Summary
المجهر البصري فائقه الدقة المستندة إلى الرقاقة هو نهج جديد للمجهر الفلوري ويقدم مزايا في فعاليه التكلفة والانتاجيه. هنا ، يتم عرض بروتوكولات لاعداد رقاقه والتصوير لمجهر TIRF والتعريب المستندة إلى المجهر فائقه الدقة.
Abstract
ويشيع استخدام إجمالي الانعكاس الداخلي (TIRF) في التعريب جزيء واحد علي أساس المجهر فائقه الدقة كما انه يعطي التباين المعزز بسبب التحليل البصري. النهج التقليدي هو استخدام المجهر الرقمي عاليه الفتحة الأهداف TIRF لكل من الاثاره وجمع ، والحد بشده مجال الرؤية والانتاجيه. نقدم نهجا جديدا لتوليد الاثاره TIRF للتصوير مع الموجات الموجية البصرية ، ودعا التنظير القائم علي رقاقه. الهدف من هذا البروتوكول هو توضيح كيفيه تنفيذ التصوير المستند إلى الرقاقة في اعداد تم بناؤه بالفعل. الميزة الرئيسية من التنظير القائم علي رقاقه هو ان يتم فصل مسارات الاثاره وجمع. ويمكن بعد ذلك ان يتم التصوير مع عدسه التكبير منخفضه ، مما ادي إلى مجال كبير من الصور TIRF الرؤية ، بسعر انخفاض طفيف في القرار. خلايا الكبد الغشائية الحلقية (LSECs) كانت باستخدام المجهر البصري العشوائي المباشر لأعاده البناء (العاصفةd) ، والتي تظهر قرارا مشابها لمجاهر الدقة الفائقة التقليدية. الاضافه إلى ذلك ، فاننا نظهر قدرات عاليه الانتاجيه عن طريق التصوير 500 μm x 500 μm المنطقة مع عدسه التكبير منخفضه ، وتوفير قرار من 76 نانومتر. من خلال شخصيتها المدمجة ، يمكن تحديث التصوير القائم علي الرقاقات في المجاهر الأكثر شيوعا ويمكن دمجها مع التقنيات البصرية الأخرى علي الرقاقة ، مثل الاستشعار علي الرقاقة ، والطيف الطيفي ، والملائمة البصرية ، الخ. التالي فان هذه التقنية مناسبه بشكل مثالي للتصوير فائق الدقة ثنائي الابعاد ، ولكنها توفر أيضا فرصا كبيره للتحليل متعدد الوسائط.
Introduction
منذ المظاهرة الاولي من جزيء واحد المجهر التعريب ، وقد وضعت العديد من الاختلافات لحل التحديات المختلفة1،2،3. واحد التحديات التي ظلت ، ومع ذلك ، هو مجال كبير من وجهه نظر dSTORM التصوير. العديد من الاجهزه dالعاصفة استخدام نفس العدسة الهدف لكلا تثير العينة والصورة عليه. من أجل زيادة مجال الرؤية ، هناك حاجه إلى عدسه التكبير منخفضه. العدسات الموضوعية منخفضه التكبير ومنخفضه الفتحة العددية (NA) عاده ما يكون لها عمق كبير في الحقل ، مما يؤدي إلى زيادة الاشاره خارج الطائرة التي ستقلل من دقه التعريب. ويشيع استخدام أهداف TIRF لزيادة التباين في الصورة عن طريق الحد من الفلورية خارج الطائرة. من خلال [تيرف], حددت الاثاره إلى سماكه بصريه من تقريبا 150 [نم] من السطح بواسطة [افيسسنت] مجال4. العدسات الموضوعية TIRF تتطلب NA كبيره مما ادي إلى مجال صغير من الرؤية (فوف) (علي سبيل المثال ، 50 x 50 μm2) ، مما يحد من الانتاجيه بشكل ملحوظ. ومع ذلك ، هناك طرق بديله لتوليد حقل التخدير.
دليل الموجي البصري هو الهيكل الذي سيتم حصر وتوجيه الضوء إذا كان يقترن في الهيكل. الأكثر شيوعا ، وتستخدم الموجات الموجية في الاتصالات القائمة علي ألياف. وقد بذلت جهود كبيره من أجل تطوير الموجات الموجية المتكاملة ثنائيه الابعاد كمكون رئيسي للدوائر المتكاملة الضوئية. وقد تقدمت التكنولوجيا إلى نقطه حيث افتعال المنخفضة الخسارة نانو منظم الموجات البصرية يمكن ان يتم بشكل روتيني5. اليوم ، يمكن استخدام العديد من المصهر في جميع انحاء العالم لتطوير الدوائر المتكاملة ضوئيه. دليل الموجات الموجية الضوء من خلال الانعكاس الداخلي الكلي أيضا إظهار حقل التخدير علي السطح. من خلال تصميم دقيق للهيكل الموجه الموجي ، يمكن تحقيق كثافة عاليه في حقل التخدير. التالي يمكن أيضا ان تكون العينة الموضوعة مباشره فوق سطح الموجه الموجي مضيئه بواسطة الحقل الذي لا يمكن التخدير منه لتطبيقات التصوير. سيتم إنشاء حقل التخدير علي طول طول وعرض الموجه الموجي ، التالي فانه يمكن جعلها كبيره بشكل تعسفي6.
نقدم نهجا جديدا ل TIRF dالعاصفة التي توفر مجالا واسعا بشكل اعتباطي للراي. بدلا من استخدام عدسه TIRF لكل من الاثاره وجمع ، ونحن تثير استخدام حقل evتخدير من الموجات الموجية البصرية. هذا يفصل الاثاره وجمع مسار الضوء ، مما يسمح للحرية الكاملة علي طول مسار الضوء جمع دون المساومة البصرية التماس لطول موجي معين المقدمة من قبل الاضاءه رقاقه الموجه الموجي. التالي يمكن استخدام عدسات التكبير منخفضه لصوره مناطق كبيره جدا في وضع TIRF ، علي الرغم من ان NA أصغر سيقلل من القرار الجانبي. وعلاوة علي ذلك ، يتم أيضا تبسيط التصوير متعدد ألوان بشكل كبير باستخدام الموجات الموجية7، حيث يمكن توجيه العديد من الأطوال الموجية والكشف عنها دون تعديل النظام. هذا هو المفيد ل dالعاصفة ، كما يمكن استخدام أطوال موجية منخفضه لتعزيز الوميض فلوكوفيري والتصوير متعدد ألوان. ومن الجدير بالذكر ان عمق تغلغل حقل التخدير سيتغير كداله طول الموجه ، علي الرغم من انه لا يؤثر علي كيفيه تنفيذ اجراء التصوير. رقاقه متوافق مع التصوير الخلية الحية8 ومثاليه للتطبيقات مثل دمج ميكروفلويديكس. كل رقاقه يمكن ان تحتوي علي عشرات من الموجات الموجية ، والتي يمكن ان تسمح للمستخدم للصورة تحت ظروف مختلفه أو تطبيق تراكب البصرية9 ورامان الطيفي10.
يعمل النظام القائم علي الرقاقات بشكل جيد علي حد سواء للتصوير المحدود والفائق الدقة. وادخل نهج مماثل في 2005 باستخدام المنشور لتوليد الاثاره الميدانية evتخدير4. الرقاقة الضوئية يثير أيضا من خلال حقل evتخدير ، ولكن مع تقنيات التوجيه الموجي الحديثة ، يمكن للمرء ان يولد أنماط الضوء الغريبة مع الموجات الموجية. يقتصر التطبيق الحالي لتنظير النانو القائم علي الرقاقة علي التصوير ثنائي الابعاد فقط ، حيث يتم تامين حقل الاثاره داخل سطح الموجه الموجية. وسوف تهدف التنمية في المستقبل للتطبيقات 3D. بالاضافه إلى ذلك ، يتم تطوير تقنيات الدقة الفائقة الأخرى مثل المجهر الضوئي المنظم باستخدام نفس المنظار القائم علي الرقاقة11.
Protocol
1-اعداد طبقه بوليميثيلسيلاوكسين (PDMS)
- اعداد مزيج 10:1 من Sylgard 184 مونومر وعامل العلاج.
- وضع الخليط في غرفه فراغ حتى تختفي فقاعات الهواء.
- صب 1.7 غرام من خليط PDMS في وسط 3.5 بوصه (قطر) طبق بيتري.
- ضع طبق بيتري علي ظرف الفراغ من المغطي بالدوار.
- تدور معطف الطبق بيتري ل 20 ق في 900 لفه في الدقيقة ، مع تسارع 75 rpm/ثانيه.
- علاج الطبق علي اللوحة الساخنة في 50 درجه مئوية لمده لا تقل عن 2 ساعة.
2. اعداد العينة
-
تنظيف الموجه الموجي
- اعداد 100 مل من 1 ٪ من التخفيف من المنظفات التنظيف التركيز (جدول المواد) في الماء منزوع الأيونات (DI).
- وضع رقاقه في صحن بيتري الزجاج باستخدام ملقط ويفر وتغطي تماما مع محلول المنظفات.
- ضع طبق بيتري علي صفيحه ساخنه عند 70 درجه مئوية لمده 10 دقائق.
- في حين لا يزال علي لوحه الساخنة ، فرك السطح مع مسحه الانسجه غرفه الأبحاث.
- أزاله رقاقه من طبق بيتري. شطف مع ما لا يقل عن 100 مل من الماء DI.
- شطف مع ما لا يقل عن 100 مل من الايزوبروبانول ، مع الحرص علي ان المذيبات لا تجف علي السطح لمنع البقع التبخر.
- شطف مع ما لا يقل عن 100 مل من الماء DI. ضربه الرقاقة الجافة مع بندقية النيتروجين.
-
اعداد الغرفة
- اعداد طبقه من 150 μm polydiميثيل siloxane (PDMS) في طبق بيتري (القسم 1).
- استخدم مشرط لقطع اطار 1.5 سم × 1.5 سم من طبقه PDMS.
- رفع الإطار من طبق بيتري مع ملقط. أودعها علي رقاقه نظيفه ومصقوله. العينة جاهزه الآن لبذر الخلايا.
-
وضع العلامات الفلورسنت
- اعداد المواد الكيميائية التالية: الفوسفات-محلول المالحة مخزنه ، محلول صبغ (ق) ، dالعاصفة التصوير العازلة.
- بعد بذر الخلايا ، قم بازاله الرقاقة من الوسائط.
- استخدم الماصة لأزاله اي سوائل زائده من خارج غرفه PDMS.
- أزاله السائل الحالي من داخل غرفه PDMS مع ماصه مع أضافه ما يقرب من 60 μL من برامج تلفزيونيه نظيفه في نفس الوقت.
ملاحظه: سيتعين تغيير المبلغ المضاف إلى الغرفة وفقا لحجم الغرفة. يجب الحرص علي عدم أزاله جميع وسائل الاعلام من سطح الخلية. - استبدال التلفزيوني مع 60 μL من برامج تلفزيونيه نظيفه والسماح لها احتضان لمده 1 دقيقه.
- كرر الخطوة السابقة ، والسماح لها احتضان لمده 5 دقائق هذه المرة.
- أزاله التلفزيونية واستبدالها مع 60 μL من محلول صبغ. ترك العينة لاحتضان لحوالي 15 دقيقه ، التدريع من الضوء.
ملاحظه: قد تضطر هذه الخطوة إلى تغيير بشكل ملحوظ ، اعتمادا علي صبغه الفلورسنت المستخدمة. نحن نستخدم CellMask الأحمر العميق لتسميه غشاء الخلية لهذه التجربة - غسل العينة مع تلفزيوني كما في الخطوات 2.3.3-2.3.5.
- أزاله التلفزيونية واستبدالها مع 40 μL من المخزن المؤقت للتصوير في نفس الوقت.
ملاحظه: هناك العديد من المخازن المؤقتة التصوير مختلفه لمختلف الاصباغ الفلورية. - وضع المشبك علي القمه ، ومنع فقاعات الهواء من تشكيل تحت. اضغط برفق علي المشبك المختلط ضد غرفه التصوير لأزاله اي وسائط زائده.
- استخدام ماصه لأزاله اي وسائل الاعلام الزائدة خارج coverslip. تنظيف المنطقة خارج كوفيرسليب مع مسحه رطبه المياه لتجنب بلورات شكلتها بقايا وسائل الاعلام الغمر المجفف.
3-إجراءات التصوير
- اعداد المكون
ملاحظه: يتكون هذا الإصدار من الاعداد من ثلاثه مكونات رئيسيه: المجهر ، مرحله الاقتران ، ومرحله العينة. انظر جدول المواد.- استخدام المجهر مع حامل مرشح ، مصدر الضوء الأبيض ، والكاميرا ، ومسدس الهدف.
- استخدام 3-محور بيزو اقتران المرحلة مع ألياف المقترنة بالليزر وعدسه اقتران.
- استخدم مرحله واحده من العينة اليدوية مع الطرف والميل وحامل الفراغ.
- تركيب كل من الاقتران ومرحله العينة علي مرحله الميكانيكية 2 محور للترجمة العينة.
- الموجه الموجي اقتران
- وضع رقاقه علي الفراغ تشاك مع الوجه اقتران نحو الهدف اقتران. تاكد من ان الرقاقة بطول بؤري واحد تقريبا بعيدا عن هدف الاقتران.
- تشغيل مضخة فراغ.
- قم بتشغيل الليزر إلى 1 ميغاواط. ضبط تقريبا ارتفاع رقاقه بحيث شعاع يضرب حافه ذلك. أطفئ الليزر
- قم بتشغيل مصدر الضوء الأبيض. اختر عدسه هدف منخفضه التكبير (مثل 10x). تركيز المجهر علي الموجه الموجي.
- ترجمه المجهر علي طول الدليل الموجي لمعرفه ما إذا كان محاذاة جيدا مع المسار البصري. نقل المجهر إلى حافه اقتران.
- تشغيل الليزر في 1 ميغاواط أو اقل. ترجمه المجهر علي طول حافه اقتران للعثور علي ضوء الليزر. التركيز شعاع علي حافه رقاقه.
- اضبط مرحله الاقتران علي المسار البصري في الاتجاه الذي يقلل من حجم بقعه شعاع الليزر حتى يختفي. الشعاع هو الآن اما فوق أو تحت سطح رقاقه.
- ضبط ارتفاع مرحله اقتران حتى يظهر بقعه شعاع ويتم تكبير.
- كرر الخطوتين السابقتين حتى يشكل الليزر بقعه مركزه.
- انقل النقطة المركزة إلى الدليل الموجي للفائدة.
- ترجمه المجهر علي مسافة قصيرة بعيدا عن الحافة بحيث التركيز شعاع البقعة لم يعد مرئيا. أطفئ الضوء الأبيض
- اضبط التباين. وإذا كان الدليل الموجي موجها ، فان الضوء المتناثر علي طول الموجه الموجية ينبغي ان يكون مرئيا بوضوح.
- اضبط محاور مرحله الاقتران لتعظيم كثافة الضوء المتناثرة. أطفئ الليزر
- قم بتشغيل الضوء الأبيض. اضبط التباين إذا لزم الأمر.
- انتقل إلى منطقه التصوير.
- التصوير المحدود للانعراج
- التركيز مع هدف التصوير المطلوب. أطفئ الضوء الأبيض
- ادراج فلتر مضان وتحويل قوه الليزر إلى 1 ميغاواط.
- اضبط وقت تعريض الكاميرا لحوالي 100 مللي ثانيه. اضبط التباين حسب الحاجة. تاكد من ان الاقتران لا يزال محسنا.
- حدد موقع منطقه الاهتمام للتصوير. بدوره علي المرحلة بيزو حلقات لمتوسط أوضاع الخروج.
ملاحظه: 20 ميكرومتر نطاق المسح الضوئي مع حجم الخطوة من 50 nm هو مناسبه لمعظم هياكل الموجه الموجي. - التقاط ما لا يقل عن 300 الصور.
- تحميل مكدس الصور الملتقطة إلى فيجي باستخدام مكدس ظاهري. من قائمه الصور في فيجي ، اختر مكدسات و z-المشروع.
- حساب صوره TIRF عن طريق اختيار نوع الإسقاط كثافة متوسط.
- د التصوير العاصفة
- قم بتشغيل الليزر إلى 1 ميغاواط واضبط وقت تعريض الكاميرا إلى 30 مللي ثانيه.
- اضبط التباين والتركيز.
- زيادة طاقة الليزر حتى يتم ملاحظه الوميض.
ملاحظه: قد يستغرق هذا بعض الوقت ، اعتمادا علي كثافة الحقل الذي يتم التخدير. - تكبير منطقه صغيره من العينة.
- اضبط التباين.
- التقط بعض الصور لمعرفه ما إذا كانت الوميض مفصوله جيدا.
- اضبط وقت تعريض الكاميرا للوميض الأمثل.
ملاحظه: تحسين الوميض مهمة معقده ، ولكن الكثير من الأدب المناسب متاح12. - بدوره علي المرحلة بيزو حلقات.
- تسجيل كومه صوره من الإطارات 30,000 علي الأقل ، اعتمادا علي كثافة وامض.
- د أعاده بناء صوره العاصفة
- فتح فيجي وتحميل المكدس dالعاصفة كما الصور الظاهرية.
- اضبط التباين ، إذا لزم الأمر.
- استخدم أداه المستطيل لتحديد المنطقة التي سيتم أعاده بنائها.
- فتح تحليل تشغيل في العواصف الرعدية13 المساعد في فيجي.
- تعيين إعدادات الكاميرا الاساسيه في العواصف الرعدية المقابلة للجهاز. وعاده ما تكون المعلمات الافتراضية المتبقية مرضيه.
- بدء أعاده الاعمار.
ملاحظه: بالنسبة للحقل الكامل لطريقه العرض ، قد تحتاج البيانات إلى تقسيمها في المكدسات الفرعية ، بسبب حجم الملف الكبير. - تصفيه قائمه التعريب التي يوفرها برنامج أعاده الإنشاء لأزاله تعريب غير محدد. تفاحه اضافيه الانحراف التصحيح إذا لزم الأمر.
Representative Results
TIRF المجهر هو تقنيه شعبيه لأنه يزيل الفلورية خارج الطائرة ، ويزيد من التباين ، التالي يحسن جوده الصورة ، واقل الضوئية مقارنه مع غيرها من التقنيات المجهرية التي تستند إلى المجهر. بالمقارنة مع النهج القائم علي الأهداف التقليدية ، يقدم المجهر القائم علي الرقاقة الاثاره TIRF دون الانتاجيه المحدودة التي عاده ما تكون مصحوبة بعدسه TIRF. ويمكن الاطلاع علي لمحه عامه عن الاعداد المعروض في الشكل 1ا. نحن نقدم الانكسار المحدودة ، فضلا عن dالعاصفة الصور من الخلايا البطانية الكبدية الجيب (lsec) المستخرجة من الفئران. كما يتم عرض حقل كبير من صوره الرؤية للاشعه الجافة مع الأنابيب المجهرية المسمية ، مما يدل علي قدرات التصوير عالي الانتاجيه. A التقليدية dالعاصفة الاعداد باستخدام الغمر النفط عدسه tirf (اما 60x أو 100x التكبير) عاده الصور مساحة 50 μm x 50 μm ، وهو 100 مرات أصغر من الصورة القائمة علي رقاقه في الشكل 2، الذين يعانون من 25X ، 0.8 NA الهدف.
في هذه الطريقة ، ونحن نستخدم متعددة معضد Si3N4 الموجات الموجية لأثاره. رقائق المستخدمة تتكون من طبقه التوجيهية الشريط محفورا من 150 nm Si3N4 المودعة علي طبقه مؤكسده 2 μm من رقاقه السيليكون. ويمكن الاطلاع علي التخطيطي من رقاقه في الشكل 1ب. يمكن ان تختلف اعراض الموجه الموجي بين 200 و 1000 μm. ويمكن الاطلاع علي تفاصيل التصنيع في مكان آخر8. ومن خلال التداخل بين وسائط التكاثر ، لن يكون لضوء الاثاره توزيع متجانس للكثافة ، بل نمط مختلف مكانيا. الشكل 2ا يقدم صوره مع أنماط الوضع مرئية بوضوح. سيتغير نمط التداخل هذا مع وضع شعاع الليزر علي حافه الموجه الموجي. من أجل تحقيق الاثاره متجانسة في الصور النهائية ، ونحن نستخدم مرحله بيزو لتتارجح علي طول الوجه المقترن. علي مدي الاجراء التصوير ، يوجد اختلاف كاف من أنماط التداخل بحيث يمكن ان تكون متوسطه ، وأزاله تقلبات الكثافة في الصورة. وسوف تتكون المكدس صوره من عده صور مثل في الشكل 2ا، علي الرغم من ان مع أنماط مختلفه ، ولكن عندما متوسط ، والمكدس سوف تسفر عن صوره مع الاثاره متجانسة مثل الشكل 2ب. والنهج البديل هو استخدام مستدق الشكل لتحقيق الموجات الموجية معضد العريضة الواحدة8،14، التي تزيل ضرورة الوضع المتوسط. ومع ذلك ، عده ملليمترات من طول مستدق ضرورية للحفاظ علي حاله وضع واحد لتحقيق عرض الموجه الموجي 100 μm. الموجات الموجية متعددة المعضد التفاف علي هذه الضرورة مستدق وترك اي قيود علي عرض الهيكل. ما وراء نمط الاضاءه ، ومؤشر الانكسار فعاله للغاية من وسائط تسمح لإمكانيات غير مسبوقة نحو المجهر الاضاءه المهيكلة11 والتذبذب طرق المجهر7.
الخطوة الاولي في التصوير هي جمع صوره الانكسار المحدودة. نتائج التجربة في كومه من حوالي 300 الصور ويتم اجراء الصورة النهائية عن طريق أخذ متوسط المكدس. في الشكل 2، نقدم الانكسار المحدودة والتصوير dالعاصفة من lsecs الموسومة مع Cellmask الأحمر العميق باستخدام 60X ، 1.2 NA الغمر المياه الهدف. يظهر الشكل 2A الاضاءه غير متجانسة بسبب عدم كفاية متوسط الوضع. يتم عرض متوسط الوضع الناجح في الشكل 2B. الشكل 2ج هو صوره عاصفه dمن نفس المنطقة ، مع المنطقة المميزة المبينة في الشكل 2د. الكبد الخلايا البطانية الجيب لديها المسام نانو الحجم في غشاء البلازما15، والتي يمكن ان ينظر اليها هنا. وقدم تحليل الترابط الدائري Fourier قرار 46 نانومتر.
ويقدم الشكل 3 صوره عاصفه dمن 500 μm x 500 μm المنطقة ، مما يدل علي قدرات إنتاجيه عاليه من هذه التقنية. يتم عرض صوره مكبره من الشكل 3ا، المطابق لحقل العاصفة dالنموذجي ، مع صوره الانكسار المحدودة في الشكل 3ب. تم اجراء ارتباط الحلقة Fourier لتقدير القرار ، مما أسفر عن قيمه 76 نانومتر.
الشكل 1: نظام التصوير والدليل الموجي. (ا) صوره لنظام التصوير. يتم وضع العينة علي ظرف فراغ في مرحله العينة ، مع الجانب اقتران من الموجه الموجي نحو هدف اقتران. يتم وضع ألياف بالليزر واقتران الهدف علي راس المرحلة بيزو 3D. يلتقط برج العدسة المزود بعدسات تصوير الصورة من اعلي وينقلها إلى الكاميرا. (ب) التخطيطي للدليل الموجي مع اقتران والعدسات التصويرية. الأزواج عدسه اقتران ضوء في الموجه الموجي. يتم الاحتفاظ بالعينات (الخرز البرتقالي) داخل غرفه PDMS مختومه. فان حقل التخدير علي طول الموجه الموجي تثير العينة والهدف التصوير سوف التقاط الفلورية المنبعثة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الصور العاصفة المحدودة والدالة. (ا) صوره خلايا الكبد الغشائية الحلقية ذات الوضع غير الكافي في المتوسط ، مما يؤدي إلى ظهور نمط أثاره واضح. (ب) نفس المنطقة التي في (ا) ، ولكن مع متوسط الوضع الكافي ، مما يؤدي إلى أثاره متجانسة. (ج) الصورة المحدودة للانعراج للإطار الداخلي في (ب) ؛ (د) صورهالعاصفة من المنطقة نفسها. (ه) الملحق الداخلي (د) ، الذي يظهر بوضوح الحصص الغذائية في غشاء البلازما في الخلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: dصوره عاصفه من الفئران lsecs. (ا) مجال كبير من رؤية dالعاصفة صوره من اليكسا 647 الملونة الأنابيب في الفئران lsecs. شريط مقياس = 50 μm. (ب) منطقه ملحوظة أكبر من (ا) مقارنه الانكسار-المحدودة (أسفل اليسار) والصورة dالعاصفة (اعلي اليمين). (ج) المنطقة الصغيرة الموسومة من (ا). شريط مقياس = 1 μm. الصورة لديها دقه 76 نانومتر. تكييفها مع اذن من هيلي et al. 20196. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Discussion
يشبه التصوير القائم علي الرقاقة التصوير التقليدي لعاصفه d. التالي يمكن قياس جوده الصورة باستخدام نفس النهج المتبعة في التصوير التقليدي لعاصفه d. الفرق الرئيسي للمستخدم هو ان يتم تبادل الشريحة الزجاجية الشفافة مع Si-رقاقه مبهمه. علي الرغم من انها تظهر مختلفه جدا ، معالجه العينة مشابه عمليا إلى شريحة زجاجيه. رقائق قويه جدا ويمكن بسهوله التعامل معها باستخدام ملاقط رقاقه. اجراء التصوير وأعاده بناء الصورة هو نفسه كما هو الحال في تجربه العاصفة dالعادية. اعداد المجهر القائم علي رقاقه وظيفية لا يتطلب مكونات خاصه ، باستثناء رقائق الضوئية. ويمكن الاطلاع علي مزيد من التفاصيل عن الاعداد في العمل السابق6و7. وقد تم ملفقه رقائق المستخدمة في هذا العمل باستخدام التصوير الضوئي القياسية8.
اعداد العينة يشمل اعداد غرفه العينة. عند إرفاق الإطار PDMS إلى رقاقه ، فمن المهم لتجنب اي طيات صغيره أو تمزقات حيث قد يدخل الهواء. إذا طيات PDMS عند إرفاقه ، ببساطه ازالته بعناية مع ملقط وأعاده توصيله. عندما تكون العينة جاهزه داخل غرفه PDMS ، يجب الضغط علي زجاج الغلاف ضدها ، وختم المنطقة. من المهم لتجنب اي فقاعات الهواء التي قد تشكل عند إرفاق غطاء زجاجي. إذا تم تشكيل فقاعه الهواء ، وأزاله برفق زجاج الغطاء وأضافه تلفزيوني إلى غرفه عينه للتاكد من ان يتم تغطيه العينة. ويمكن بعد ذلك ببساطه أعاده اعداد وإرفاق زلة الغطاء.
يتم تبسيط اقتران الضوء في دليل الموجي باستخدام البروتوكول المقترح في هذه الورقة. ومع ذلك ، هناك بعض التحديات المشتركة التي يمكن ان تحد من الاقتران. أولا ، إذا لم يتم تنظيف رقاقه بشكل صحيح وأي بقايا تلفزيوني ازالتها تماما ، قد يكون هناك الأوساخ أو تبلور تلفزيوني علي الدليل الموجي. وهذا يمكن ان يدخل خسائر كبيره ، مما ادي إلى القليل جدا من السلطة في منطقه التصوير. يمكن استخدام مسحه رطبه لتنظيف المنطقة خارج الغطاء الزجاجي تحسين الطاقة بشكل كبير. ثانيا ، إذا كان الجانب اقتران من الدليل الموجي معطوب (علي سبيل المثال ، عن طريق المناولة غير السليمة) ، فان فقدان اقتران يمكن ان تزيد بشكل كبير. التفتيش البصري للحافه وعاده ما تكشف عن اي اضرار بسهوله. ويمكن مصقول وجه اقتران كامل من رقاقه بعناية ، مثل الكثير من ألياف البصرية ، وسوف تعطي وجها السلس اقتران ، والتي ثم يزيد من السلطة إلى جانب.
بعد ان يقترن الضوء ، واجراء التصوير هو نفسه كما هو الحال في اي الاعداد العاصفة dالتقليدية. إذا كانت الصورة غير متجانسة الاثاره ، كما هو موضح في الشكل 2ا، ثم علي الأرجح وضع المتوسط لا يعمل بشكل جيد. والسببان الأكثر شيوعا لذلك هما: 1) عدد قليل جدا من الصور الملتقطة من أجل إنشاء مكدس متوسط و 2) قصيرة جدا من مسافة التذبذب/كبيره جدا من حجم الخطوة. جمع عدد قليل جدا من الصور يمكن ان تترك بعض أنماط الاثاره التالي فان المتوسط يكون غير متجانس. يمكن حل هذا بسهوله عن طريق زيادة عدد الصور في متوسط المكدس. قصيرة جدا من مسافة التذبذب يمكن ان يؤدي أيضا إلى صوره غير متجانسة ، كما لا توجد أنماط وضع كافيه متحمس. ويمكن أيضا حل هذه المشكلة بسهوله عن طريق زيادة مسافة التذبذب و/أو تقليل حجم الخطوة. في هذا العمل استخدمنا مرحله بيزو لمسح شعاع الليزر الإدخال أكثر من 20 μm والحصول علي ما لا يقل عن 300 الصور. يمكن ان يكون نهج آخر لاستخدام عاليه السرعة galvo-المرايا لمسح الضوء عبر الوجه الموجي دليل المدخلات في وقت واحد اكتساب ، مثل 10-30 ms. هذا الخيار هو مناسبه للتصوير TIRF الخلية الحية ، حيث العضوية الفرعية الخلوية في الحركة المستمرة.
رقاقه القائم dالعاصفة يقدم منطقه كبيره غير مسبوقة tirf الاثاره ، مما يجعلها مناسبه بشكل مثالي للتصوير عاليه الانتاجيه. يسمح الحرف المدمج بالتعديل التحديثي للانظمه التجارية ، حيث يمكن وضع الرقاقة راسا علي عقب للاجهزه المقلوبة أو يمكن تطوير ركائز شفافة. رقائق هي كتله ملفقه ويمكن تعديلها لتناسب العديد من الاحتياجات. حاليا ، القيد الرئيسي هو انه يقتصر علي 2D. لا يتوفر حقل التخدير الا تقريبا 200 نانومتر بعيدا عن سطح الموجه الموجي ، التالي فان الفلوروبيورس فقط داخل هذه المنطقة سيكون متحمسا. الإجمال ، فان مجال البصريات المتكاملة يوفر العديد من الفرص للحصول علي المجهر القائم علي الرقاقات في المستقبل القريب ، من خلال معالجه اسئله التصوير الجديدة ، فضلا عن توفير إمكانيات جديده لتلك الموجودة.
Disclosures
وقد طبقت البكالوريوس Ahluwalia لبراءة الاختراع 1606268.9 GB لتنظير النانو البصرية القائمة علي رقاقه. ويعلن المؤلفون الآخرون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
ويود أصحاب البلاغ ان ينووا بالمجلس الأوروبي للبحوث (المنحة رقم 336716 إلى B.S.A.). ويود أصحاب البلاغ أيضا ان يشكروا ايراتي لاغفرااغوا علي مساعدتها القيمة في تسجيل الفيديو وتحريره.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-axis sample stage | Standa | 7T173-20 | |
| 2-axis sample translation stage | Mad City Labs | Custom order | |
| 3-axis NanoMax stage | Thorlabs | MAX311D | |
| BXFM microscope body | Olympus | OLY-LSM-037018 | |
| CellMask Deep Red, Life technologies | ThermoFisher | C10046 | |
| Cleanroom grade swabs | MRC Technology | MFS-758 | |
| Fiber-coupled laser | Cobolt | Flamenco | |
| Filter Holder | Homemade | ||
| Hellmanex III, Hellma Gmbh | Sigma-Aldrich | Z805939 | Cleaning detergent concentrate |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 563935-1L | |
| KL 1600 LED | Olympus | OLY-LSM-E0433314 | |
| Olympus Coupling lens | Olympus | LMPLFLN 50x/0.5 | |
| Orca Flash 4.0 V2 | Hamamatsu | ||
| PBS tablets | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | Mix according to descriptions |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer 1.1 kg kit | Dow | 1673921 | |
| Tip-tilt stage | Thorlabs | APR001 | |
| Vacuum holder | Thorlabs | HWV001 | |
| Wafer Tweezers Type 2W | Agar scientific | AGT5051 |
References
- Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nature Methods. 5 (6), 527-529 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines. Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).
- Wazawa, T., Ueda, M. Total internal reflection fluorescence microscopy in single molecule nanobioscience. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 77-106 (2005).
- Jalali, B., Fathpour, S. Silicon photonics. Journal of Lightwave Technology. 24 (12), 4600-4615 (2006).
- Helle, ØI., Coucheron, D. A., Tinguely, J. C., Øie, C. I., Ahluwalia, B. S. Nanoscopy on-a-chip: super-resolution imaging on the millimeter scale. Optics Express. 27 (5), 6700-6710 (2019).
- Diekmann, R., et al. Chip-based wide field-of-view nanoscopy. Nature Photonics. 11 (5), 322-328 (2017).
- Tinguely, J. C., Helle, ØI., Ahluwalia, B. S. Silicon nitride waveguide platform for fluorescence microscopy of living cells. Optics Express. 25 (22), 27678-27690 (2017).
- Ahluwalia, B. S., McCourt, P., Huser, T., Hellesø, O. G. Optical trapping and propulsion of red blood cells on waveguide surfaces. Optics Express. 18 (20), 21053-21061 (2010).
- Coucheron, D. A., Wadduwage, D. N., Murugan, G. S., So, P. T. C., Ahluwalia, B. S. Chip-Based Resonance Raman Spectroscopy Using Tantalum Pentoxide Waveguides. IEEE Photonics Technology Letters. 31 (14), 1127-1130 (2019).
- Helle, ØI., Dullo, F. T., Lahrberg, M., Tinguely, J. C., Ahluwalia, B. S. Structured illumination microscopy using a photonic chip. ArXiV. , https://arxiv.org/abs/1903.05512v1 (2019).
- Metcalf, D. J., Edwards, R., Kumarswami, N., Knight, A. E. Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
- Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Archetti, A., Glushkov, E., Sieben, C., Stroganov, A., Radenovic, A., Manley, S. Waveguide-PAINT offers an open platform for large field-of-view super-resolution imaging. Nature Communications. 10, (2019).
- Braet, F., Wisse, E. Structural and functional aspects of liver sinusoidal endothelial cell fenestrae: a review. Comparative Hepatology. 1, 1 (2002).
