
- Filtrar la solución pfA con papel de filtro medio a fino y almacenar a 4 oC.
NOTA: La solución es buena durante un mes.
- Realizar anestesia animal y perfusión.
NOTA: Los ratones de control de 1136799Vas/J (5-FAD) de edad b6SJL-Tg APP SwFlLon, PSEN1*M146L*L286V, 1136799Vas/J (5-FAD) (n 6 por grupo) fueron comprados a los vendedores y criados en la casa de animales de la Universidad Estatal del Valle de Saginaw. El genotipado fue confirmado por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) como se describió anteriormente7. El tejido cerebral de AD humano incluye el tejido cerebral postmortem AD y el tejido de control emparejado por la edad.- Anestetizar al animal con un agente anestésico adecuado, como pentobarbital sódico (390 mg/kg de peso corporal), o una mezcla de ketamina/xilazina (hasta 80 mg/kg de ketamina de peso corporal y 10 mg/kg de xilazina de peso corporal) por inyección intraperitoneal (27 G aguja y 1 mL). Compruebe el nivel de anestesia pellizcando un dedo del dedo del día. Si el animal no responde, entonces está listo para la cirugía de perfusión.
- Coloque el animal anestesiado en la posición supina en la bandeja de cirugía de perfusión y utilizando pequeñas tijeras de iris hacer una incisión en el extremo posterior del ventrículo izquierdo.
- Inserte una aguja de perfusión de 22 G en el ventrículo izquierdo y haga una pequeña incisión en la aurícula derecha para eliminar el líquido de perfusión del cuerpo. Utilice un sistema de perfusión alimentado por gravedad para permitir que el fluido de perfusión helada (0,1 M PBS, pH 7,4) fluya durante 5 x 6 min (velocidad de flujo 20 a 25 ml/min).
NOTA: Un hígado claro es el indicador de perfusión óptima. - Cambie la válvula tampón a una solución de paraformaldehído de 4% helada para su fijación y permita que fluya durante 8 x 10 minutos.
NOTA: El temblor seguido de las extremidades endurecidas o rígidas son indicadores de una buena fijación. - Retire el cerebro del cráneo usando tijeras. Usando una espátula, recoger el cerebro y colocarlo en un vial de 4% PFA (al menos 10 veces el volumen del volumen cerebral) y almacenar a 4 oC hasta su uso posterior.
2. Procesamiento de tejidos
- Corte las secciones de criostato.
- Transferir el cerebro a soluciones de sacarosa calificadas (10%, 20% y 30%) y almacenar a 4oC durante 24 h cada uno, hasta su uso.
- Usando un criostato a -22 oC, corte secciones de 40 m de espesor. Recoger de 10 a 20 secciones por pozo en un plato de 6 pocillos lleno de PBS y azida sódica (0,02%).
- La parafina incorpora las secciones para el ratón y el tejido cerebral humano.
- Para las secciones de parafina, deshidratar el tejido cerebral perfundido y 24 h post-fijo con alcoholes clasificados (50%, 70%, 90%) durante 2 h cada uno, seguido sin 100% de alcohol 2x para 1 h cada uno), y luego con xileno 2x para 1 h cada uno) a temperatura ambiente.
- Penetra rinillos-parafina (1:1) 2x durante 1 h a 56oC en un matraz cónico de vidrio cubierto con papel de aluminio.
- Sumerja el tejido en parafina derretida (56 oC) durante 4 x 6 h.
- Cortar secciones de 5 m de espesor utilizando un microtomo rotatorio a temperatura ambiente y colocarlos en un baño de agua tisular a 45 oC.
- Histoquímicamente etiquetar las placas A - en las secciones de criostato con Cur.
- Enjuague las secciones del paso 2.1.2 con PBS (pH 7.4) 3x durante 5 min cada una.
- Sumerja las secciones en etanol al 70% durante 2 min a temperatura ambiente.
- Disolver el stock de Cur (1 mM) en metanol y diluir con 70% de etanol para obtener una concentración de trabajo final de 10 m.
- Sumerja las secciones con la solución Cur de trabajo durante 1 x 5 minutos a temperatura ambiente en una coctelera a 150 rpm.
- Deseche la solución de Cur y lave con 70% de etanol 3x durante 2 min cada uno.
- Coloque las secciones en portaobjetos de vidrio recubiertos de poli-L-lisina y monte con un cubreobjetos utilizando medios de montaje orgánicos, como xileno plastificante de distyrene (DPX).
- Vista bajo un microscopio de fluorescencia utilizando filtros de excitación/emisión de 480/550 nm.
- Histoquímicamente etiquetar las placas A - en el ratón incrustado en parafina y secciones del cerebro humano con Cur.
- Deparaffinizar las secciones de tejido del paso 2.2.4 con xileno 2x durante 5 min cada una a temperatura ambiente.
- Rehidratar con soluciones de alcohol graduadas (100%, 80%, 70%, 50% para 1 min cada una) y con agua destilada 2x durante 5 min cada una a temperatura ambiente.
- Secciones de manchas con Cur (10 m) durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad, agitando a 150 rpm. Lavar con 70%, 90% y 100% de alcohol durante 2 min cada uno.
- Claro con xileno 2x durante 5 min cada uno y tapa con DPX.
- Visualice bajo un microscopio de fluorescencia como se menciona en el paso 2.3.7.
- Colocalizar Cur con el anticuerpo A- en placas y oligómeros De A.
- Lave las secciones de criostato del paso 2.1.2 con PBS 3x en una placa de 12 pocillos.
- Bloquear las secciones con 10% de suero normal de cabra (NGS) disuelto en PBS con 0.5% Triton-X-100 a temperatura ambiente durante 1 h.
- Deseche la solución de bloqueo. Incubar las secciones con anticuerpos específicos de A ( 6E10 o A11, diluido 1:200) disueltos en solución de bloqueo fresca que contenga 10% NGS y 0,5% Tritón-X100 durante la noche a 4oC en una coctelera a 150 rpm.
- Deseche la solución de anticuerpos y lave las secciones con PBS 3x durante 10 min cada una.
- Incubar con la etiqueta de anticuerpo secundario con fluoróforo rojo (por ejemplo, Alexa 594) durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Lavar con PBS 3x durante 10 min cada uno.
- Lavar con 70% de alcohol 1x.
- Incubar las secciones con Cur (10 m) durante 5 min a temperatura ambiente.
- Lavar con 70% de alcohol 3 veces durante 1 min cada uno.
- Deshidratar con 90% y 100% de alcohol durante 1 min cada uno, limpiar con xileno 2x durante 5 min cada uno, y montar en diapositivas usando DPX.
- Visualice utilizando un microscopio de fluorescencia con filtros de excitación/emisión apropiados para las señales rojas y verdes.
- Para la colocalización intracelular a, manchar las secciones con a-anticuerpos (6E10), reainar con Cur a temperatura ambiente en la oscuridad con temblor a 150 rpm, y contramancha con Hoechst-33342 (1 mg/ml) y/o DAPI (1ug/ml) durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad con temblores a 150 rpm. Lavar con PBS 3x.
- Tome imágenes con los filtros rojo, verde y azul con un objetivo de 100x (ampliación total 1.000x).
- Etiquete las placas A con Tio-S, CR y FJC.
NOTA: Los protocolos detallados para el etiquetado Thio-S y CR se notificaron previamente7.- Para la tinción de FJC, lave las secciones flotantes obtenidas del paso 2.1.2 con PBS 3x durante 5 min cada una.
- Coloque las secciones en una placa de 12 pocillos y manchar las manchas con FJC (0,001%) durante 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.
- Deseche la solución de FJC y lave con PBS 3x durante 5 min cada uno.
- Incubar con cloruro de amonio (NH4Cl, 50 mM disuelto en PBS) durante 10 min a temperatura ambiente.
- Deseche la solución NH4Cl y lave con PBS 3x durante 5 min cada uno.
- Siguiendo los pasos de la sección 2.4, deshidratar con soluciones de alcohol graduadas, limpiar, montar y ver bajo un microscopio de fluorescencia utilizando filtros de excitación/emisión de 450/520 nm.
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Representative Results
Etiquetas de curcumina placas A- en un minuto. Cuando teñimos el tejido 5xFAD con Cur, encontramos que las placas de la etiqueta Cur A en 1 min. Aunque el aumento del tiempo de incubación con Cur aumentó ligeramente la intensidad de fluorescencia de las placas de A, el número de placas observadas de A, no fue significativamente diferente entre 1 min y 5 min de tiempo de tinción(Figura 1).
Cur puede etiquetar placas de A en el ratón preparado por criostato, incrustado en parafina y tejido AD humano que coloca con anticuerpos específicos de A en el tejido cerebral AD del ratón. Cuando teñimos criosección, secciones incrustadas en parafina(Figura 2A)y tejido AD humano(Figura 2B),observamos placas A-etiquetadas con Cur en todo tipo de secciones de tejido. Además, para confirmar que La cur se une a las placas de A, primero etiquetamos las placas con 6E10, seguida de la tinción de Cur. Observamos que el Cur estaba completamente colocalizado con A- en las mismas placas que unieron el 6E10(Figura 2C).
San etiquetado sormeros y agregados intracelulares de A. Para comprobar si Cur podía etiquetar los oligómeros A, las secciones del ratón 5xFAD se teñían con un anticuerpo específico de oligomer (A11), seguido de la tinción de Cur. Observamos que Cur colocaliquea con A11 en placas A (Figura 3A). Del mismo modo, Cur también colocalidía con el anticuerpo 6E10 en espacios intracelulares(Figura 3B),lo que indica que puede etiquetar el A intracelular.
Cur etiquetado A- más prominente que los colorantes clásicos de unión amiloide. El etiquetado de Cur se comparó con los colorantes de unión amiloide disponibles en el uso comercial Thio-S, CR, FJC. El anticuerpo 6E10 específico de A- se utilizó como control estándar. Observamos que Cur etiquetó a A- de manera más prominente que los colorantes de unión amiloide convencionales(Figura 4).
Cur derivados bis-demethoxycurcumin (BDMC) y demethoxycurcumin (DMC), también presente en el extracto de cúrcuma, etiqueta placas a- comparativamente a Cur en el tejido cerebral 5xFAD. Otros dos componentes principales, como BDMC y DMC, están presentes en el extracto de cúrcuma. Hemos probado si estos dos compuestos también etiquetan placas de A- similares a Cur. Cuando se teñían las secciones cerebrales del ratón 5xFAD con estos derivados, tanto BDMC como DMC también etiquetaron placas A, paralelas a Cur (Figura 5A). Se investigaron diferentes medios de montaje para comprobar si hay interferencias con la imagen de A después de la tinción con Cur. La señal fluorescente estaba intacta tanto en medios de montaje acuosos como orgánicos, como DPX(Figura 5B). La tinción de las placas de A con Cur fue apropiada después del etiquetado inmunofluorescente y seguida de contramanchación con solución Hoechst 33342 (1 mg/ml) o 4o,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, 1 g/ml). Las señales inmunofluorescentes y la intensidad de contramancha se mantuvieron después de la tinción de Cur(Figura 5C).
Figura 1: Etiquetas de curcumina Placas A- en un minuto. (A). Las secciones cerebrales de ratones 5xFAD o el control humano y el tejido cortical AD se teñieron con Cur (10 m) durante 1 a 5 min y se contó el número de placas visibles. (B). No se observó ninguna diferencia en el número de recuentos de placas A- entre los tiempos de tinción de 1 min y 5 minutos. Los datos se representan como media - error estándar de media (SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Colocación de La cur con el anticuerpo A- en las placas de A. Cur puede etiquetar placas A- en secciones preparadas por criostato, incrustadas en parafina (A) y tejido AD humano (B). El etiquetado A- esparalelo al etiquetado con el anticuerpo específico de A- (6E10, tinción DAB). (C). Las secciones 5xFAD fueron etiquetadas por primera vez con el anticuerpo A- (6E10), seguido de la tinción con Cur. Rojo 6E10 unido por un anticuerpo secundario etiquetado con Alexa fluorophore 594. Verde - Cur. Cur completamente colocalizado con A en las mismas placas que se unen a 6E10. Las flechas indican las placas de A. La barra de escala indica 50 m (aumento total de 400x) en las tres imágenes de la izquierda, y 10 m (ampliación total a 400x). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Etiquetas de la curcumina A- oligomers y intracelulares. (A) Se detectó inmunohistoquímicamente con un anticuerpo específico de A-A (A11), seguido de la tinción con Cur. Cur colocalizada completamente con A, en el mismo oligomero donde A11 se une. Barra de escala a 250 m y aumento total de 100x. (B) Del mismo modo, se detectó inmunohistoquímicamente a A( intrahistoquímicamente utilizando un anticuerpo específico de A- (6E10), seguido de la tinción con Cur. Tenga en cuenta que Cur colocalizada completamente con A en las mismas áreas enlazadas a 6E10. Barra de escala a 50 m y aumento total a 1.000x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Comparación de diferentes colorantes de unión amiloide con Cur para etiquetar las placas A. Las secciones de criostato (40 m) de la corteza de ratones 5xFAD de 12 meses de edad se teñieron con Cur, Thioflavin-S, Rojo Congo, Fluoro-jade C, y con anticuerpos 6E10. Cur calificó las placas de A- de manera más prominente que Thio-S, CR y FJC. Las flechas indican las placas de A. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Cur-derivatives bis-demethoxy curcumin y demethoxy curcumin también etiqueta A - similar a Cur. (A) Tanto las secciones de criostato y 5xFAD incrustadas en parafina se teñiron con cur-derivatives bis-demethoxy curcumina y demethoxy curcumina. Ambos derivados etiquetan las placas a a- de una manera similar a Cur. (B) Tanto los medios de montaje acuosos como los orgánicos (DPX) se utilizaron para montar secciones de tejido después de etiquetar las placas A con Cur. (C) Se utilizaron secciones inmunoetiquetadas para el etiquetado A con Cur. Las flechas blancas indican placas de A, la flecha verde indica astrocito activado (GFAP) y la flecha amarilla indica mancha nuclear (DAPI). Barras de escala a 100 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Funciones | Anticuerpo a- | Curcumina | Thio-S | Rojo Congo | Fluoro-Jade C |
| Duración de la tinción | 24-48 h | 1-5 min | 10 min | 60 min | 30 min |
| Productos químicos accesorios | Anticuerpos secundarios, varios productos químicos para hacer tampón, suero normal de cabra | Metanol | Etanol | NaOH y etanol | NaOH y etanol, permanganato de potasio |
| Costo | Costoso: un vial de anticuerpos específico de A- requiere $200-300 | Coste efectivo: 5-10/1 g de Cur y se puede aplicar para muchos tejidos | Coste efectivo: 5/1 g de $, se puede aplicar para pocos tejidos | Coste efectivo: >$5/1 g Congo rojo, y se puede aplicar para varios tejidos | Costoso: 15.500/1 g de FJC en polvo |
| Especificidad | Se requieren diferentes anticuerpos para los oligómeros y fibrillas de A | La curcumina se une a los oligómeros y fibrillas de A | Puede unir sólo fibrilas, no monómeros u oligómeros | Sólo puede unirse con Protofibrillas y fibrillas16,17 | Sólo puede unirse con las fibrillas y las neuronas degeneradas |
| Estabilidad | Dependiendo del tinte unido al anticuerpo secundario | Muy estable, incluso a temperatura ambiente cuando se une con A | Estable en metanol | Estable en etanol | No estable |
| Cuidado después de la tinción | Necesita cuidado sano adicional después de la tinción, como mantenerse en la oscuridad y congelarse todo el tiempo | No tan sensible a la luz y más estable a temperatura ambiente | Sensible a la luz | No sensible a la luz | Sensible a la luz |
| Se requiere microscopio | Luz compuesta o fluorescente (dependiendo del uso de anticuerpos secundarios) | Fluorescente | Fluorescente | Microscopio de luz o microscopio polarizado o filtro polarizado | Fluorescente |
| Tinción de fondo | Generalmente, no hay antecedentes | Fondo muy bajo | Fondo alto debido a la unión con la membrana lipídica o compuestos lipídis en la célula | Fondo bajo | Fondo alto |
| In vivo A- imaging | Puede que no sea aplicable | Muy aplicable | Puede que no sea aplicable | Puede que no sea aplicable | Puede que no sea aplicable |
Tabla 1: Comparación del etiquetado A con diferentes colorantes de unión amiloide y Cur7.
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Discussion
Nuestra hipótesis era que Cur podría ser utilizado como la forma más rápida, más fácil y menos costosa de etiquetar e imágenes de placas A en el tejido cerebral postmortem AD en comparación con otros colorantes clásicos de unión amiloide, así como anticuerpos específicos de A. Los objetivos de este estudio fueron determinar el tiempo mínimo necesario para etiquetar e imágenes de placas A- por Cur en el tejido cerebral postmortem AD y determinar si Cur puede ser utilizado como una alternativa al anticuerpo A- para etiquetar placas A. Con este fin, se observó la capacidad de etiquetado de Cur en diferentes momentos. Cur fue capaz de etiquetar a A en un minuto. Además, el etiquetado de A- por Cur fue mayor que otros colorantes de unión amiloide convencionales, como Thio-S (0,1%), CR (1%) y FJC (0,001%).
Cur se considera un fluoróforo único e ideal para el etiquetado A, ya que tiene la mayoría de las características que posee la mayoría de los colorantes de unión amiloide convencionales, incluidas las propiedades estructurales, físicas, químicas y biológicas10. Además, debido a la asequibilidad, la mayoría de los investigadores están interesados en el uso de este polifenol natural. Para mostrar la especificidad de la unión de Cur a las placas y oligómeros de A, utilizamos 6E10 y A11 (anticuerpo específico de A-oligomer). Cur mostró una colocalización casi completa con todas las diferentes especies de A- presentes en el tejido, lo que sugiere que Cur es muy específico de A7,17,18,19,20. Además, Cur etiquetó los oligomeros A (Figura 3A) y los agregados intracelulares(Figura 3B)y colocalizado con anticuerpos A -(Figura 2B), lo que sugiere que Cur puede etiquetar no sólo placas extracelulares de A, pero también de A, depositadas en espacios intracelulares7.
Durante las últimas décadas, se han desarrollado varios fluoróforos y anticuerpos para etiquetar e imágenes de placas A - histoquímicamente. Sin duda, la mayoría de ellos son muy específicos de las especies de A- dirigidas y para detectar las placas de A, pero estas son mucho más caras y su uso consume más tiempo que el uso de Cur. Por ejemplo, comparamos la unión de placa S por Cur, con otros colorantes de unión amiloide, como Thio-S, CR y FJC, donde se utilizó como control de referencia el anticuerpo específico de A- (6E10). Estos resultados sugieren que las etiquetas de Cur A- se etiquetan con más fuerza que cualquiera de los otros fluoróforos. Lo que es más importante, en relación con Cur, algunos de los fluoróforos más utilizados tienen desventajas distintas en términos de etiquetado e imagen A. Por ejemplo, Thio-S puede producir un fondo alto y distraído porque se une con membranas lipídicas o compuestos lipídicos en la celda21. Del mismo modo, el CR, que se utiliza comúnmente para etiquetar a A, produce birefringencia verde manzana(Figura 4)bajo un microscopio polarizado. CR no etiqueta las placas A-placas tan fácilmente como lo hacen Cur o Thio-S, etiquetando significativamente menos placas A - que las detectadas por Cur7,22,23. Gutierrez et al. informaron que la FJC, que puede unirse con A y con neuronas degeneradas, etiqueta a una frecuencia menor que Cur o Thio-S24. Estos resultados sugieren que estos marcadores clásicos de uso común tienen menos afinidad para unirse a las placas de A- que Cur.
Además, el etiquetado de diferentes tipos de placas A (núcleo, nérítico, difuso, quemado) puede optimizarse con Cur, en lugar de otros fluoróforos de unión amiloide, porque Cur puede ayudar a visualizar y distinguir morfológicamente diferentes placas de A, mientras que otras técnicas no distinguen estos subtipos morfológicos7. Del mismo modo, el uso de anticuerpos específicos de A, que son muy específicos de las diferentes especies de A, es muy costoso y consume mucho tiempo, tomando al menos 24-48h a través de la inmunohistoquímica. Por otra parte, la detección de diferentes especies de A - requiere diferentes anticuerpos, así como varios productos químicos accesorios, lo que aumenta significativamente el costo total. Claramente, Cur es menos costoso, más fácilmente disponible, y produce una mayor intensidad de fluorescencia cuando se une a las placas de A. Aunque la CR es también una técnica relativamente rentable para el etiquetado y la toma de imágenes de las placas A, Cur puede unir y etiquetar más de la especie A, como los oligomeros25 (Figura 3 y Figura 4),mientras que la CR sólo se une a los protofibrillas y fibrillas23. Por lo tanto, el etiquetado de A con Cur puede lograrse de manera más eficiente y rentable que por Thio-S, CR o FJC (Tabla 1).
En resumen, Cur puede detectar las placas y los oligómeros de AD de manera efectiva, rápida y económica. Además, la unión de Cur a A es muy específica y su actividad fluorescente es muy estable. Requiere cantidades mínimas (1-10 nM) para etiquetar A. Por otra parte, Cur también es muy específico para diferentes especies de A, tales como fibrillas o placas, así como oligómeros7. Del mismo modo, Derivados de Cur demethoxycurcumin y bisdemethoxycurcumin también albergan propiedades de unión amiloide y c etiqueta A - de forma similar a Cur10 (Figura 5A). Por lo tanto, Cur es un fluoróforo ideal para el etiquetado y la toma de imágenes de placas A en el tejido cerebral postmortem. Se puede utilizar como una alternativa rápida y fácil para detectar la carga de placa a A - después de la terapia anti-amiloide en modelos animales experimentales de AD. Nuestros hallazgos confirman los informes de la alta afinidad de Cur con A, reforzando su uso potencial para monitorear las placas de A- en el cerebro postmortem y en el tejido vivo.
Para un etiquetado óptimo de Cur se recomienda no etiquetar A con Cur en tejido sin perfundir y evitar el almacenamiento de tejido a largo plazo, ya que puede producir una mayor cantidad de fondo, incluso cuando se perfunde. Para el coetiquetado, se recomienda completar la inmunohistoquímica primero con el anticuerpo específico que se utiliza antes de manchar con Cur y luego seguir esto con contramanchas usando DAPI o Hoechst.
Las posibles modificaciones a este método incluyen aumentar el tiempo de incubación de Cur con el tejido durante un máximo de 30 minutos, lo que no interferirá con la intensidad de la señal, aunque puede aumentar el fondo durante la toma de imágenes. La disminución de la concentración de Cur a menos de 10 m no interfiere en el etiquetado de A a un nivel significativo. Para reducir el fondo para el tejido cerebral humano, se podría aplicar un método de preparación alternativo. Por ejemplo, las secciones cerebrales podrían tratarse inicialmente con 0,3% (p/v) Sudán Negro B en 70% etanol (v/v) durante 10 min a temperatura ambiente. A continuación, la sección podría ser teñida con Cur durante 10 minutos a temperatura ambiente, y bañada con PBS 3x durante 15 minutos, contrarretida, y montada con medios antifadea13. Los espesores de la sección de criostato también podrían reducirse a 20 x 25 m.
Las posibles advertencias a este método incluyen la unión de la cur con A- presente en los vasos sanguíneos, que es diferente de las placas extracelulares de A. Por lo tanto, el investigador debe ser consciente de la morfología de las placas y oligómeros de A- en los vasos sanguíneos. El investigador debe estar al tanto de las señales autofluorescentes. El exceso de fondo verde se puede ver ocasionalmente después de la tinción de Cur, pero esto se puede reducir disminuyendo el tiempo de tinción o disminuyendo la concentración de Cur. Por último, la señal de coetiquetado con otros marcadores puede reducirse debido a tratamientos repetidos con el agente de compensación (por ejemplo, xileno).
Las limitaciones importantes incluyen la incapacidad de coetiquetar con cualquier proteína marcadora utilizando anticuerpos secundarios etiquetados con tinte fluorescente verde, como isotiocianato fluorescente (FITC). Estos no se pueden utilizar debido a la excitación/emisión similar de Cur. Además, en las primeras etapas de la AD, cur sólo puede etiquetar cantidades limitadas de A. Por último, hay una necesidad de hacer el trabajo en ambientes oscuros como cualquier tinte fluorescente.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El apoyo a este estudio vino del Instituto de Neurociencias de Campo en ascensión de Santa María.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | IHC world, Woodstock, MD | ||
| Aanimal model of Alzheimer's disease | Jackson's laboratory, Bar Harbor, ME | ||
| Absolute alcohol | VWR,Radnor, PA | ||
| Alexa 594 | Santacruz Biotech, Dallas, TX | ||
| Antibody 6E10 | Biolegend, San Diego, CA | ||
| Antibody A11 | Millipore, Burlington, MA | ||
| Compound light microscope | Olympus, Shinjuku, Japan | Olympus BX51 | |
| Congo red | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Cryostat | GMI, Ramsey, MN | LeicaCM1800 | |
| Curcumin | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Disodium hydrogen phosphate | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Dystyrene plasticizer xylene | BDH, Dawsonville, GA | ||
| Filter papers | Fisher scientific, Pittsburgh, PA | ||
| Hoechst-33342 | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Inverted fluorescent microscope | Leica, Buffalo Grove, IL | Leica DMI 6000B | |
| Inverted fluorescent microscope | Olympus, Shinjuku, Japan | Olympus 1x70 | |
| Normal goat serum | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Paraffin | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Paraformaldehyde | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Ploy-lysine coated charged glass slide | Globe Scientific Inc, Mahwah, NJ | ||
| Potassium chloride | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium azide | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium chloride | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium hydroxide | EMD Millipore, Burlington, MA | ||
| Sodium pentobarbital | Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI | ||
| Thioflavin-S | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Triton-X-100 | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Xylene | VWR,Radnor, PA |
References
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