चिप आधारित सुपर-रिज़ॉल्यूशन ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण है और लागत प्रभावशीलता और थ्रूपुट में लाभ प्रदान करता है। यहां टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी और लोकलाइजेशन बेस्ड सुपर रेजोल्यूशन माइक्रोस्कोपी के लिए चिप तैयार करने और इमेजिंग के प्रोटोकॉल दिखाए गए हैं ।
कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस (टीआईआरएफ) का उपयोग आमतौर पर एकल अणु स्थानीयकरण आधारित सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी में किया जाता है क्योंकि यह ऑप्टिकल सेक्शनिंग के कारण इसके विपरीत बढ़ाता है। पारंपरिक दृष्टिकोण उत्तेजना और संग्रह दोनों के लिए उच्च संख्यात्मक अपर्चर माइक्रोस्कोप TIRF उद्देश्यों का उपयोग करना है, जो देखने के क्षेत्र और थ्रूपुट को गंभीर रूप से सीमित करता है। हम ऑप्टिकल वेवगाइड के साथ इमेजिंग के लिए टीआईआरएफ उत्तेजना पैदा करने के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं, जिसे चिप-आधारित नैनोस्कोपी कहा जाता है। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य यह प्रदर्शित करना है कि पहले से निर्मित सेटअप में चिप-आधारित इमेजिंग कैसे की जाती है। चिप आधारित नैनोस्कोपी का मुख्य लाभ यह है कि उत्तेजना और संग्रह के रास्ते वियुग्मित हैं। इमेजिंग तो एक कम आवर्धन लेंस के साथ किया जा सकता है, देखने के बड़े क्षेत्र TIRF छवियों में जिसके परिणामस्वरूप, संकल्प में एक छोटी सी कमी की कीमत पर । लिवर सिनुसोइडल एंडोथेलियल कोशिकाओं (एलएसईसी) को प्रत्यक्ष स्टोचस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी(डीस्टॉर्म) का उपयोग करके चित्रित किया गया था, जिसमें पारंपरिक सुपर-रेजोल्यूशन माइक्रोस्कोप के बराबर संकल्प दिखाया गया था। इसके अलावा, हम एक कम आवर्धन लेंस के साथ एक 500 μm x 500 μm क्षेत्र इमेजिंग द्वारा उच्च थ्रूपुट क्षमताओं का प्रदर्शन करते हैं, जो 76 एनएम का संकल्प प्रदान करते हैं। इसके कॉम्पैक्ट कैरेक्टर के जरिए चिप बेस्ड इमेजिंग को सबसे आम माइक्रोस्कोप में रेट्रोफिट किया जा सकता है और इसे ऑन-चिप सेंसिंग, स्पेक्ट्रोस्कोपी, ऑप्टिकल ट्रैपिंग आदि जैसी अन्य ऑन-चिप ऑप्टिकल तकनीकों के साथ जोड़ा जा सकता है । तकनीक इस प्रकार आदर्श रूप से उच्च थ्रूपुट 2डी सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए अनुकूल है, लेकिन बहु-मॉडल विश्लेषण के लिए भी महान अवसर प्रदान करती है।
एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी के प्रारंभिक प्रदर्शन के बाद से,विभिन्नचुनौतियों को हल करने के लिए कई विविधताएं विकसित की गई हैं 1,2,3। एक चुनौती है कि बनी हुई है, हालांकि, देखने के बड़े क्षेत्र dSTORM इमेजिंग है । कई डीस्टॉर्म सेटअप नमूना उत्तेजित करने और इसे छवि देने के लिए एक ही उद्देश्य लेंस का उपयोग करते हैं। देखने के क्षेत्र को बढ़ाने के लिए, कम आवर्धन लेंस की आवश्यकता होती है। कम आवर्धन और कम संख्यात्मक एपर्चर (एनए) ऑब्जेक्टिव लेंस में आमतौर पर क्षेत्र की एक बड़ी गहराई होती है, जिसके परिणामस्वरूप विमान के सिग्नल में वृद्धि होती है जो स्थानीयकरण परिशुद्धता को कम कर देगी। TIRF उद्देश्यों आमतौर पर बाहर के विमान फ्लोरेसेंस को कम करने के द्वारा छवि विपरीत बढ़ाने के लिए उपयोग किया जाता है । टीआईआरएफ के माध्यम से, उत्तेजना एक इवेनसेंट फील्ड4के माध्यम से सतह से लगभग 150 एनएम की ऑप्टिकल मोटाई तक सीमित है। टीआईआरएफ ऑब्जेक्टिव लेंस को एक बड़े एनए की आवश्यकता होती है जिसके परिणामस्वरूप एक छोटा क्षेत्र-दृश्य (एफओवी) (जैसे, 50 x 50 माइक्रोन2),जो थ्रूपुट को काफी सीमित करता है। हालांकि, एक इवांका फील्ड जेनरेट करने के वैकल्पिक तरीके हैं ।
एक ऑप्टिकल वेवगाइड एक संरचना है जो संरचना में युग्मित होने पर प्रकाश को सीमित और मार्गदर्शन करेगी। सबसे अधिक, वेवगाइड फाइबर आधारित दूरसंचार में उपयोग किया जाता है। फोटोनिक इंटीग्रेटेड सर्किट के मुख्य घटक के रूप में 2डी इंटीग्रेटेड वेवगाइड विकसित करने के लिए काफी प्रयास किए गए हैं। प्रौद्योगिकी एक बिंदु है जहां कम नुकसान नैनो संरचित ऑप्टिकल तरंग गाइड गढ़ने नियमित रूप से5किया जा सकता है के लिए उंनत है । आज, दुनिया भर के कई फाउंड्री का उपयोग फोटोनिक एकीकृत सर्किट विकसित करने के लिए किया जा सकता है। वेवगाइड कुल आंतरिक परावर्तन के माध्यम से प्रकाश का मार्गदर्शन भी सतह पर एक इवानसेंट क्षेत्र का प्रदर्शन करते हैं। वेवगाइड संरचना के सावधानीपूर्वक डिजाइन द्वारा, एक उच्च तीव्रता को इवेनसेंट क्षेत्र में प्राप्त किया जा सकता है। वेवगाइड सतह के शीर्ष पर सीधे रखा गया एक नमूना इस प्रकार इमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए इवेनसेंट क्षेत्र द्वारा भी प्रकाशित किया जा सकता है। इव्ससेंट क्षेत्र तरंग गाइड की पूरी लंबाई और चौड़ाई के साथ उत्पन्न किया जाएगा, और इस प्रकार इसे मनमाने ढंग से बड़े6बनाया जा सकता है।
हम TIRF डीस्टॉर्म के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण पेश करते हैं जो मनमाने ढंग से बड़े क्षेत्र को देखने की पेशकश करता है। उत्तेजना और संग्रह दोनों के लिए टीआईआरएफ लेंस का उपयोग करने के बजाय, हम ऑप्टिकल वेवगाइड से इवेनसेंट क्षेत्र का उपयोग करके उत्तेजित करते हैं। यह उत्तेजना और संग्रह प्रकाश मार्ग को डिकपल करता है, जो वेवगाइड चिप रोशनी द्वारा प्रदान की गई तरंगदैर्ध्य के लिए ऑप्टिकल सेक्शनिंग से समझौता किए बिना संग्रह प्रकाश पथ के साथ कुल स्वतंत्रता के लिए अनुमति देता है। कम आवर्धन लेंस इस प्रकार TIRF मोड में बहुत बड़े क्षेत्रों की छवि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि एक छोटे एनए पार्श्व संकल्प को कम करेगा । इसके अलावा, मल्टीकलर इमेजिंग को वेवगाइड7का उपयोग करके बहुत सरल बनाया गया है, क्योंकि सिस्टम को पुनः समायोजित किए बिना कई तरंगदैर्ध्य निर्देशित और पता लगाया जा सकता है। यह डीस्टॉर्म के लिए फायदेमंद है, क्योंकि फ्लोरोफोर ब्लिंकिंग को बढ़ाने और मल्टीकलर इमेजिंग के लिए कम तरंगदैर्ध्य का उपयोग किया जा सकता है। यह देखने लायक है कि इवेनसेंट क्षेत्र की प्रवेश गहराई तरंगदैर्ध्य के एक समारोह के रूप में बदल जाएगी, हालांकि यह इमेजिंग प्रक्रिया को कैसे प्रभावित करती है। चिप लाइव सेल इमेजिंग8 के साथ संगत है और माइक्रोफ्लूइडिक्स के एकीकरण जैसे अनुप्रयोगों के लिए आदर्श है। प्रत्येक चिप में दसियों वेवगाइड हो सकते हैं, जो उपयोगकर्ता को विभिन्न परिस्थितियों में छवि बनाने या ऑप्टिकल ट्रैपिंग9 और रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी10लागू करने की अनुमति दे सकते हैं।
चिप आधारित प्रणाली दोनों विवर्तन-सीमित और सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए समान रूप से अच्छी तरह से काम करती है। इसी तरह का दृष्टिकोण 2005 में एक चश्मे का उपयोग करके इवेनसेंट क्षेत्र उत्तेजना4उत्पन्न करने के लिए पेश किया गया था । फोटोनिक चिप भी evanescent क्षेत्र के माध्यम से उत्तेजित है, लेकिन आधुनिक तरंग चिकित्सा निर्माण तकनीकों के साथ, एक तरंग गाइड के साथ विदेशी प्रकाश पैटर्न उत्पन्न कर सकते हैं । वर्तमान चिप आधारित नैनोस्कोपी कार्यान्वयन केवल 2डी इमेजिंग तक सीमित है, क्योंकि उत्तेजना क्षेत्र तरंग गाइड सतह के अंदर बंद है। भविष्य के विकास के लिए 3 डी अनुप्रयोगों के लिए लक्ष्य होगा। इसके अतिरिक्त, एक ही चिप आधारित माइक्रोस्कोप11का उपयोग करके संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी जैसी अन्य सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीकें विकसित की जा रही हैं।
चिप आधारित इमेजिंग पारंपरिक डीस्टॉर्म इमेजिंग के समान है। छवि की गुणवत्ता इस प्रकार पारंपरिक डीतूफान इमेजिंग के लिए के रूप में एक ही दृष्टिकोण का उपयोग कर अंदाजा लगाया जा सकता है । उपयोगकर्ता के लिए मुख्य अंतर यह है कि पारदर्शी ग्लास स्लाइड का आदान-प्रदान एक अपारदर्शी सी-वेफर के साथ किया जाता है। हालांकि वे बहुत अलग दिखाई देते हैं, नमूना हैंडलिंग व्यावहारिक रूप से एक ग्लास स्लाइड के अनुरूप है। चिप्स काफी मजबूत कर रहे हैं और आसानी से वेफर चिमटी का उपयोग कर संभाला जा सकता है। इमेजिंग प्रक्रिया और छवि पुनर्निर्माण एक नियमित डीतूफान प्रयोग के रूप में ही है । एक कार्यात्मक चिप आधारित माइक्रोस्कोप स्थापित करने के लिए फोटोनिक चिप्स के अलावा कोई विशेष घटकों की आवश्यकता नहीं है । सेट-अप का अधिक विवरण पिछले कार्य6,7में पाया जा सकता है । इस काम में इस्तेमाल होने वाले चिप्स को स्टैंडर्ड फोटोलिथोग्राफी8का इस्तेमाल करते हुए गढ़े गए हैं ।
नमूना तैयार करने में नमूना कक्ष की तैयारी शामिल है। जब चिप के लिए PDMS फ्रेम संलग्न, यह किसी भी छोटे सिलवटों या rips जहां हवा में प्रवेश कर सकता है से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । यदि पीडीएस इसे संलग्न करते समय सिलवटों, बस इसे ध्यान से एक tweezer के साथ हटा दें और इसे फिर से संलग्न करें। जब पीडीएम चैंबर के अंदर नमूना तैयार हो जाता है, तो कवरग्लास को इसके खिलाफ दबाया जाना चाहिए, क्षेत्र को सील करना चाहिए। कवरग्लास संलग्न करते समय किसी भी हवा के बुलबुले से बचना महत्वपूर्ण है। यदि एक हवा बुलबुला बनता है, तो धीरे-धीरे कवरग्लास को हटा दें और नमूना कक्ष में पीबीएस जोड़ें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि नमूना कवर किया गया है। कवर स्लिप की तैयारी और लगाव को फिर से किया जा सकता है।
तरंग गाइड में युग्मन प्रकाश इस कागज में प्रस्तावित प्रोटोकॉल का उपयोग सरल बनाया गया है। हालांकि, कुछ आम चुनौतियां हैं जो युग्मन को सीमित कर सकती हैं । सबसे पहले, अगर चिप ठीक से साफ नहीं किया गया था और किसी भी बचे हुए PBS पूरी तरह से हटा दिया, वहां गंदगी या वेवगाइड पर सघन PBS हो सकता है । इससे बड़ा नुकसान शुरू हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप इमेजिंग क्षेत्र में बहुत कम शक्ति होती है । कवर ग्लास के बाहर क्षेत्र को साफ करने के लिए एक नम झाड़ू का उपयोग करने से बिजली में काफी सुधार हो सकता है। दूसरे, यदि वेवगाइड का युग्मन पहलू क्षतिग्रस्त हो जाता है (उदाहरण के लिए, अनुचित हैंडलिंग द्वारा), युग्मन हानि में भारी वृद्धि हो सकती है। किनारे के ऑप्टिकल निरीक्षण आमतौर पर किसी भी नुकसान आसानी से प्रकट होगा । चिप के पूरे युग्मन पहलू को ध्यान से पॉलिश किया जा सकता है, बहुत एक ऑप्टिकल फाइबर की तरह, और एक चिकनी युग्मन पहलू है, जो तो युग्मित शक्ति बढ़ जाती है दे देंगे ।
प्रकाश के युग्मित होने के बाद, इमेजिंग प्रक्रिया किसी भी पारंपरिक डीस्टॉर्म सेटअप में समान है। यदि छवि में असंगत उत्तेजना है, जैसा कि चित्रा 2एमें प्रदर्शित किया गया है, तो सबसे अधिक संभावना है कि औसत मोड अच्छी तरह से काम नहीं करता था। इसके लिए दो सबसे आम कारण हैं: 1) औसत स्टैक बनाने के लिए बहुत कम छवियां और 2) एक दोलन दूरी से बहुत कम/ बहुत कम छवियों को इकट्ठा करना कुछ उत्तेजना पैटर्न छोड़ सकता है और औसत इस प्रकार समरूप होगा। यह आसानी से औसत ढेर में छवियों की संख्या में वृद्धि करके हल किया जा सकता है। एक दोलन दूरी से बहुत कम भी एक असंगत छवि में परिणाम कर सकते हैं, के रूप में पर्याप्त मोड पैटर्न उत्साहित नहीं हैं । इससे दोलन की दूरी बढ़ाकर और/या स्टेप साइज कम होने से भी आसानी से सुलझाया जा सकता है । इस काम में हमने 20 माइक्रोन से अधिक इनपुट लेजर बीम को स्कैन करने और कम से कम 300 छवियों को प्राप्त करने के लिए एक पीजो चरण का उपयोग किया है। एक अन्य दृष्टिकोण एक अधिग्रहण समय के भीतर इनपुट वेवगाइड पहलू में प्रकाश को स्कैन करने के लिए उच्च गति वाले गैलवो-दर्पण का उपयोग करना हो सकता है, जैसे कि 10-30 सुश्री। यह विकल्प लाइव सेल टीआईआरएफ इमेजिंग के लिए उपयुक्त है, जहां उप-सेलुलर ऑर्गेनेल्स लगातार गति में हैं।
चिप आधारित डीस्टॉर्म एक अभूतपूर्व बड़े क्षेत्र TIRF उत्तेजना प्रदान करता है, जो इसे आदर्श रूप से उच्च थ्रूपुट इमेजिंग के लिए अनुकूल बनाता है। कॉम्पैक्ट चरित्र वाणिज्यिक प्रणालियों के लिए रेट्रोफिटिंग के लिए अनुमति देता है, जहां चिप उल्टे सेटअप या पारदर्शी सब्सट्रेट्स के लिए उल्टा रखा जा सकता है विकसित किया जा सकता है । चिप्स बड़े पैमाने पर गढ़े जाते हैं और कई जरूरतों के अनुरूप संशोधित किया जा सकता है। वर्तमान में, मुख्य प्रतिबंध यह है कि यह 2D तक सीमित है। वाष्पित क्षेत्र केवल तरंग गाइड सतह से लगभग 200 एनएम दूर उपलब्ध है, इसलिए इस क्षेत्र के भीतर केवल फ्लोरोफोरस उत्साहित होंगे। कुल मिलाकर, एकीकृत प्रकाशिकी का क्षेत्र निकट भविष्य में चिप आधारित माइक्रोस्कोपी के लिए कई अवसर प्रदान करता है, नए इमेजिंग प्रश्नों से निपटने के साथ-साथ मौजूदा लोगों को नई संभावनाएं प्रदान करके ।
The authors have nothing to disclose.
लेखक यूरोपीय अनुसंधान परिषद (अनुदान संख्या ३३६७१६ को बीए) स्वीकार करना चाहते हैं । लेखक भी रिकॉर्डिंग और वीडियो संपादन के साथ उसकी अमूल्य सहायता के लिए Irati Lagfragua शुक्रिया अदा करना चाहते हैं ।
1-axis sample stage | Standa | 7T173-20 | |
2-axis sample translation stage | Mad City Labs | Custom order | |
3-axis NanoMax stage | Thorlabs | MAX311D | |
BXFM microscope body | Olympus | OLY-LSM-037018 | |
CellMask Deep Red, Life technologies | ThermoFisher | C10046 | |
Cleanroom grade swabs | MRC Technology | MFS-758 | |
Fiber-coupled laser | Cobolt | Flamenco | |
Filter Holder | Homemade | ||
Hellmanex III, Hellma Gmbh | Sigma-Aldrich | Z805939 | Cleaning detergent concentrate |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 563935-1L | |
KL 1600 LED | Olympus | OLY-LSM-E0433314 | |
Olympus Coupling lens | Olympus | LMPLFLN 50x/0.5 | |
Orca Flash 4.0 V2 | Hamamatsu | ||
PBS tablets | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | Mix according to descriptions |
SYLGARD 184 Silicone Elastomer 1.1 kg kit | Dow | 1673921 | |
Tip-tilt stage | Thorlabs | APR001 | |
Vacuum holder | Thorlabs | HWV001 | |
Wafer Tweezers Type 2W | Agar scientific | AGT5051 |