Summary
Curcumine is een ideale de voor het labelen en beeldvorming van amyloïde beta eiwit plaques in hersenweefsel als gevolg van de preferentiële binding aan amyloïde beta-eiwit, alsmede de structurele gelijkenissen met andere traditionele amyloïde bindende kleurstoffen. Het kan worden gebruikt om te labelen en beeld amyloïde beta eiwit plaques efficiënter en goedkoop dan traditionele methoden.
Abstract
De afzetting van amyloïde bèta-eiwitten (Aβ) in extra-en intracellulaire ruimten is een van de kenmerkende pathologieën van de ziekte van Alzheimer (AD). Daarom is detectie van de aanwezigheid van Aβ in AD hersenweefsel een waardevol hulpmiddel voor het ontwikkelen van nieuwe behandelingen om de progressie van AD te voorkomen. Er zijn verschillende klassieke amyloïde bindende kleurstoffen, fluorochrome, Imaging sondes en Aβ-specifieke antilichamen gebruikt om Aβ histochemisch op te sporen in AD hersenweefsel. Gebruik van deze verbindingen voor Aβ-detectie is kostbaar en tijdrovend. Vanwege zijn intense fluorescentie activiteit, hoge affiniteit en specificiteit voor Aβ, evenals structurele gelijkenissen met traditionele amyloïde bindende kleurstoffen, is curcumine (CUR) een veelbelovende kandidaat voor het labelen en beeldvorming van Aβ-plaques bij postmortem hersenweefsel. Het is een natuurlijke polyfenol van het kruid Curcuma longa. In de huidige studie, cur werd gebruikt om histochemisch label Aβ plaques van zowel een genetische muismodel van 5x familiaire ziekte van Alzheimer (5xFAD) en van menselijke AD weefsel binnen een minuut. Het etiketterings vermogen van cur werd vergeleken met conventionele amyloïde bindende kleurstoffen, zoals thioflavine-S (thio-S), Congo rood (CR) en fluoro-Jade C (FJC), evenals Aβ-specifieke antilichamen (6E10 en A11). We hebben geconstateerd dat cur de meest goedkope en snelste manier is om Aβ-plaques te labelen en te afbeeldenten in vergelijking met deze conventionele kleurstoffen en is vergelijkbaar met Aβ-specifieke antilichamen. Daarnaast bindt cur met de meeste Aβ-soorten, zoals oligomeren en fibrils. Daarom kan cur worden gebruikt als de meest kosteneffectieve, eenvoudige en snelle fluorochrome detectie-agent voor Aβ-plaques.
Introduction
De ziekte van Alzheimer (AD) is een van de meest voorkomende, leeftijdsgebonden, progressieve neurologische aandoeningen en een van de belangrijkste doodsoorzaken wereldwijd1,2. Leren, geheugen en cognitie stoornissen, samen met neuropsychiatrische stoornissen, zijn de veelvoorkomende symptomen die zich manifesteren in AD3. Hoewel de etiologie van AD niet volledig is opgehelderd, geeft het beschikbare genetische, biochemische en experimentele bewijs aan dat de geleidelijke afzetting van Aβ een definitieve biomarker voor AD4is. Dit misgevouwen eiwit hoopt zich op in intracellulaire en extracellulaire ruimten en wordt verondersteld te worden betrokken bij synaptische verlies, verhoogde neuro ontsteking, en neurodegeneratie in de corticale en hippocampal regio's in de hersenen beïnvloed door AD5. Daarom is histochemische detectie van Aβ in het AD-weefsel een cruciale eerste stap in het ontwikkelen van niet-toxische, anti-amyloïde geneesmiddelen om de progressie van de advertentie te voorkomen.
In de afgelopen decennia zijn verschillende kleurstoffen en antilichamen door veel onderzoeklaboratoria gebruikt om Aβ-plaques in hersenweefsel te labelen en te afbeelden, maar sommige van deze methoden zijn tijdrovend en de gebruikte kleurstoffen of antilichamen zijn duur, waarvoor meerdere accessoires nodig zijn Chemische stoffen. Daarom zou de ontwikkeling van een goedkope manier van detectie van Aβ-plaques in de AD-hersenen een welkome nieuwe tool zijn. Veel laboratoria begonnen met het gebruik van cur, een veelbelovende anti-amyloïde natuurlijke polyfenol, voor labeling en beeldvorming Aβ, evenals een therapeutische agent voor AD6,7,8,9. De hydrofobiciteit en lypofiele aard, structurele gelijkenissen met klassieke amyloïde bindende kleurstoffen, sterke fluorescentie activiteit, evenals sterke affiniteit om te binden met Aβ maakt het een ideale de voor het labelen en beeldvorming van Aβ-plaques in AD-weefsel10 . Cur bindt met Aβ-plaques en oligomeren en de aanwezigheid ervan wordt ook gedetecteerd in intracellulaire ruimten7,11,12,13. Bovendien is aangetoond dat minimale hoeveelheden (1 − 10 nM) van cur can label Aβ plaques in 5x familiaire ziekte van Alzheimer (5xFAD) hersenweefsel7. Hoewel de concentratie van 1 nM niet de optimale fluorescentie intensiteit biedt voor het tellen van Aβ-plaques, is een concentratie van 10 nM of hoger van cur. Ran en collega's14 rapporteerden dat doses van slechts 0,2 nm van difluorboron-derivatized cur in vivo Aβ-afzettingen kunnen detecteren, evenals een infrarood sonde. Of deze dosis voldoende is om Aβ-plaques in weefsel te labelen, is nog steeds niet duidelijk. De meeste eerdere studies hebben 20 − 30 minuten gebruikt voor het kleuring van Aβ-plaques met behulp van cur, maar optimale kleuring kan veel minder tijd vergen.
De huidige studie werd ontworpen om de minimale tijd die door cur nodig is om Aβ-plaques in AD-hersenweefsel te labelen en om de gevoeligheid voor etikettering en beeldvorming van Aβ-plaques in hersenweefsel van de 5xFAD-muizen te vergelijken na kleuring met cur met andere conventionele Aβ-bindende kleurstoffen, zoals Thioflavine-S (thio-S), Congo rood (CR), en fluoro-Jade C (FJC). Het Aβ-etiketterings vermogen van deze klassieke amyloïde bindings kleurstoffen werd vergeleken met de huidige kleuring in paraffine-ingesloten en cryostaat coronale hersen secties van 5xFAD-muizen en van verouderde menselijke AD-en controle hersenweefsel. De bevindingen suggereren dat de cur-labels Aβ-plaques op een manier die vergelijkbaar is met Aβ-specifieke antilichamen (6E10) en matig beter dan thio-S, CR of FJC. Bovendien, wanneer intraperitoneale injecties van cur tot 5xFAD muizen werden toegediend voor 2 − 5 dagen, het stak de bloed-hersen barrière en gebonden met Aβ plaques7. Interessant is dat de nanomolaire concentraties van cur zijn gebruikt om Aβ-plaques in 5xfad-hersenweefsel7,14te labelen en te afbeelden. Bovendien kunnen morfologisch verschillende Aβ-plaques, zoals kern-, neuritische, diffuse en uitgebrande plaques, door cur efficiënter worden gelabeld dan met een van de andere conventionele amyloïde bindings kleurstoffen7. Overall, cur kan worden toegepast op etiket en beeld Aβ plaques in Postmortem hersenweefsel van AD diermodellen en/of menselijk AD weefsel op een eenvoudige en goedkope manier, als een betrouwbaar alternatief voor Aβ-specifieke antilichamen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het Dierenzorg-en gebruiks Comité (ACUC) van de Saginaw Valley State University. Het menselijk weefsel werd verkregen van een gevestigde hersen Bank aan het banner Sun Health Institute in Arizona15,16.
1. perfusie van de dieren
- Bereid de fixeer-en perfusie buffers voor.
- Bereid 0,1 M natriumfosfaat buffer door toevoeging van 80 g natriumchloride (NaCl), 2 g kaliumchloride (KCl), 21,7 g dinatriumwaterstoffosfaat (na2HPO4· 7h2O), 2,59 g kalium DIWATERSTOFFOSFAAT (KH2po4 ) en dubbel gedestilleerd water om in totaal 1 L te maken.
- Bereid 4% Paraformaldehyde (PFA) voor.
- Voeg 40 g Paraformaldehyde toe aan 1 L PBS (0,1 M, pH 7,4).
- Verwarm de PFA-oplossing tot 60 − 65 °C en meng met behulp van een magnetische roerder.
Opmerking: de temperatuur mag niet hoger zijn dan 65 °C. - Voeg enkele druppels NaOH (1 N) met een druppelaar toe om de PFA volledig op te lossen.
- Filtreer de PFA-oplossing met gemiddeld tot fijn filtreerpapier en bewaar bij 4 °C.
Opmerking: de oplossing is goed voor een maand.
- Voer dieren anesthesie en perfusie.
Opmerking: twaalf maanden oude B6SJL-TG APP SwFlLon, PSEN1 * M146L * L286V, 1136799Vas/J (5 × FAD) leeftijds afgestemde controle muizen (n = 6 per groep) werden gekocht bij verkopers en gefokt in het dieren huis van Saginaw Valley State University. Genotypering werd bevestigd door de polymerase kettingreactie (PCR) zoals eerder beschreven7. Menselijk AD hersenweefsel omvat post mortem AD hersenweefsel en leeftijdsgebonden controle weefsel.- Anesthetiseer het dier met een geschikte verdovingsmiddel, zoals natriumpentobarbital (390 mg/kg lichaamsgewicht), of een mengsel van ketamine/xylazine (tot 80 mg/kg lichaamsgewicht ketamine en 10 mg/kg lichaamsgewicht xylazine) door intraperitoneale injectie (27 G naald en 1 mL spuit). Controleer het niveau van de anesthesie door het knijpen van een teen. Als het dier niet reageert, is het klaar voor een perfusie operatie.
- Plaats verdoken dier in de liggende positie op de perfusie chirurgie lade en het gebruik van kleine Iris schaar maken een incisie aan de achterste uiteinde van de linker ventrikel.
- Plaats een 22 G perfusie naald aan de linker ventrikel en maak een kleine incisie aan de rechter oorschelp om perfusievloeistof uit het lichaam te verwijderen. Gebruik een met zwaartekracht gevoed perfusie systeem om de ijskoude perfusievloeistof (0,1 M PBS, pH 7,4) gedurende 5 − 6 minuten te laten stromen (debiet 20 − 25 ml/min).
Opmerking: een heldere lever is de indicator van een optimale perfusie. - Zet de buffer klep op een ijskoude 4% Paraformaldehyde oplossing voor bevestiging en laat deze gedurende 8 − 10 minuten stromen.
Opmerking: Tremor gevolgd door verharde of stijve ledematen zijn indicatoren van goede fixatie. - Verwijder de hersenen uit de schedel met behulp van een schaar. Gebruik een spatel, verzamel de hersenen en plaats deze in een Injectieflacon van 4% PFA (ten minste 10x het volume van het hersenvolume) en bewaar deze bij 4 °C tot verder gebruik.
2. weefsel verwerking
- Cut cryostaat secties.
- Breng de hersenen over naar gegradeerde sucrose-oplossingen (10%, 20% en 30%) en bewaren bij 4 °C voor 24 uur per stuk, tot gebruik.
- Gebruik een cryostaat bij-22 °C, snijd 40 μm dikke delen. Verzamel 10 − 20 secties per put in een 6-put plaat gevuld met PBS en natrium natriumazide (0,02%).
- Paraffine insluiten de secties voor muis en menselijk hersenweefsel.
- Voor paraffine secties, dehydraat de geperfundeerd en 24 h post-vast hersenweefsel met gesorteerde alcoholen (50%, 70%, 90%) voor 2 h elk, gevolgd door 100% alcohol 2x voor 1 h elk), en vervolgens met xyleen 2x voor 1 h elk) bij kamertemperatuur.
- Penetreren het weefsel met xyleen-paraffine (1:1) 2x voor 1 uur bij 56 °C in een conische glazen kolf bedekt met aluminiumfolie.
- Dompel het weefsel onder in gesmolten paraffine (56 °C) gedurende 4 − 6 uur.
- Snijd 5 μm dikke delen met behulp van een roterende microtoom bij kamertemperatuur en plaats ze in een weefselwaterbad van 45 °C.
- Histochemisch etikettering van de Aβ-plaques in de cryostaat-secties met cur.
- Spoel de secties uit stap 2.1.2 met PBS (pH 7,4) 3x voor 5 min elk.
- Dompel de secties onder in 70% ethanol gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Los voorraad cur (1 mM) op in methanol en Verdun met 70% ethanol om een uiteindelijke werkconcentratie van 10 μM te verkrijgen.
- Dompel de secties met een werkende cur-oplossing gedurende 1 − 5 min bij kamertemperatuur op een shaker bij 150 rpm.
- Gooi de huidige oplossing weg en was met 70% ethanol 3x voor 2 minuten per stuk.
- Zet de secties op poly-L-lysine gecoate glazen dia's en monteer met een dekglaasje met behulp van organische montage media, zoals distyreen weekmaker xyleen (DPX).
- Weergave onder een fluorescentiemicroscoop met 480/550 nm excitatie/emissie filters.
- Histochemisch etikettering van de Aβ-plaques in de met paraffine ingesloten muis en menselijke hersen secties met cur.
- Deparaffine de weefsel secties uit stap 2.2.4 met xyleen 2x voor 5 min elk bij kamertemperatuur.
- Hydrateer met gesorteerde alcohol oplossingen (100%, 80%, 70%, 50% voor elk 1 min) en met gedistilleerd water 2x gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
- Vlekkendelen met cur (10 μM) gedurende 10 min bij kamertemperatuur in het donker, schudden bij 150 rpm. Wassen met 70%, 90%, en 100% alcohol voor 2 min elk.
- Helder met xyleen 2x voor 5 min elk en cover slip met DPX.
- Visualiseer onder een fluorescentiemicroscoop zoals vermeld in stap 2.3.7.
- Colocaliseren cur met het Aβ-antilichaam in Aβ-plaques en oligomeren.
- Was cryostatiesecties uit stap 2.1.2 met PBS 3x in een 12-put plaat.
- Blokkeer de secties met 10% normaal geiten serum (NGS) opgelost in PBS met 0,5% Triton-X-100 bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Gooi de blokkerende oplossing weg. Inbroed de secties met Aβ-specifieke antilichamen (6E10 of A11, verdund 1:200) opgelost in verse blokkerende oplossing met 10% NGS en 0,5% Triton-X100 's nachts bij 4 °C in een shaker bij 150 rpm.
- Gooi de antilichaam oplossing weg en was de secties met PBS 3x voor 10 min elk.
- Inbroed met de secundaire antilichaamtag met rode de (bijv. Alexa 594) voor 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
- Wassen met PBS 3x voor 10 min elk.
- Wassen met 70% alcohol 1x.
- Inincuberen de delen met cur (10 μM) gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
- Wassen met 70% alcohol 3x voor 1 min elk.
- Dehydraat met 90% en 100% alcohol gedurende 1 minuut, helder met xyleen 2x voor 5 min elk, en monteer op dia's met behulp van DPX.
- Visualiseer met behulp van een fluorescentiemicroscoop met geschikte excitatie/emissie filters voor de rode en groene signalen.
- Voor intracellulaire Aβ-colokalisatie, vlek de secties met behulp van Aβ-antilichaam (6E10), restain met cur bij kamertemperatuur in het donker met schudden bij 150 rpm, en contra vlek met ofwel Hoechst-33342 (1 mg/ml) en/of DAPI (1UG/ml) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker met schudden bij 150 rpm. Wassen met PBS 3x.
- Maak afbeeldingen met de rode, groene en blauwe filters met een 100x-doelstelling (totale vergroting 1.000 x).
- Label Aβ plaques met thio-S, CR, en FJC.
Opmerking: gedetailleerde protocollen voor thio-S en CR-labeling werden eerder gemeld7.- Was voor FJC-kleuring de vrij zwevende secties die uit stap 2.1.2 zijn verkregen met PBS 3x gedurende 5 minuten per stuk.
- Leg de delen in een 12-put plaat en beits met FJC (0,001%) gedurende 10 min in het donker bij kamertemperatuur.
- Gooi de FJC-oplossing weg en was elke 5 minuten met PBS 3x.
- Incuberen met ammoniumchloride (NH4Cl, 50 mm opgelost in PBS) gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
- Gooi de NH4cl-oplossing weg en was elke 5 minuten met PBS 3x.
- Na de stappen in punt 2,4, dehydraat met gesorteerde alcohol oplossingen, Clear, Mount en View onder een fluorescentie Microscoop met behulp van 450/520 nm excitatie/emissie filters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Curcumine etiketten Aβ plaques binnen een minuut. Wanneer we gekleurd 5xFAD weefsel met cur, we vonden dat cur label Aβ plaques binnen 1 min. Hoewel de toegenomen incubatietijd met de cur de intensiteit van de fluorescentie van Aβ-plaques enigszins verhoogde, was het aantal waargenomen Aβ-plaques niet significant verschillend tussen 1 min en 5 min kleurings tijd (Figuur 1).
Cur kan Aβ-plaques labelen in cryostat-bereide, paraffine-ingesloten muis en menselijk AD-weefsel dat colocaliseert met Aβ-specifieke antilichamen in muis AD-hersenweefsel. Bij het bevlekt cryogedeelte, paraffineembedded secties (Figuur 2A) en menselijk AD weefsel (Figuur 2B), observeerden we cur-gelabelde Aβ-plaques in alle soorten weefsel secties. Bovendien, om te bevestigen dat cur bindend is voor Aβ-plaques, hebben we eerst de plaques gelabeld met 6E10, gevolgd door de huidige kleuring. We hebben geconstateerd dat de cur volledig was gelokaliseerd met Aβ op dezelfde plaques die de 6E10 gebonden waren (Figuur 2C).
Van de huidige gelabelde Aβ-oligomeren en intracellulaire Aβ-aggregaten. Om na te gaan of cur de Aβ oligomeren kon labelen, werden 5xFAD muis secties bevlekt met een Aβ oligomer-specifiek antilichaam (A11), gevolgd door de huidige kleuring. We observeerden die cur-cogelokaliseerd met A11 in Aβ-plaques (Figuur 3A). Evenzo is cur ook samengelokaliseerd met het 6E10-antilichaam in intracellulaire ruimten (Figuur 3B), wat aangeeft dat het de intracellulaire Aβ kan labelen.
Cur gelabeld Aβ prominenter dan klassieke amyloïde bindende kleurstoffen. Aβ-labeling door cur werd vergeleken met in de handel verkrijgbare amyloïde bindings kleurstoffen thio-S, CR, FJC. Het Aβ-specifieke antilichaam 6E10 werd gebruikt als standaardcontrole. We observeerden dat cur gelabeld Aβ prominenter dan de conventionele amyloïde bindende kleurstoffen (Figuur 4).
Cur derivaten bis-demethoxycurcumine (BDMC) en demethoxycurcumine (DMC), ook aanwezig in kurkuma extract, label Aβ plaques relatief naar cur in 5xFAD hersenweefsel. Twee andere belangrijke componenten, zoals BDMC en DMC, zijn aanwezig in kurkuma-extract. We testten of deze twee verbindingen ook Aβ-plaques, vergelijkbaar met cur, labelen. Wanneer 5xfad muis hersen secties waren bevlekt met deze derivaten, zowel bdmc en DMC ook gelabeld Aβ plaques, gepaard cur (Figuur 5A). Verschillende bevestigings media werden onderzocht om te controleren op interferentie met Aβ-beeldvorming na kleuring met cur. Het fluorescerende signaal was intact in zowel waterige als organische montage media, zoals DPX (Figuur 5B). De kleuring van Aβ-plaques met cur was passend na immunofluorescentie-labeling en gevolgd door contra-kleuring met Hoechst 33342-oplossing (1 mg/ml) of 4 ′, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI, 1μg/ml). De immunofluorescentie signalen en de intensiteit van de tegen kleuring bleven gehandhaafd na de huidige kleuring (Figuur 5C).
Figuur 1: curcumine etiketten Aβ plaques binnen een minuut. A). hersen secties van 5xFAD muizen of menselijke controle en AD corticale weefsel werden gekleurd met cur (10 μM) voor 1 − 5 min en het aantal zichtbare plaques werden geteld. (B). er werd geen verschil waargenomen in het aantal Aβ-plaque tellingen tussen de kleurings tijden van 1 min en 5 min. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaardfout van gemiddelde (SEM). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Colokalisatie van cur met Aβ-antilichaam in Aβ-plaques. Cur kan Aβ-plaques in cryostat-bereide, paraffine-ingesloten secties (a) en menselijk AD weefsel (B) labelen. De Aβ-labeling parallel aan de labeling met Aβ-specifieke antilichamen (6E10, DAB-kleuring). (C). de 5xFAD-secties werden eerst gelabeld met Aβ-antilichamen (6E10), gevolgd door vlekken met cur. Rood = 6e10 gebonden door een secundair antilichaam getagd met Alexa de 594. Groen = cur. Cur volledig gelokaliseerd met Aβ op dezelfde plaques die gebonden zijn aan 6E10. Pijlen geven Aβ-plaques aan. Schaalbalk geeft 50 μm (totale vergroting = 400x) aan in alle drie de afbeeldingen aan de linkerzijde en 10 μm (totale vergroting = 400x). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: curcumine etiketten Aβ oligomeren en intracellulaire Aβ. A) Aβ-oligomeren werd immunohistochemisch gedetecteerd met behulp van een Aβ-specifiek antilichaam (A11), gevolgd door kleuring met cur. Cur volledig cogelokaliseerd met Aβ, bij hetzelfde oligomeren waar A11 bindt. Schaalbalk = 250 μm en totale vergroting = 100x. B) op dezelfde manier werd intracellulaire Aβ gedetecteerd immunohistochemisch met behulp van een Aβ-specifiek antilichaam (6E10), gevolgd door kleuring met cur. Merk op dat cur volledig is gelokaliseerd met Aβ in dezelfde gebieden gebonden aan 6E10. Schaalbalk = 50 μm en totale vergroting = 1.000 x. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: vergelijking van verschillende amyloïde bindende kleurstoffen met cur om Aβ-plaques te labelen. Cryostat secties (40 μm) uit de cortex van 12 maanden oude 5xFAD muizen werden gekleurd met cur, Thioflavine-S, Congo rood, fluoro-Jade C, en met 6E10 antilichaam. Op de cur gelabelde Aβ-plaques prominenter dan thio-S, CR en FJC. Pijlen geven Aβ-plaques aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: cur-derivaten bis-demethoxy curcumine en demethoxy curcumine ook label Aβ vergelijkbaar met cur. A) zowel cryostatica als paraffine-ingesloten 5xFAD-secties werden bevlekt met cur-derivaten bis-demethoxy curcumine en demethoxy curcumine. Beide derivaten labelen Aβ plaques op een manier die vergelijkbaar is met cur. B) zowel waterige als organische bevestigings media (DPX) werden gebruikt om weefsel secties te monteren na het labelen van Aβ-plaques met cur. C) immunolabeled secties werden gebruikt voor Aβ-labeling met cur. De witte pijlen geven Aβ-plaques aan, de groene pijl geeft geactiveerde astrocyten (GFAP) aan en de gele pijl geeft kern kleuring (DAPI) aan. Schaal staven = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Functies | Aβ-antilichaam | Curcumine | Thio-S | Congo rood | Fluoro-Jade C |
| Duur van de kleuring | ~ 24-48 h | ~ 1-5 min | ~ 10 min | ~ 60 min | ~ 30 min |
| Toebehoren chemicaliën | Secundaire antilichamen, verschillende chemicaliën om buffer te maken, normaal geit serum | Methanol | Ethanol | NaOH en ethanol | NaOH en ethanol, kaliumpermanganaat |
| Kosten | Duur: een Aβ-specifieke injectieflacon met antilichamen vereist ~ $200-300 | Kosteneffectief: ~ $5-10/1 g cur en kan worden toegepast voor veel weefsels | Kosteneffectief: ~ $5/1 g, kan worden toegepast voor enkele weefsels | Kosteneffectief: > $5/1 g Congo rood, en kan worden toegepast voor verschillende weefsels | Duur: ~ $15.500/1 g FJC poeder |
| Specificiteit | Er zijn verschillende antilichamen nodig voor Aβ-oligomeren en fibrillen | Curcumine bindt met Aβ oligomeren en fibrillen | Kan alleen fibrils binden, niet monomeren of oligomeren | Kan alleen binden met Aβ-protofibrillen en fibrillen16, 17 | Kan alleen binden met Aβ-fibrils en ontaarde neuronen |
| Stabiliteit | Afhankelijk van de kleurstof die aan het secundaire antilichaam | Zeer stabiel, zelfs bij kamertemperatuur wanneer gebonden met Aβ | Stabiel in methanol | Stabiel in ethanol | Niet stabiel |
| Verzorging na kleuring | Extra verzorging nodig heeft na het vlekken, zoals in het donker worden bewaard en de hele tijd bevroren | Niet zo lichtgevoelig en stabieler bij kamertemperatuur | Lichtgevoelig | Niet lichtgevoelig | Lichtgevoelig |
| Microscoop vereist | Samengesteld licht of fluorescerende (afhankelijk van het gebruik van secundair antilichaam) | Fluorescerende | Fluorescerende | Lichtmicroscoop of gepolariseerde Microscoop of polariseren filter | Fluorescerende |
| Achtergrondkleuring | Over het algemeen geen achtergrond | Zeer lage achtergrond | Hoge achtergrond als gevolg van binding met lipide-membraan of lipide-verbindingen in cel | Lage achtergrond | Hoge achtergrond |
| In vivo Aβ-Imaging | Mogelijk niet van toepassing | Zeer toepasselijk | Mogelijk niet van toepassing | Mogelijk niet van toepassing | Mogelijk niet van toepassing |
Tabel 1: vergelijking van Aβ-labeling met verschillende amyloïde bindende kleurstoffen en cur7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Onze hypothese was dat cur zou kunnen worden gebruikt als de snelste, eenvoudigste en minst dure manier om Aβ-plaques in het postmortemad hersenweefsel te labelen en te afbeeldenten in vergelijking met andere klassieke amyloïde bindende kleurstoffen, evenals Aβ-specifieke antilichamen. De doelstellingen van deze studie waren het bepalen van de minimumtijd die nodig is om Aβ-plaques te labelen en te afbeelden door cur in het postmortemad hersenweefsel en te bepalen of cur kan worden gebruikt als alternatief voor Aβ-antilichamen voor het labelen van Aβ-plaques. Hiertoe werd het Aβ-etiketterings vermogen van cur op verschillende tijdstippen waargenomen. Cur was in staat om Aβ binnen één minuut te labelen. Bovendien was het labelen van Aβ door cur groter dan andere conventionele amyloïde bindende kleurstoffen, zoals thio-S (0,1%), CR (1%) en FJC (0,001%).
Cur wordt beschouwd als een unieke en ideale de voor Aβ-labeling, omdat het de meeste kenmerken bezit van de meeste conventionele amyloïde bindende kleurstoffen, met inbegrip van structurele, fysische, chemische en biologische eigenschappen10. Bovendien, als gevolg van de betaalbaarheid, de meeste onderzoekers zijn geïnteresseerd in het gebruik van deze natuurlijke polyfenol. Om de specificiteit van de huidige binding aan Aβ-plaques en oligomeren te tonen, gebruikten we 6E10 en A11 (Aβ-oligomer-specifiek antilichaam). Cur toonde bijna volledige colokalisatie met alle verschillende soorten Aβ aanwezig in het weefsel, wat suggereert dat cur zeer specifiek is voor Aβ7,17,18,19,20. Bovendien, cur gelabelde Aβ-oligomeren (Figuur 3A) en intracellulaire Aβ-aggregaten (figuur3b) en gecogelokaliseerd met Aβ-antilichamen (Figuur 2b), wat suggereert dat cur kan extracellulaire Aβ-plaques, maar ook Aβ afgezet in intracellulaire ruimten7.
In de afgelopen decennia zijn verschillende fluoroforen en antilichamen ontwikkeld om Aβ-plaques histochemisch te labelen en te afbeelden. Ongetwijfeld zijn de meesten van hen zeer specifiek voor gerichte Aβ-soorten en voor het opsporen van Aβ-plaques, maar deze zijn veel duurder en het gebruik ervan is meer tijdrovend dan het gebruik van cur. We vergeleek bijvoorbeeld de Aβ-plaque binding door cur, met andere amyloïde bindende kleurstoffen, zoals thio-S, CR en FJC, waar Aβ-specifiek antilichaam (6E10) werd gebruikt als referentie controle. Deze resultaten suggereren dat de cur-labels Aβ-plaques krachtiger zijn dan enig ander fluoroforen. Belangrijker nog, ten opzichte van cur, sommige van de meer gebruikte fluoroforen hebben verschillende nadelen in termen van labeling en beeldvorming Aβ. Bijvoorbeeld, thio-S kan een storende, hoge achtergrond produceren omdat het bindt met lipide membranen of lipide-verbindingen in de cel21. Evenzo produceert CR, dat vaak wordt gebruikt om Aβ te labelen, appelgroen dubbele breking (Figuur 4) onder een gepolariseerde Microscoop. CR heeft geen label van Aβ-plaques net zo gemakkelijk als cur of thio-S, en labeling significant minder Aβ-plaques dan die gedetecteerd door cur7,22,23. Gutierrez et al. meldde dat FJC, dat kan binden met Aβ en met ontaarde neuronen, etiketten met een lagere frequentie dan ofwel cur of thio-S24. Deze resultaten suggereren dat deze veelgebruikte klassieke markers minder affiniteit hebben voor binding aan Aβ-plaques dan cur.
Bovendien kan etikettering van verschillende Aβ-plaque typen (kern, neuritisch, diffuus, uitgebrande) worden geoptimaliseerd met cur, in plaats van andere amyloïde bindende fluor Foren, omdat cur kan helpen om morfologisch verschillende Aβ-plaques te visualiseren en te onderscheiden, terwijl andere technieken kunnen deze morfologische subtypen7niet onderscheiden. Evenzo is het gebruik van Aβ-specifieke antilichamen, die zeer specifiek zijn voor verschillende soorten Aβ, zeer kostbaar en tijdrovend, waarbij ten minste 24 − 48H via immunohistochemie wordt gebruikt. Bovendien vereisen het opsporen van verschillende soorten Aβ verschillende antilichamen, evenals verschillende accessoire-chemicaliën, die aanzienlijk bijdraagt aan de totale kosten. Het is duidelijk dat cur minder kostbaar, gemakkelijker beschikbaar is en hogere fluorescentie intensiteit produceert wanneer het bindt aan Aβ-plaques. Hoewel CR ook een relatief kosteneffectieve techniek is voor het labelen en beeldvorming van Aβ-plaques, kan cur meer van de Aβ-soorten binden en labelen, zoals oligomeren25 (Figuur 3 en Figuur 4), terwijl CR alleen bindt aan protofibrillen en fibrillen23. Daarom kan Aβ-labeling met cur efficiënter en kosteneffectiever worden bereikt dan door thio-S, CR of FJC (tabel 1).
Kortom, cur kan Aβ-plaques en oligomeren van AD-hersenweefsel effectief, snel en goedkoop detecteren. Bovendien is de huidige binding aan Aβ zeer specifiek en is de fluorescerende activiteit zeer stabiel. Het vereist minimale hoeveelheden (1-10 nM) om Aβ te labelen. Bovendien is cur ook zeer specifiek voor verschillende Aβ-soorten, zoals fibrillen of plaques, evenals oligomeren7. Op dezelfde manier, cur derivaten demethoxycurcumine en bisdemethoxycurcumine Harbor ook amyloïde binding eigenschappen en c label Aβ vergelijkbaar met cur10 (Figuur 5A). Daarom is cur een ideale de voor het labelen en beeldvorming van Aβ-plaques in Postmortem hersenweefsel. Het kan worden gebruikt als een snel en gemakkelijk alternatief voor het detecteren van Aβ plaque belasting na anti-amyloid therapie in experimentele dierlijke modellen van AD. Onze bevindingen bevestigen de meldingen van de hoge affiniteit van cur tot Aβ, en versterken het potentiële gebruik ervan voor het monitoren van Aβ-plaques in het postmortembrein en in levend weefsel.
Voor optimale cur labeling is het raadzaam om niet te labelen Aβ met cur in onperfused weefsel en om te voorkomen dat lange termijn weefsel opslag, als het een grotere hoeveelheid achtergrond kan produceren, zelfs wanneer perfused. Voor colabeling wordt het aanbevolen om eerst immunohistochemie te voltooien met het specifieke antilichaam dat wordt gebruikt voordat het met cur wordt gekleurd en volg dit vervolgens met tegen kleuring met DAPI of Hoechst.
Mogelijke wijzigingen aan deze methode zijn het verhogen van de incubatietijd van cur met het weefsel tot 30 min, wat de signaalintensiteit niet verstoort, hoewel het de achtergrond kan vergroten tijdens beeldvorming. Afnemende concentratie van cur tot minder dan 10 μM interfereert niet in de Aβ-labeling tot een significant niveau. Om de achtergrond voor menselijk hersenweefsel te verminderen, kan een alternatieve bereidingsmethode worden toegepast. Hersen secties kunnen bijvoorbeeld in eerste instantie worden behandeld met 0,3% (w/v) Sudan Black B in 70% ethanol (v/v) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens kon de sectie worden gekleurd met cur voor 10 min bij kamertemperatuur en gewassen met PBS 3x voor 15 min, tegenwicht en gemonteerd met antifading media13. Cryostat sectie diktes kunnen ook worden verlaagd tot 20 − 25 μm.
Mogelijke voorbehoud van deze methode zijn cur binding met Aβ aanwezig in de bloedvaten, die verschilt van de extracellulaire Aβ plaques. Zo moet de onderzoeker zich bewust zijn van de morfologie van Aβ-plaques en oligomeren van Aβ in bloedvaten. De onderzoeker moet zich bewust zijn van auto-fluorescerende signalen. Overtollige groene achtergrond kan af en toe worden gezien na de huidige kleuring, maar dit kan worden verminderd door de kleurings tijd te verlagen of door de concentratie van cur te verlagen. Ten slotte kan het signaal voor colabeling met andere markers worden verlaagd als gevolg van herhaalde behandelingen met de clearingagent (bijv. xyleen).
Belangrijke beperkingen zijn het onvermogen om colabel met een marker eiwit met behulp van secundaire antilichaam gelabeld met groene fluorescerende kleurstof, zoals fluorescerende isothiocyanaten (FITC). Deze kunnen niet worden gebruikt vanwege de soortgelijke excitatie/emissie van cur. Ook in de vroege stadia van de AD kunnen slechts beperkte hoeveelheden Aβ worden gelabeld door cur. Ten slotte is er een behoefte om te werken in een donkere omgeving, zoals elke fluorescerende kleurstof.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Ondersteuning voor deze studie kwam van het veld Neurosciences Institute op Ascension of St. Mary's.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | IHC world, Woodstock, MD | ||
| Aanimal model of Alzheimer's disease | Jackson's laboratory, Bar Harbor, ME | ||
| Absolute alcohol | VWR,Radnor, PA | ||
| Alexa 594 | Santacruz Biotech, Dallas, TX | ||
| Antibody 6E10 | Biolegend, San Diego, CA | ||
| Antibody A11 | Millipore, Burlington, MA | ||
| Compound light microscope | Olympus, Shinjuku, Japan | Olympus BX51 | |
| Congo red | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Cryostat | GMI, Ramsey, MN | LeicaCM1800 | |
| Curcumin | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Disodium hydrogen phosphate | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Dystyrene plasticizer xylene | BDH, Dawsonville, GA | ||
| Filter papers | Fisher scientific, Pittsburgh, PA | ||
| Hoechst-33342 | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Inverted fluorescent microscope | Leica, Buffalo Grove, IL | Leica DMI 6000B | |
| Inverted fluorescent microscope | Olympus, Shinjuku, Japan | Olympus 1x70 | |
| Normal goat serum | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Paraffin | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Paraformaldehyde | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Ploy-lysine coated charged glass slide | Globe Scientific Inc, Mahwah, NJ | ||
| Potassium chloride | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium azide | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium chloride | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium hydroxide | EMD Millipore, Burlington, MA | ||
| Sodium pentobarbital | Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI | ||
| Thioflavin-S | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Triton-X-100 | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Xylene | VWR,Radnor, PA |
References
- Cummings, J. L. Alzheimer's disease. New England Journal of Medicine. 351 (1), 56-67 (2004).
- Jack, C. R., Holtzman, D. M. Biomarker modeling of Alzheimer's disease. Neuron. 80 (6), 1347-1358 (2013).
- Tarawneh, R., Holtzman, D. M. The clinical problem of symptomatic Alzheimer disease and mild cognitive impairment. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (5), (2012).
- Selkoe, D. J. Cell biology of protein misfolding: the examples of Alzheimer's and Parkinson's diseases. Nature Cell Biology. 6 (11), 1054-1061 (2004).
- Hardy, J., Allsop, D. Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).
- Chen, M., et al. Use of curcumin in diagnosis, prevention, and treatment of Alzheimer's disease. Neural Regeneration Research. 13 (4), 742-752 (2018).
- Maiti, P., et al. A comparative study of dietary curcumin, nanocurcumin, and other classical amyloid-binding dyes for labeling and imaging of amyloid plaques in brain tissue of 5x-familial Alzheimer's disease mice. Histochemistry and Cell Biology. 146 (5), 609-625 (2016).
- Maiti, P., Dunbar, G. L. Use of Curcumin, a Natural Polyphenol for Targeting Molecular Pathways in Treating Age-Related Neurodegenerative Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), (2017).
- Maiti, P., Dunbar, G. L. Comparative Neuroprotective Effects of Dietary Curcumin and Solid Lipid Curcumin Particles in Cultured Mouse Neuroblastoma Cells after Exposure to Abeta42. International Journal of Alzheimer's Disease. , (2017).
- den Haan, J., Morrema, T. H. J., Rozemuller, A. J., Bouwman, F. H., Hoozemans, J. J. M. Different curcumin forms selectively bind fibrillar amyloid beta in post mortem Alzheimer's disease brains: Implications for in-vivo diagnostics. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 75 (2018).
- Koronyo, Y., et al. Retinal amyloid pathology and proof-of-concept imaging trial in Alzheimer's disease. JCI Insight. 2 (16), (2017).
- Koronyo, Y., Salumbides, B. C., Black, K. L., Koronyo-Hamaoui, M. Alzheimer's disease in the retina: imaging retinal abeta plaques for early diagnosis and therapy assessment. Neurodegenerative Diseases. 10 (1-4), 285-293 (2012).
- Koronyo-Hamaoui, M., et al. Identification of amyloid plaques in retinas from Alzheimer's patients and noninvasive in vivo optical imaging of retinal plaques in a mouse model. NeuroImage. 54 (Suppl 1), S204-S217 (2011).
- Ran, C., et al. Design, synthesis, and testing of difluoroboron-derivatized curcumins as near-infrared probes for in vivo detection of amyloid-beta deposits. Journal of the American Chemical Society. 131 (42), 15257-15261 (2009).
- Beach, T. G. The Sun Health Research Institute Brain Donation Program: Description and Experience, 1987-2007. Cell Tissue Bank. 9 (3), 229-245 (2008).
- Green, S. J., Killiany, R. J. Subregions of the inferior parietal lobule are affected in the progression to AD. Neurobiology of Aging. 31 (8), 1304-1311 (2010).
- Ono, K., Hasegawa, K., Naiki, H., Yamada, M. Curcumin has potent anti-amyloidogenic effects for Alzheimer's beta-amyloid fibrils in vitro. Journal of Neuroscience Research. 75 (6), 742-750 (2004).
- Garcia-Alloza, M., Borrelli, L. A., Rozkalne, A., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. Curcumin labels amyloid pathology in vivo, disrupts existing plaques, and partially restores distorted neurites in an Alzheimer mouse model. Journal of Neurochemistry. 102 (4), 1095-1104 (2007).
- Mutsuga, M., et al. Binding of curcumin to senile plaques and cerebral amyloid angiopathy in the aged brain of various animals and to neurofibrillary tangles in Alzheimer's brain. Journal of Veterinary Medical Science. 74 (1), 51-57 (2012).
- Tei, M., Uchida, K., Mutsuga, M., Chambers, J. K., Nakayama, H. The binding of curcumin to various types of canine amyloid proteins. Journal of Veterinary Medical Science. 74 (4), 481-483 (2012).
- Liu, L., Komatsu, H., Murray, I. V., Axelsen, P. H. Promotion of amyloid beta protein misfolding and fibrillogenesis by a lipid oxidation product. Journal of Molecular Biology. 377 (4), 1236-1250 (2008).
- Wu, C., Scott, J., Shea, J. E. Binding of Congo red to amyloid protofibrils of the Alzheimer Abeta(9-40) peptide probed by molecular dynamics simulations. Biophysical Journal. 103 (3), 550-557 (2012).
- Wu, C., Wang, Z., Lei, H., Zhang, W., Duan, Y. Dual binding modes of Congo red to amyloid protofibril surface observed in molecular dynamics simulations. Journal of the American Chemical Society. 129 (5), 1225-1232 (2007).
- Gutierrez, I. L., et al. Alternative Method to Detect Neuronal Degeneration and Amyloid beta Accumulation in Free-Floating Brain Sections With Fluoro-Jade. ASN Neuro Methods. 10, 1-7 (2018).
- Yang, F., et al. Curcumin inhibits formation of amyloid beta oligomers and fibrils, binds plaques, and reduces amyloid in vivo. Journal of Biological Chemistry. 280 (7), 5892-5901 (2005).
