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Biochemistry

Fluorescence interne totale de réflexion à haut débit et microscopie optique stochastique directe de reconstruction utilisant une puce photonique

Published: November 16, 2019 doi: 10.3791/60378
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Department of Physics and Technology, UiT The Arctic University of Norway, 2Vascular Biology Research Group, Department of Medical Biology, UiT The Arctic University of Norway

Summary

La microscopie optique à base de puces est une nouvelle approche de la microscopie à fluorescence et offre des avantages en termes de rentabilité et de débit. Ici, les protocoles de préparation et d'imagerie des puces sont présentés pour la microscopie TIRF et la microscopie super-résolution basée sur la localisation.

Abstract

La fluorescence interne totale de réflexion (TIRF) est couramment employée dans la microscopie de super-résolution basée sur la localisation simple de molécule car elle donne le contraste accru dû à la section optique. L'approche conventionnelle consiste à utiliser des objectifs TIRF à haute ouverture numérique pour l'excitation et la collecte, ce qui limite considérablement le champ de vision et le débit. Nous présentons une nouvelle approche pour générer l'excitation DEF pour l'imagerie avec des guides d'ondes optiques, appelée nanoscopie à base de puces. L'objectif de ce protocole est de démontrer comment l'imagerie par puce est effectuée dans une configuration déjà construite. Le principal avantage de la nanoscopie à puce est que les voies d'excitation et de collecte sont découplées. L'imagerie peut alors être réalisée avec une lentille de grossissement faible, résultant en un grand champ de vue des images TIRF, au prix d'une petite réduction de la résolution. Les cellules endothéliales sinusoïdales de foie (LSECs) ont été imaged utilisant la microscopie optique stochastic directe de reconstruction optique(dSTORM), montrant une résolution comparable aux microscopes super-résolution traditionnels. En outre, nous démontrons les capacités à haut débit en imagerie d'une région de 500 m x 500 m avec une lentille de grossissement faible, fournissant une résolution de 76 nm. Grâce à son caractère compact, l'imagerie à puce peut être réaménagée dans la plupart des microscopes courants et peut être combinée à d'autres techniques optiques sur puce, telles que la détection sur puce, la spectroscopie, le piégeage optique, etc. La technique est donc idéalement adaptée à l'imagerie 2D à haut débit, mais offre également de grandes possibilités d'analyse multimodale.

Introduction

Depuis la démonstration initiale de la microscopie de localisation d'une seule molécule, de nombreuses variations ont été développées pour résoudre différents défis1,2,3. Un défi qui est resté, cependant, est grand champ de vue dSTORM imagerie. Beaucoup de configurations storm dutiliser la même lentille objective à la fois exciter l'échantillon et de l'image. Afin d'augmenter le champ de vision, une lentille de grossissement faible est nécessaire. Les lentilles objectives à faible grossissement et à faible ouverture numérique (NA) ont généralement une grande profondeur de champ, ce qui entraîne une augmentation du signal hors plan qui réduira la précision de localisation. Les objectifs de TIRF sont couramment utilisés pour augmenter le contraste d'image en réduisant la fluorescence hors plan. Grâce à TIRF, l'excitation est limitée à une épaisseur optique d'environ 150 nm de la surface au moyen d'un champ évanescent4. Les lentilles objectives TIRF nécessitent un grand NA résultant en un petit champ de vision (FOV) (par exemple, 50 x 50 m2), ce qui limite le débit de manière significative. Il existe cependant d'autres moyens de générer un champ évanescent.

Un guide d'ondes optique est une structure qui confinera et guidera la lumière si elle est couplée dans la structure. Le plus souvent, les guides d'ondes sont utilisés dans les télécommunications à base de fibres. Un grand effort a été fait afin de développer des guides d'ondes intégrés 2D comme composant principal des circuits photoniques intégrés. La technologie a progressé à un point où la fabrication de bas-perte nano-structuré s'agite des guides d'ondes optiques 5. Aujourd'hui, plusieurs fonderies à travers le monde peuvent être utilisées pour développer des circuits photoniques intégrés. Les guides d'ondes guident la lumière à travers une réflection interne totale présentant également un champ évanescent à la surface. Par la conception soigneuse de la structure de guide d'onde, une intensité élevée peut être réalisée dans le domaine évanescent. Un échantillon placé directement sur la surface du guide d'ondes peut ainsi également être éclairé par le champ évanescent pour des applications d'imagerie. Le champ évanescent sera généré sur toute la longueur et la largeur du guide d'ondes, et donc il peut être fait arbitrairement grand6.

Nous présentons une nouvelle approche de TIRF dSTORM qui offre un champ de vision arbitrairement large. Au lieu d'utiliser une lentille TIRF pour l'excitation et la collecte, nous excitons en utilisant le champ évanescent à partir de guides d'ondes optiques. Cela découple la voie de lumière d'excitation et de collecte, permettant une liberté totale le long du chemin de lumière de collecte sans compromettre la section optique pour une longueur d'onde donnée fournie par l'éclairage de puce de guide d'onde. Les lentilles de grossissement faibles peuvent ainsi être utilisées pour l'image de très grandes régions en mode TIRF, bien qu'un NA plus petit réduise la résolution latérale. En outre, l'imagerie multicolore est également grandement simplifiée à l'aide de guides d'ondes7, car plusieurs longueurs d'onde peuvent être guidées et détectées sans réajuster le système. Ceci est avantageux pour dSTORM, car les longueurs d'onde basses peuvent être utilisées pour améliorer le clignotement fluorophore et pour l'imagerie multicolore. Il est à noter que la profondeur de pénétration du champ évanescent changera en fonction de la longueur d'onde, bien qu'elle n'affecte pas la façon dont la procédure d'imagerie est effectuée. La puce est compatible avec l'imagerie cellulaire 8 et est idéale pour des applications telles que l'intégration de la microfluidique. Chaque puce peut contenir des dizaines de guides d'ondes, ce qui peut permettre à l'utilisateur d'imager dans des conditions différentes ou d'appliquer le piégeage optique9 et la spectroscopie Raman10.

Le système à puce fonctionne également bien pour l'imagerie à la diffraction limitée et super-résolution. Une approche similaire a été introduite en 2005 à l'aide d'un prisme pour générer une excitation de champ évanescente4. La puce photonique excite également à travers le champ évanescent, mais avec des techniques modernes de fabrication de guides d'ondes, on peut générer des motifs de lumière exotiques avec des guides d'ondes. La mise en œuvre actuelle de la nanoscopie à base de puces est limitée à l'imagerie 2D seulement, car le champ d'excitation est verrouillé à l'intérieur de la surface du guide d'ondes. Le développement futur visera les applications 3D. En outre, d'autres techniques de super-résolution telles que la microscopie d'éclairage structurée sont en cours de développement à l'aide du même microscope à puce11.

Protocol

1. Préparation de la couche de polydiméthylsiloxane (PDMS)

  1. Préparer un mélange 10:1 de monomère Et agent de durcissement Sylgard 184.
  2. Placer le mélange dans une chambre à vide jusqu'à ce que les bulles d'air ont disparu.
  3. Verser 1,7 g de mélange PDMS au centre d'un plat Petri de 3,5 pouces (diamètre).
  4. Placez le plat Petri sur le mandrin sous vide d'un enduit de spin.
  5. Enrober le plat Petri pour 20 s à 900 tr/min, avec une accélération de 75 tr/min/s.
  6. Faire le plat sur une plaque chauffante à 50 oC pendant au moins 2 h.

2. Préparation de l'échantillon

  1. Nettoyage Waveguide
    1. Préparer 100 ml d'une dilution de 1 % du concentré de détergent nettoyant(Tableau des matériaux)dans de l'eau déionisée (DI).
    2. Placer la puce dans un plat Petri en verre à l'aide d'une pince à gaufrettes et couvrir complètement avec la solution de détergent.
    3. Déposer le plat Petri sur une assiette chaude à 70 oC pendant 10 min.
    4. Alors que toujours sur la plaque chaude, frotter la surface avec un écouvillon de tissu de la salle blanche.
    5. Retirer la puce du plat Petri. Rincer avec au moins 100 ml d'eau DI.
    6. Rincer avec au moins 100 ml d'isopropanol, en prenant soin que le solvant ne sèche pas à la surface pour prévenir les taches d'évaporation.
    7. Rincer avec au moins 100 ml d'eau DI. Soufflez la puce sèche avec un pistolet à azote.
  2. Préparation de la chambre
    1. Préparer une couche de 150 m de polydiméthylsiloxane (PDMS) dans un plat Petri (section 1).
    2. Utilisez un scalpel pour couper un cadre de 1,5 cm x 1,5 cm de la couche PDMS.
    3. Soulevez le cadre du plat Petri avec une pince à épiler. Déposez-le à plat sur une puce propre et polie. L'échantillon est maintenant prêt pour l'ensemencement cellulaire.
  3. Étiquetage fluorescent
    1. Préparer les produits chimiques suivants : solution saline tamponnée en phosphate, solution de colorant(s), tampon d'imagerie STORM.
    2. Après l'ensemencement cellulaire, retirez la puce du support.
    3. Utilisez une pipette pour enlever tout excès de liquide à l'extérieur de la chambre PDMS.
    4. Retirez le liquide actuel de l'intérieur de la chambre PDMS à l'intérieur de la chambre PDMS à l'intérieur de la pipette tout en ajoutant environ 60 l de PBS propre en même temps.
      REMARQUE : Le montant ajouté à la chambre devra être modifié en fonction de la taille de la chambre. Veillez à ne pas enlever tous les supports de la surface de la cellule.
    5. Remplacez le PBS par 60 L de PBS propre et laissez-le incuber pendant 1 min.
    6. Répétez l'étape précédente, en le laissant incuber pendant 5 min cette fois.
    7. Retirez le PBS et remplacez-le par 60 l de la solution de colorant. Laisser l'échantillon incuber pendant environ 15 minutes, le protégeant de la lumière.
      REMARQUE : Cette étape pourrait devoir changer de manière significative, selon le colorant fluorescent utilisé. Nous utilisons CellMask Deep Red pour étiqueter la membrane cellulaire pour cette expérience
    8. Laver l'échantillon avec PBS comme dans les étapes 2.3.3-2.3.5.
    9. Retirez le PBS et remplacez-le par 40 l de la mémoire tampon d'imagerie en même temps.
      REMARQUE : Il existe plusieurs tampons d'imagerie différents pour différents colorants fluorescents.
    10. Placez un bordereau sur le dessus, empêchant les bulles d'air de se former en dessous. Appuyez doucement sur la couverture contre la chambre d'imagerie pour enlever tout excès de support.
    11. Utilisez une pipette pour enlever tout excès de support à l'extérieur de la couverture. Nettoyez la zone à l'extérieur de la glissière à l'eau avec un écouvillon humide d'eau pour éviter les cristaux formés par les résidus de supports d'immersion séchés.

3. Procédure d'imagerie

  1. Configuration des composants
    REMARQUE : Cette version de la configuration se compose de trois composants principaux : le microscope, l'étape de couplage, et l'étape d'échantillon. Voir la Table des Matériaux.
    1. Utilisez un microscope avec un porte-filtre, une source de lumière blanche, un appareil photo et un revolver objectif.
    2. Utilisez une phase d'accouplement piezo à 3 axes avec un laser couplé à la fibre et une lentille d'accouplement.
    3. Utilisez un stade d'échantillon manuel à axe unique avec pointe et inclinaison et un porte-aspirateur.
    4. Montez à la fois l'accouplement et l'étape de l'échantillon sur une scène motorisée à deux axes pour la traduction d'échantillons.
  2. Couplage Waveguide
    1. Placez la puce sur le mandrin à vide avec la facette d'accouplement vers l'objectif de couplage. Assurez-vous que la puce est à environ une longueur focale de l'objectif de couplage.
    2. Allumez la pompe à vide.
    3. Allumez le laser à 1 mW. Ajustez grossièrement la hauteur de la puce de sorte que le faisceau frappe le bord de celui-ci. Éteignez le laser.
    4. Allumez la source de lumière blanche. Choisissez une lentille objective à faible grossissement (p. ex. 10x). Concentrez le microscope sur un guide d'ondes.
    5. Traduire le microscope le long du guide d'ondes pour voir s'il est bien aligné avec la trajectoire optique. Déplacez le microscope vers le bord d'accouplement.
    6. Allumez le laser à 1 mW ou moins. Traduire le microscope le long du bord d'accouplement pour trouver la lumière laser. Concentrez le faisceau sur le bord de la puce.
    7. Ajuster l'étape d'accouplement le long de la trajectoire optique dans la direction qui réduit la taille de la tache de faisceau laser jusqu'à ce qu'il disparaisse. Le faisceau est maintenant au-dessus ou au-dessous de la surface de la puce.
    8. Ajustez la hauteur de l'étape d'accouplement jusqu'à ce que la tache du faisceau réapparaisse et soit maximisée.
    9. Répétez les deux étapes précédentes jusqu'à ce que le laser forme un endroit focalisé.
    10. Déplacez l'endroit ciblé vers le guide d'ondes d'intérêt.
    11. Traduire le microscope à une courte distance du bord de sorte que la tache de faisceau focalisé n'est plus visible. Éteignez la lumière blanche.
    12. Ajustez le contraste. Si le guide d'ondes guide, la lumière dispersée le long du guide d'ondes doit être clairement visible.
    13. Ajustez les axes de la scène d'accouplement pour maximiser l'intensité lumineuse dispersée. Éteignez le laser.
    14. Allumez la lumière blanche. Ajustez le contraste si nécessaire.
    15. Naviguez vers la région d'imagerie.
  3. Imagerie limitée à la diffraction
    1. Concentrez-vous avec l'objectif d'imagerie souhaité. Éteignez la lumière blanche.
    2. Insérez le filtre à fluorescence et tournez la puissance laser à 1 mW.
    3. Réglez le temps d'exposition de la caméra à environ 100 ms. Ajustez le contraste au besoin. Assurez-vous que le couplage est toujours optimisé.
    4. Localiser une région d'intérêt pour l'imagerie. Activez la boucle d'étape de piezo aux modes moyens dehors.
      REMARQUE : La plage d'analyse de 20 m avec une taille d'étape de 50 nm convient à la plupart des structures de guidage d'ondes.
    5. Capturez au moins 300 images.
    6. Chargez la pile d'images capturées vers Fidji à l'aide d'une pile virtuelle. Dans le menu d'images à Fidji, choisissez Stacks et z-project.
    7. Calculez l'image TIRF en choisissant l'intensité moyennedu type de projection.
  4. d (en) Imagerie STORM
    1. Allumez le laser à 1 mW et fixez le temps d'exposition de la caméra à 30 ms.
    2. Ajustez le contraste et la mise au point.
    3. Augmenter la puissance du laser jusqu'à ce que le clignotement soit observé.
      REMARQUE: Cela peut prendre un certain temps, en fonction de l'intensité du champ évanescent.
    4. Zoom sur une petite région de l'échantillon.
    5. Ajustez le contraste.
    6. Capturez quelques images pour voir si les clignotements sont bien séparés.
    7. Ajustez le temps d'exposition de la caméra pour un clignotement optimal.
      REMARQUE: Optimiser clignotement est une tâche complexe, mais beaucoup de littérature appropriée est disponible12.
    8. Allumez la boucle de scène piezo.
    9. Enregistrez une pile d'images d'au moins 30 000 images, selon la densité clignotante.
  5. d (en) Reconstruction de l'image STORM
    1. Ouvrez Fidji et chargez la pile dSTORM en images virtuelles.
    2. Ajustez le contraste, si nécessaire.
    3. Utilisez l'outil rectangle pour sélectionner la zone à reconstruire.
    4. Analyse Open Run dans le plugin Thunderstorm13 aux Fidji.
    5. Définir les paramètres de base de la caméra dans Thunderstorm correspondant à l'appareil. Les paramètres par défaut restants sont généralement satisfaisants.
    6. Commencez la reconstruction.
      REMARQUE : Pour le champ d'opinion complet, les données peuvent devoir être divisées en sous-piles, en raison de la grande taille du fichier.
    7. Filtrer la liste de localisation fournie par le logiciel de reconstruction pour supprimer les localisations non spécifiques. Apple une correction de dérive supplémentaire si nécessaire.

Representative Results

La microscopie TIRF est une technique populaire car elle élimine la fluorescence hors plan, augmente le contraste et améliore ainsi la qualité de l'image, et est moins phototoxique par rapport à d'autres techniques de microscopie à base de fluorescence. Par rapport à l'approche objective traditionnelle, la microscopie à puce offre l'excitation TIRF sans le débit limité qui est généralement accompagné d'une lentille TIRF. Un aperçu de la configuration présentée se trouve dans la figure 1A. Nous présentons des images diffraction-limitées ainsi que dSTORM des cellules endothéliales sinusoïdales de foie (LSEC) extraites des souris. Une grande image de champ de vue des LSEC avec la microtubuline étiquetée est également présentée, démontrant les capacités de l'imagerie à haut débit. Une configuration conventionnelle dSTORM à l'aide d'une lentille TIRF d'immersion d'huile (60x ou 100x grossissement) images généralement une zone de 50 m x 50 m, qui est 100 fois plus petit que l'image à puce dans la figure 2, image avec un objectif de 25x, 0,8 NA.

Dans cette méthode, nous utilisons multi-mode Si3N4 waveguides pour l'excitation. Les puces utilisées se composent d'une couche de guidage de 150 nm Si3N4 déposée sur une couche oxydée de 2 m d'une puce de silicium. Un schéma de la puce peut être trouvé dans la figure 1B. Les largeurs des guides d'ondes peuvent varier entre 200 et 1000 m. Les détails de fabrication peuvent être trouvés ailleurs8. Par interférence entre les modes de propagation, la lumière d'excitation n'aura pas une distribution d'intensité homogène, mais plutôt un modèle variable sur le plan spatial. La figure 2A présente une image avec des modèles de mode clairement visibles. Ce modèle d'interférence changera avec la position du faisceau laser au bord du guide d'ondes. Afin d'atteindre une excitation homogène dans les images finales, nous utilisons une scène piezo pour osciller le long de la facette couplée. Au cours de la procédure d'imagerie, il existe suffisamment de variations des modèles d'interférence pour qu'ils puissent être mis en moyenne, en supprimant les fluctuations d'intensité de l'image. La pile d'images se composera de plusieurs images telles que dans la figure 2A, bien qu'avec des modèles différents, mais une fois en moyenne, la pile donnera une image avec une excitation homogène telle que la figure 2B. Une approche alternative est d'utiliser un effilage adiabatique pour atteindre large, one moded waveguides8,14, qui supprime la nécessité de la moyenne du mode. Cependant, plusieurs millimètres de longueur effilée sont nécessaires pour maintenir l'état en mode unique afin d'atteindre une largeur de guide d'onde de 100 m. Les guides d'ondes multimodes contournent cette nécessité effilée et ne laissent aucune limite à la largeur de la structure. Au-delà du modèle d'illumination, l'indice de réfraction très efficace des modes permet des possibilités sans précédent vers la microscopie d'éclairage structurée11 et les méthodes de microscopie de fluctuation7.

La première étape de l'imagerie consiste à recueillir une image limitée à la diffraction. L'expérience se traduit par une pile d'environ 300 images et l'image finale est faite en prenant la moyenne de la pile. Dans la figure 2, nous présentons la diffraction limitée et dSTORM imagerie des LSEC étiquetés avec CellMask Deep Red en utilisant un 60x, 1.2 NA objectif d'immersion de l'eau. La figure 2A montre un éclairage inhomogène causé par une moyenne de mode insuffisante. La moyenne du mode réussi est affichée dans la figure 2B. La figure 2C est une image dSTORM de la même région, avec la région marquée indiquée dans la figure 2D. Les cellules endothéliales sinusoïdales de foie ont des pores nano-classés dans la membrane de plasma15,qui peut être vu ici. Une analyse de la corrélation de l'anneau Fourier a fourni une résolution de 46 nm.

La figure 3 présente une image dSTORM d'une région de 500 m x 500 m, démontrant les capacités de haut débit de la technique. Une image zoomée de la figure 3A, correspondant à un champ de vision typique de STORM,est présentée avec l'image limitée de diffraction dans la figure 3B. Une corrélation d'anneau de Fourier pour estimer la résolution a été exécutée, donnant une valeur de 76 nm.

Figure 1
Figure 1 : Système d'imagerie et guide d'ondes. (A) Photographie du système d'imagerie. L'échantillon est placé sur un mandrin sous vide sur la scène de l'échantillon, avec la facette couplage du guide d'onde vers l'objectif d'accouplement. Un laser couplé en fibre et un objectif d'accouplement est placé au-dessus d'une scène piezo 3D. Une tourelle d'objectif avec des lentilles d'imagerie capture l'image d'en haut et la transmet à une caméra. (B) Schéma tique du guide d'ondes avec des lentilles d'accouplement et d'imagerie. Les couples de lentilles de couplage s'allument dans le guide d'ondes. Les échantillons (perles d'orange) sont conservés à l'intérieur d'une chambre PDMS scellée. Le champ évanescent le long du guide d'ondes excitera l'échantillon et l'objectif d'imagerie capte la fluorescence émise. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Images diffraction limitées et dSTORM. (A) Image des cellules endothéliales sinusoïdales de foie avec la moyenne insuffisante de mode, ayant pour résultat un modèle clairement visible d'excitation. (B) La même région que dans (A), mais avec une moyenne de mode suffisante, résultant en excitation homogène. (C) Diffraction image limitée de l'enset dans (B); (D) dSTORM image de la même région. (E) Encastré de (D), montrant clairement les fenestrations dans la membrane plasmatique de la cellule. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : dSTORM image de rat LSECs. (A) Grand champ de vision dSTORM image d'Alexa 647 tubuline tachée dans les Rat LSECs. Barre d'échelle de 50 m. (B) Région marquée plus grande de (A) comparant l'image diffraction limitée (en bas à gauche) et dSTORM (en haut à droite). (C) Petite région marquée de (A). Barre d'échelle de 1 m. L'image a une résolution de 76 nm. Adapté avec la permission de Helle et coll. 20196. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

L'imagerie à base de copeaux est similaire à l'imagerie conventionnelle dSTORM. La qualité de l'image peut ainsi être évaluée en utilisant les mêmes approches que pour l'imagerie traditionnelle dSTORM. La principale différence pour l'utilisateur est que la glissière en verre transparent est échangée avec un Si-wafer opaque. Bien qu'ils semblent très différents, la manipulation de l'échantillon est pratiquement analogue à une glissière en verre. Les puces sont assez robustes et peuvent facilement être manipulées à l'aide de pinces à gaufrettes. La procédure d'imagerie et la reconstruction de l'image sont les mêmes que dans une expérience régulière dSTORM. La mise en place d'un microscope fonctionnel à base de puces ne nécessite pas de composants spéciaux, à l'exception des puces photoniques. Plus de détails de la configuration peuvent être trouvés dans le travail précédent6,7. Les puces utilisées dans ce travail ont été fabriquées à l'aide de la photolithographie standard8.

La préparation de l'échantillon comprend la préparation de la chambre d'échantillon. Lorsque vous attachez le cadre PDMS à la puce, il est crucial d'éviter les petits plis ou les déchirures où l'air pourrait entrer. Si le PDMS se plie en le attachant, retirez-le soigneusement à l'euppi et rattachez-le. Lorsque l'échantillon est prêt à l'intérieur de la chambre PDMS, le verre de couverture doit être pressé contre elle, scellant la région. Il est important d'éviter les bulles d'air qui pourraient se former lors de l'attachement de la vitre. Si une bulle d'air est formée, retirez délicatement le verre de couverture et ajoutez du PBS à la chambre d'échantillon pour s'assurer que l'échantillon est couvert. La préparation et l'attachement du bordereau de couverture peuvent alors simplement être refaits.

L'accouplement de la lumière dans le guide d'ondes est simplifié en utilisant le protocole proposé dans ce document. Il y a cependant quelques défis communs qui peuvent limiter le couplage. Tout d'abord, si la puce n'a pas été nettoyée correctement et les restes de PBS enlevécomplètement complètement, il pourrait y avoir de la saleté ou de la PBS cristallisée sur le guide d'ondes. Cela peut entraîner des pertes importantes, ce qui entraîne très peu d'énergie dans la région d'imagerie. L'utilisation d'un écouvillon humide pour nettoyer la région à l'extérieur du verre de couverture peut améliorer la puissance de manière significative. Deuxièmement, si la facette d'accouplement du guide d'ondes est endommagée (par exemple, par une manipulation inappropriée), la perte d'accouplement peut augmenter considérablement. L'inspection optique du bord révélera habituellement n'importe quels dommages facilement. La facette de couplage entière de la puce peut être polie soigneusement, un peu comme une fibre optique, et donnera une facette lisse de couplage, qui augmente alors la puissance couplée.

Une fois que la lumière a été couplée, la procédure d'imagerie est la même que dans n'importe quelle configuration conventionnelle de STORM. Si l'image a une excitation inhomogène, comme le démontre la figure 2A, alors très probablement la moyenne du mode n'a pas bien fonctionné. Les deux raisons les plus courantes sont: 1) trop peu d'images capturées afin de créer une pile moyenne et 2) trop court d'une distance d'oscillation / trop grand d'une taille d'étape. La collecte de trop peu d'images peut laisser de côté certains modèles d'excitation et la moyenne sera donc inhomogène. Cela peut facilement être résolu en augmentant le nombre d'images dans la pile moyenne. Une distance d'oscillation trop courte peut également donner lieu à une image inhomogène, car les modèles de mode ne sont pas suffisamment excités. Cela peut également être facilement résolu en augmentant la distance d'oscillation et / ou en diminuant la taille de l'étape. Dans ce travail, nous avons utilisé une étape piezo pour scanner le faisceau laser d'entrée sur 20 'm et acquérir au moins 300 images. Une autre approche pourrait consister à utiliser des miroirs de galvo à grande vitesse pour scanner la lumière à travers la facette du guide d'onde d'entrée dans un seul délai d'acquisition, comme 10-30 ms. Cette option convient à l'imagerie TIRF à cellules vivantes, où les organites sous-cellulaires sont en mouvement constant.

Le dSTORM à base de copeaux offre une excitation TIRF sans précédent, ce qui le rend idéal pour l'imagerie à haut débit. Le caractère compact permet de se réaménager sur les systèmes commerciaux, où la puce peut être placée à l'envers pour des configurations inversées ou des substrats transparents peuvent être développés. Les puces sont fabriquées en masse et peuvent être modifiées pour répondre à de nombreux besoins. Actuellement, la principale restriction est qu'il est limité à la 2D. Le champ évanescent n'est disponible qu'à environ 200 nm de la surface du guide d'ondes, de sorte que seuls les fluorophores dans cette région seront excités. Au total, le domaine de l'optique intégrée offre de nombreuses possibilités de microscopie à puce dans un proche avenir, en s'attaquant à de nouvelles questions d'imagerie ainsi qu'en offrant de nouvelles possibilités aux questions existantes.

Disclosures

B.S. Ahluwalia a déposé une demande de brevet GB1606268.9 pour la nanoscopie optique à base de puces. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Acknowledgments

Les auteurs souhaitent saluer le Conseil européen de la recherche (accord no 336716 à B.S.A.). Les auteurs souhaitent également remercier Irati Lagfragua pour son aide inestimable dans l'enregistrement et l'édition de la vidéo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-axis sample stage Standa 7T173-20
2-axis sample translation stage Mad City Labs Custom order
3-axis NanoMax stage Thorlabs MAX311D
BXFM microscope body Olympus OLY-LSM-037018
CellMask Deep Red, Life technologies ThermoFisher C10046
Cleanroom grade swabs MRC Technology MFS-758
Fiber-coupled laser Cobolt Flamenco
Filter Holder Homemade
Hellmanex III, Hellma Gmbh Sigma-Aldrich Z805939 Cleaning detergent concentrate
Isopropanol Sigma-Aldrich 563935-1L
KL 1600 LED Olympus OLY-LSM-E0433314
Olympus Coupling lens Olympus LMPLFLN 50x/0.5
Orca Flash 4.0 V2 Hamamatsu
PBS tablets Sigma-Aldrich P4417-50TAB Mix according to descriptions
SYLGARD 184 Silicone Elastomer 1.1 kg kit Dow 1673921
Tip-tilt stage Thorlabs APR001
Vacuum holder Thorlabs HWV001
Wafer Tweezers Type 2W Agar scientific AGT5051

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nature Methods. 5 (6), 527-529 (2008).
  2. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  3. Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines. Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).
  4. Wazawa, T., Ueda, M. Total internal reflection fluorescence microscopy in single molecule nanobioscience. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 77-106 (2005).
  5. Jalali, B., Fathpour, S. Silicon photonics. Journal of Lightwave Technology. 24 (12), 4600-4615 (2006).
  6. Helle, ØI., Coucheron, D. A., Tinguely, J. C., Øie, C. I., Ahluwalia, B. S. Nanoscopy on-a-chip: super-resolution imaging on the millimeter scale. Optics Express. 27 (5), 6700-6710 (2019).
  7. Diekmann, R., et al. Chip-based wide field-of-view nanoscopy. Nature Photonics. 11 (5), 322-328 (2017).
  8. Tinguely, J. C., Helle, ØI., Ahluwalia, B. S. Silicon nitride waveguide platform for fluorescence microscopy of living cells. Optics Express. 25 (22), 27678-27690 (2017).
  9. Ahluwalia, B. S., McCourt, P., Huser, T., Hellesø, O. G. Optical trapping and propulsion of red blood cells on waveguide surfaces. Optics Express. 18 (20), 21053-21061 (2010).
  10. Coucheron, D. A., Wadduwage, D. N., Murugan, G. S., So, P. T. C., Ahluwalia, B. S. Chip-Based Resonance Raman Spectroscopy Using Tantalum Pentoxide Waveguides. IEEE Photonics Technology Letters. 31 (14), 1127-1130 (2019).
  11. Helle, ØI., Dullo, F. T., Lahrberg, M., Tinguely, J. C., Ahluwalia, B. S. Structured illumination microscopy using a photonic chip. ArXiV. , https://arxiv.org/abs/1903.05512v1 (2019).
  12. Metcalf, D. J., Edwards, R., Kumarswami, N., Knight, A. E. Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
  13. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  14. Archetti, A., Glushkov, E., Sieben, C., Stroganov, A., Radenovic, A., Manley, S. Waveguide-PAINT offers an open platform for large field-of-view super-resolution imaging. Nature Communications. 10, (2019).
  15. Braet, F., Wisse, E. Structural and functional aspects of liver sinusoidal endothelial cell fenestrae: a review. Comparative Hepatology. 1, 1 (2002).

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Biochimie Numéro 153 Fluorescence fluorescence de la réflexion interne totale microscopie optique super-résolution nanoscopie guides d'ondes optique intégrée
Fluorescence interne totale de réflexion à haut débit et microscopie optique stochastique directe de reconstruction utilisant une puce photonique
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Coucheron, D. A., Helle, Ø. I.,… More

Coucheron, D. A., Helle, Ø. I., Øie, C. I., Tinguely, J. C., Ahluwalia, B. S. High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip. J. Vis. Exp. (153), e60378, doi:10.3791/60378 (2019).

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