Høj gennemløb total intern refleksion fluorescens og direkte stokastiske optisk genopbygning mikroskopi ved hjælp af en fotonisk chip

Summary

Chip-baseret super opløsning Optisk mikroskopi er en ny tilgang til fluorescens mikroskopi og giver fordele i omkostningseffektivitet og gennemløb. Her vises protokollerne for spån klargøring og billeddannelse for TIRF-mikroskopi og lokaliserings baseret super opløsnings mikroskopi.

Abstract

Total intern refleksion fluorescens (TIRF) er almindeligt anvendt i enkelt molekyle lokalisering baseret super-resolution mikroskopi, da det giver øget kontrast på grund af optisk skæring. Den konventionelle tilgang er at bruge høje numeriske blænde mikroskop TIRF mål for både excitation og indsamling, alvorligt begrænse synsfelt og gennemløb. Vi præsenterer en roman tilgang til at generere TIRF excitation til billeddannelse med optiske bølgeledere, kaldet chip-baserede nanoskopi. Formålet med denne protokol er at demonstrere, hvordan chip baseret billeddannelse udføres i en allerede opbygget opsætning. Den største fordel ved chip-baserede nanoskopi er, at excitation og indsamling veje er afkoblet. Imaging kan derefter gøres med en lav forstørrelse linse, hvilket resulterer i store synsfelt TIRF billeder, på prisen for en lille reduktion i opløsning. Leveren sinusformet endotelceller (lsecs) blev afbildet ved hjælp af direkte stokastiske optisk genopbygning mikroskopi (dStorm), viser en opløsning svarende til traditionelle super-resolution mikroskoper. Derudover demonstrerer vi funktionerne med høj kapacitet ved at afbilde en 500 μm x 500 μm-region med en lav forstørrelses linse, der giver en opløsning på 76 nm. Gennem sin kompakte karakter kan chip-baseret billeddannelse eftermonteres i de fleste almindelige mikroskoper og kan kombineres med andre on-chip optiske teknikker, såsom on-chip sensing, spektroskopi, optisk fældefangst, etc. Teknikken er således ideel til high gennemløb 2D super-resolution Imaging, men giver også store muligheder for multimodal analyse.

Introduction

Siden den indledende demonstration af enkelt molekyle lokalisering mikroskopi, mange variationer er blevet udviklet til at løse forskellige udfordringer^1,2,3. En udfordring, der er forblevet, er dog stort synsfelt dSTORM Imaging. Mange dstorm opsætninger bruger den samme objektiv linse til både at begejstre prøven og billedet. For at øge synsfeltet er der behov for en lav forstørrelse linse. Lav forstørrelse og lav numerisk blænde (NA) objektiv linser har typisk en stor dybde af felt, hvilket resulterer i et øget out-of-plane signal, der vil reducere lokaliserings præcision. TIRF mål er almindeligt anvendt til at øge billedets kontrast ved at reducere off-of-plane fluorescens. Gennem tirf er excitation begrænset til en optisk tykkelse på ca. 150 nm fra overfladen ved hjælp af en passive felt⁴. TIRF objektiv linser kræver en stor NA resulterer i en lille synsfelt (FOV) (f. eks 50 x 50 μm²), som begrænser gennemstrømningen betydeligt. Der er dog alternative måder at generere et passive felt.

En optisk bølge guide er en struktur, der vil begrænse og vejlede lys, hvis det er koblet ind i strukturen. Mest almindeligt, bølgeledere anvendes i fiber-baserede telekommunikation. Der er gjort en stor indsats for at udvikle 2D integrerede bølge føringer som en hovedbestanddel af fotoniske integrerede kredsløb. Teknologien har udviklet sig til et punkt, hvor opdigte lavt tab Nano-strukturerede optiske bølgeledere kan rutinemæssigt udføres⁵. I dag kan flere støberier rundt om i verden bruges til at udvikle fotoniske integrerede kredsløb. Waveguides guide lys gennem total intern reflektans også udstiller en passive felt på overfladen. Ved omhyggelig udformning af bølge guide struktur, en høj intensitet kan opnås i det evanescerende felt. En prøve placeret direkte på toppen af bølge vejledningens overflade kan således også belyses af det evanescerende felt til billedbehandlings applikationer. Det passive felt vil blive genereret langs hele længden og bredden af bølge guiden, og dermed kan det gøres vilkårligt store⁶.

Vi præsenterer en roman tilgang til TIRF dstorm, der tilbyder et vilkårligt stort synsfelt. I stedet for at bruge en tirf-linse til både excitation og indsamling, begejstre vi ved hjælp af det passive felt fra optiske bølgeledere. Dette afdækker den excitation og indsamling lys pathway, giver mulighed for total frihed langs samlingen lys sti uden at kompromittere den optiske skæring for en given bølgelængde, der leveres af Waveguide chip belysning. Lav forstørrelse linser kan således bruges til at afbilde meget store regioner i TIRF-tilstand, selv om en mindre NA vil reducere den laterale opløsning. Desuden er flerfarvet billeddannelse også meget forenklet ved hjælp af bølgeledere⁷, da flere bølgelængder kan styres og detekteres uden at justere systemet. Dette er fordelagtigt for dstorm, som lave bølgelængder kan bruges til at forbedre fluoroforet blinkende og for flerfarvet billeddannelse. Det er værd at bemærke, at indtrængnings dybden af det passive felt vil ændre sig som en funktion af bølgelængde, selv om det ikke påvirker, hvordan billedbehandlings proceduren udføres. Chippen er kompatibel med Live Cell Imaging⁸ og er ideel til applikationer såsom integration af microfluidics. Hver chip kan indeholde snesevis af bølge føringer, som kan give brugeren mulighed for at billede under forskellige forhold eller anvende optisk diffusering⁹ og Raman spektroskopi¹⁰.

Chip-baserede system fungerer lige godt for både diffraktion-begrænset og super-resolution Imaging. En lignende tilgang blev introduceret i 2005 ved hjælp af en prisme til at generere passive felt excitation⁴. Den fotoniske chip begejstrer også gennem det passive felt, men med moderne bølge guide fabrikation teknikker, kan man generere eksotiske lys mønstre med bølgeledere. Den nuværende chip-baserede nanoskopi-implementering er begrænset til 2D-billeddannelse, da excitation-feltet er låst inde i bølge vejledningens overflade. Fremtidig udvikling vil sigte mod 3D-applikationer. Desuden er andre super-resolution teknikker såsom struktureret belysning mikroskopi udvikles ved hjælp af samme chip-baserede mikroskop¹¹.

Protocol

1. fremstilling af Polydimethylsiloxan-laget (PDMS)

1. Forbered en 10:1 blanding af Sylgard 184 monomer og Hærdningsmiddel.
2. Placer blandingen i et vakuumkammer, indtil luftbobler er væk.
3. Hæld 1,7 g PDMS blanding i midten af en 3,5 tommer (diameter) Petri skål.
4. Placer Petri skålen på vakuum patronen på et spin-Coater.
5. Spin coat Petri skålen for 20 s ved 900 rpm, med en acceleration på 75 rpm/s.
6. Ret skålen på en kogezone ved 50 °C i mindst 2 timer.

2. forberedelse af prøver

1. Waveguide rengøring
   1. Forbered 100 mL af en 1% fortynding af rengøringsmiddel koncentrat (tabel over materialer) i deioniseret (di) vand.
   2. Anbring chippen i en glaspetri skål ved hjælp af en wafer-pincet, og dæk den helt med Vaskeopløsningen.
   3. Petri skålen placeres på en kogeplade ved 70 °C i 10 minutter.
   4. Mens du stadig er på kogepladen, gnid overfladen med et renrum vævs serviet.
   5. Fjern chippen fra Petri skålen. Skyl med mindst 100 mL DI vand.
   6. Skyl med mindst 100 mL isopropanol, og pas på, at opløsningsmidlet ikke tørrer på overfladen for at forhindre fordampning af pletter.
   7. Skyl med mindst 100 mL DI vand. Blæse chippen tørt med en nitrogen pistol.
2. Forberedelse af kammeret
   1. Der forberedes et lag af 150 μm Polydimethylsiloxan (PDMS) i en Petri skål (afsnit 1).
   2. Brug en skalpel til at klippe en 1,5 cm x 1,5 cm ramme fra PDMS-laget.
   3. Løft stellet fra Petri skålen med en TWEEZER. Deponere det fladt på en ren og poleret chip. Prøven er nu klar til celle såning.
3. Fluorescerende mærkning
   1. Forbered følgende kemikalier: fosfat-bufferet saltvandsopløsning, farveopløsning (er), dstorm Imaging buffer.
   2. Efter celle såning, fjerne chippen fra medierne.
   3. Brug en pipette til at fjerne eventuel overskydende væske fra uden for PDMS-kammeret.
   4. Fjern den aktuelle væske inde fra PDMS-kammeret med en pipette, samtidig med at der tilføjes ca. 60 μL ren PBS på samme tid.
      Bemærk: det beløb, der tilføjes til kammeret, skal ændres i henhold til kammerets størrelse. Vær omhyggelig med ikke at fjerne alle medier fra cellens overflade.
   5. Udskift PBS med 60 μL ren PBS og lad det inkubere i 1 min.
   6. Gentag det foregående trin, lade det inkubere i 5 min denne gang.
   7. Fjern PBS og Udskift det med 60 μL af farveopløsningen. Lad prøven til at inkubere i omkring 15 minutter, afskærmning det fra lys.
      Bemærk: dette trin skal muligvis ændres markant afhængigt af det fluorescerende farvestof, der anvendes. Vi bruger CellMask Deep Red til at mærke cellemembranen for dette eksperiment
   8. Prøven vaskes med PBS som i trin 2.3.3-2.3.5.
   9. Fjern PBS, og Udskift det med 40 μL af billedbehandlings bufferen på samme tid.
      Bemærk: der er flere forskellige billedbehandlings buffere til forskellige fluorescerende farvestoffer.
   10. Anbring en dækseddel på toppen, og undgå, at der dannes luftbobler nedenunder. Tryk forsigtigt dæksedlen mod billed kammeret for at fjerne eventuelle overskydende medier.
   11. Brug en pipette til at fjerne eventuelle overskydende medier uden for dæksedlen. Rengør området uden for dæksedlen med en vand fugtig vatpind for at undgå krystaller dannet af tørrede nedsænknings medie rester.

3. procedure for billedbehandling

1. Opsætning af komponenter
   Bemærk: denne version af opsætningen består af tre hovedkomponenter: mikroskopet, koblings stadiet og prøvestadiet. Se tabellen over materialer.
   1. Brug et mikroskop med filterholder, hvid lyskilde, kamera og objektiv revolver.
   2. Brug en 3-akset piezo koblings fase med en fiber koblet laser og en koblings linse.
   3. Brug en etakset manuel prøve fase med tip og Tilt og en vakuum holder.
   4. Monter både koblingen og prøvestadiet på et 2-akset motoriseret stadie for prøveoversættelse.
2. Bølge guide kobling
   1. Sæt chippen på vakuum patronen med koblings facetten mod koblings målet. Sørg for, at chippen er ca. en brændvidde væk fra koblings målet.
   2. Tænd for vakuumpumpen.
   3. Tænd for laseren til 1 mW. Nogenlunde justere spån højden, så strålen rammer kanten af den. Sluk for laseren.
   4. Tænd for den hvide lyskilde. Vælg objektiv linse med lav forstørrelse (f. eks. 10x). Fokuser mikroskopet på en bølge guide.
   5. Oversæt mikroskopet langs bølge styret for at se, om det er godt afstemt med den optiske kurve. Flyt mikroskop til koblings kanten.
   6. Tænd for laseren på 1 mW eller derunder. Oversæt mikroskop langs koblings kanten for at finde laserlys. Fokusér strålen på spån kanten.
   7. Juster koblings stadiet langs den optiske kurve i den retning, der reducerer Laserstrålens spot størrelse, indtil den forsvinder. Strålen er nu enten over eller under spån overfladen.
   8. Juster koblings trin højden, indtil stråle stedet vises igen og er maksimeret.
   9. Gentag de to foregående trin, indtil laseren danner et fokuseret punkt.
   10. Flyt det fokuserede sted til bølge guide af interesse.
   11. Oversæt mikroskopet en kort afstand væk fra kanten, så den fokuserede stråle plet ikke længere er synlig. Sluk for det hvide lys.
   12. Juster kontrasten. Hvis bølge føringen er vejledende, skal det spredte lys langs bølge føringen være tydeligt synlig.
   13. Juster akserne på koblings stadiet for at maksimere den spredte lysintensitet. Sluk for laseren.
   14. Tænd for det hvide lys. Juster kontrasten, hvis det er nødvendigt.
   15. Naviger til billedområdet.
3. Diffraktion begrænset billeddannelse
   1. Fokus med det ønskede billedbehandlings formål. Drej det hvide lys af.
   2. Indsæt fluorescens filteret, og drej laser kraften til 1 mW.
   3. Indstil kameraets eksponeringstid til ca. 100 ms. Juster kontrasten efter behov. Sørg for, at koblingen stadig er optimeret.
   4. Find et område af interesse for Imaging. Tænd for piezo Stage loop til gennemsnitlige ud modes.
      Bemærk: 20 μm scanningsområde med en trin størrelse på 50 nm er velegnet til de fleste Waveguide-strukturer.
   5. Optag mindst 300 billeder.
   6. Indlæs den optagne billedstak til Fiji ved hjælp af en virtuel stak. Vælg stakke og z-projekti menuen billede i Fiji.
   7. Beregn TIRF-billedet ved at vælge projicerings type gennemsnitlig intensitet.
4. d STORM Imaging
   1. Tænd for laseren til 1 mW, og Indstil kameraets eksponeringstid til 30 MS.
   2. Juster kontrasten og fokus.
   3. Forøg laser strømmen, indtil blinkende er observeret.
      Bemærk: Dette kan tage et stykke tid, afhængigt af passive felt intensitet.
   4. Zoom ind på en lille region af prøven.
   5. Juster kontrasten.
   6. Tag et par billeder for at se, om blinkene er godt adskilte.
   7. Juster kameraets eksponeringstid for optimal blink.
      Bemærk: optimering af blink er en kompleks opgave, men der findes en masse egnet litteratur¹².
   8. Tænd for piezo scenen looping.
   9. Optag en billedstak på mindst 30.000 billeder, afhængigt af den blinkende tæthed.
5. d Genopbygning af STORM billede
   1. Åbn Fiji og indlæse dstorm stak som virtuelle billeder.
   2. Juster kontrasten, hvis det er nødvendigt.
   3. Brug rektangelværktøjet til at vælge det område, du vil rekonstruere.
   4. Åben Run analyse i tordenvejr¹³ plugin i Fiji.
   5. Indstil de grundlæggende kameraindstillinger i tordenvejr svarende til enheden. De resterende standardparametre er normalt tilfredsstillende.
   6. Begynd genopbygningen.
      Bemærk: for det fulde synsfelt skal dataene muligvis opdeles i under stakke på grund af den store filstørrelse.
   7. Filtrer lokaliserings listen, der leveres af genopbygnings softwaren, for at fjerne uspecifikke lokaliseringer. Yderligere drift-korrektion, hvis det er nødvendigt.

Representative Results

TIRF mikroskopi er en populær teknik, da det fjerner ud-af-flyet fluorescens, øger kontrasten og dermed forbedrer billedkvaliteten, og er mindre fototoksisk i forhold til andre fluorescens baseret mikroskopi teknikker. Sammenlignet med den traditionelle objektive-baserede tilgang, chip-baserede mikroskopi tilbyder TIRF excitation uden den begrænsede gennemløb, der er normalt ledsaget af en TIRF linse. En oversigt over den præsenterede opsætning kan findes i figur 1A. Vi præsenterer diffraktion-begrænset samt dstorm billeder af leveren sinusformet endotelceller (lsec) ekstraheret fra mus. Et stort synsfelt billede af LSECs med mærket microtubulin er også præsenteret, demonstrerer mulighederne for høj gennemløb Imaging. En konventionel dstorm setup ved hjælp af en olie Immersion tirf linse (enten 60x eller 100x forstørrelse) typisk billeder et areal på 50 μm x 50 μm, som er 100 gange mindre end det chip-baserede billede i figur 2, afbildet med en 25X, 0,8 na mål.

I denne metode bruger vi multi-moded si₃N₄ bølgeledere til excitation. De udnyttede chips består af en strimmel-ætset styrende lag af 150 nm si₃N₄ deponeret over et 2 μm oxideret lag af en silicium chip. En skematisk af chippen kan findes i figur 1B. Bølge vejledningens bredder kan variere mellem 200 og 1000 μm. fabrikations detaljer kan findes andre steder⁸. Gennem interferens mellem formerings formerne vil excitation-lampen ikke have en homogen intensitets fordeling, men snarere et rumligt varierende mønster. Figur 2A præsenterer et billede med tydeligt synlige mode mønstre. Dette interferensmønster vil ændre sig med positionen af laserstrålen ved kanten af bølge føringen. For at opnå homogen excitation i de endelige billeder, bruger vi en piezo fase til at svinge langs den koblede facet. I løbet af billedbehandlings proceduren findes der nok variation af interferens mønstrene, så de kan gennemsnitligt fjernes, hvilket fjerner intensitets udsving i billedet. Billedet stakken vil bestå af flere billeder som i figur 2A, men med forskellige mønstre, men når gennemsnittet, stakken vil give et billede med homogen excitation som figur 2B. En alternativ tilgang er at bruge adiabatiske tilspidsning at opnå brede, enkelt passé bølgeledere^8,14, som fjerner nødvendigheden af tilstand gennemsnit. Men, flere millimeter af tilspidsning længde er nødvendige for at opretholde single-mode tilstand for at opnå en 100 μm Waveguide bredde. Multi-moded bølge guider omgå denne tilspidsning nødvendighed og efterlader ingen begrænsninger på strukturen bredde. Ud over belysnings mønsteret giver det yderst effektive brydningsindeks af tilstandene mulighed for hidtil usete muligheder for struktureret belysnings mikroskopi¹¹ og udsvings mikroskopi metoder⁷.

Det første trin i Imaging er at indsamle et diffraktion begrænset billede. Eksperimentet resulterer i en stak på omkring 300 billeder, og det endelige billede er lavet ved at tage gennemsnittet af stakken. I figur 2præsenterer vi diffraktion Limited og dstorm Imaging af lsecs mærket med cellmask Deep Red ved hjælp af en 60X, 1,2 na vand nedsænkning mål. Figur 2A viser inhomogen belysning forårsaget af utilstrækkelig tilstands gennemsnit. Den vellykkede tilstands gennemsnit vises i figur 2B. Figur 2C er en dstorm billede af samme region, med den markerede region vist i figur 2d. Leveren sinusformet endotelceller har Nano-sized porer i plasma membranen¹⁵, som kan ses her. En Fourier ring korrelationsanalyse leverede en opløsning på 46 nm.

Figur 3 præsenterer en dSTORM billede af en 500 μm x 500 μm region, der viser de høje gennemløb kapaciteter af teknikken. Et zoomet billede af figur 3a, svarende til en typisk dstorm synsfelt, præsenteres sammen med diffraktion begrænset billede i figur 3B. En Fourier ring korrelation at estimere opløsningen blev udført, hvilket giver en værdi på 76 nm.

Figur 1: billedbehandlingssystem og Waveguide. A) fotografi af billed systemet. Prøven anbringes på en vakuum patron på prøvestadiet med bølge vejledningens koblings facet i retning af koblings målet. En fiber koblet laser og en kobling mål er placeret på toppen af en 3D piezo fase. En linse revolver med Imaging linser fanger billedet ovenfra og relæer det til et kamera. (B) skematisk af bølge føringen med koblings-og billedbehandlings linser. Koblings objektivet par lyser ind i bølge styret. Prøverne (appelsin perler) holdes inde i et forseglet PDMS kammer. Det passive felt langs bølge føringen vil begejstre prøven og billedbehandlings målet vil fange den udsendte fluorescens. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: diffraktion-begrænset og dstorm billeder. (A) billede af leveren sinusformet endotelceller med utilstrækkelig tilstand gennemsnit, hvilket resulterer i et klart synligt excitation mønster. (B) den samme region som i (A), men med tilstrækkelig måde gennemsnit, hvilket resulterer i homogen excitation. C) diffraktions begrænset billede af justerings i litraB) D) dstorm billede af samme region. E) Insæt af (D), der tydeligt viser fenestrationer i cellens plasma membran. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: dstorm billede af rotte LSECs. A) stort synsfelt dSTORM billede af Alexa 647 bejdset Tubulin i rotte lsecs. Scale bar = 50 μm. (B) større markeret region fra (A) sammenligne diffraktion-begrænset (nederst til venstre) og dstorm billede (øverst til højre). C) mindre markant region fra (A). Skala bjælke = 1 μm. Billedet har en opløsning på 76 nm. Tilpasset med tilladelse fra Helle et al. 2019⁶. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Chip-baseret billeddannelse svarer til konventionel dstorm Imaging. Billedkvaliteten kan således måles ved hjælp af de samme tilgange som ved traditionel d-storm dannelse. Den væsentligste forskel for brugeren er, at det gennemsigtige glas glider udveksles med en uigennemsigtig si-wafer. Selv om de forekommer meget forskellige, er prøve håndteringen næsten analog med en glas rutsjebane. Chips er ganske robuste og kan nemt håndteres ved hjælp af wafer pincet. Billedbehandlings proceduren og billed genopbygningen er den samme som i et almindeligt d-storm eksperiment. Opsætning af et funktionelt chip baseret mikroskop kræver ingen særlige komponenter, bortset fra de fotoniske chips. Yderligere oplysninger om set-up kan findes i tidligere arbejde^6,7. De chips, der anvendes i dette arbejde er blevet fremstillet ved hjælp af standard litografiske⁸.

Prøve præparatet omfatter forberedelsen af prøvekammeret. Når du fastgør PDMS frame til chippen, er det afgørende at undgå eventuelle små folder eller Ripper, hvor luften kan komme ind. Hvis pdm'er folder sig ud, når du vedhæfter den, skal du blot fjerne den forsigtigt med en pincet og sætte den i igen. Når prøven er klar inde i PDMS-kammeret, skal dækglasset presses mod det og forsegler regionen. Det er vigtigt at undgå eventuelle luftbobler, der kan dannes ved fastgørelse af dækglasset. Hvis der dannes en luftboble, skal du forsigtigt fjerne dækglasset og tilføje PBS i prøvekammeret for at sikre, at prøven er dækket. Forberedelsen og fastgørelse af dækslet slip kan derefter simpelthen være redone.

Koblings lyset i bølge styret forenkles ved hjælp af den protokol, der foreslås i dette papir. Der er dog et par fælles udfordringer, der kan begrænse koblingen. For det første, hvis chippen ikke blev rengjort ordentligt og alle rester PBS fjernet helt, kan der være snavs eller krystalliseret PBS på bølge føringen. Dette kan medføre store tab, hvilket resulterer i meget lidt strøm i billedområdet. Ved hjælp af en fugtig vatpind til at rense regionen uden for dækslet glas kan forbedre strømmen betydeligt. For det andet, hvis bølge vejledningens koblings facet er beskadiget (f. eks. ved forkert håndtering), kan koblings tabet stige drastisk. Optisk inspektion af kanten vil normalt afsløre eventuelle skader nemt. Hele koblings facetten af chippen kan poleres forsigtigt, meget gerne en optisk fiber, og vil give en glat kobling facet, som derefter øger den koblede strøm.

Efter at lyset er blevet koblet, er billedbehandlings proceduren den samme som i enhver konventionel d-storm opsætning. Hvis billedet har uhomogen excitation, som vist i figur 2A, så sandsynligvis den tilstand gennemsnit fungerede ikke godt. De to mest almindelige årsager til dette er: 1) for få billeder fanget for at skabe en gennemsnitlig stak og 2) for kort af en svingnings afstand/for stor af en trin størrelse. Indsamling for få billeder kan udelade nogle excitation mønstre og gennemsnittet vil således være inhomogene. Dette kan nemt løses ved at øge antallet af billeder i den gennemsnitlige stak. For kort af en svingnings afstand kan også resultere i et inhomogent billede, da ikke nok mode mønstre er ophidset. Dette kan også nemt løses ved at øge svingnings afstanden og/eller formindske trin størrelsen. I dette arbejde har vi brugt en piezo fase til at scanne input laserstråle over 20 μm og erhverve mindst 300 billeder. En anden fremgangsmåde kunne være at bruge High-Speed galvo-spejle til at scanne lyset på tværs af input Waveguide facet inden for en enkelt erhvervelse tid, såsom 10-30 MS. denne indstilling er velegnet til live Cell tirf Imaging, hvor sub-cellulære organeller er i konstant bevægelse.

Chip-baseret dstorm tilbyder en hidtil uset stor område tirf excitation, hvilket gør det ideelt egnet til høj gennemløb Imaging. Den kompakte karakter giver mulighed for efter montering til kommercielle systemer, hvor chippen kan placeres på hovedet for inverterede opsætninger eller gennemsigtige substrater kan udvikles. Chips er masse fabrikerede og kan ændres, så de passer til mange behov. I øjeblikket er den vigtigste begrænsning er, at det er begrænset til 2D. Det passive felt er kun tilgængelig ca. 200 Nm væk fra bølge føringen overflade, så kun fluorophores i denne region vil være spændt. Samlet giver området for integreret optik mange muligheder for chip baseret mikroskopi i den nærmeste fremtid ved at tackle nye billedbehandlings spørgsmål samt give nye muligheder til eksisterende.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-axis sample stage	Standa	7T173-20
2-axis sample translation stage	Mad City Labs		Custom order
3-axis NanoMax stage	Thorlabs	MAX311D
BXFM microscope body	Olympus	OLY-LSM-037018
CellMask Deep Red, Life technologies	ThermoFisher	C10046
Cleanroom grade swabs	MRC Technology	MFS-758
Fiber-coupled laser	Cobolt	Flamenco
Filter Holder	Homemade
Hellmanex III, Hellma Gmbh	Sigma-Aldrich	Z805939	Cleaning detergent concentrate
Isopropanol	Sigma-Aldrich	563935-1L
KL 1600 LED	Olympus	OLY-LSM-E0433314
Olympus Coupling lens	Olympus	LMPLFLN 50x/0.5
Orca Flash 4.0 V2	Hamamatsu
PBS tablets	Sigma-Aldrich	P4417-50TAB	Mix according to descriptions
SYLGARD 184 Silicone Elastomer 1.1 kg kit	Dow	1673921
Tip-tilt stage	Thorlabs	APR001
Vacuum holder	Thorlabs	HWV001
Wafer Tweezers Type 2W	Agar scientific	AGT5051