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Bioengineering

Fabbricazione e implementazione di una piattaforma di microscopia della forza di trazione senza riferimenti

Published: October 6, 2019 doi: 10.3791/60383
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Department of Biomedical Engineering, University of Delaware, 2Department of Materials Science & Engineering, University of Delaware, 3Delaware Biotechnology Institute

Summary

Questo protocollo fornisce istruzioni per l'implementazione della litografia multifotone per fabbricare array tridimensionali di marcatori fiduciari fluorescenti incorporati in idrogel a base di poli(etilene glicole) per l'uso come microscopia a forza di trazione senza riferimenti Piattaforme. Utilizzando queste istruzioni, la misurazione della deformazione del materiale 3D e il calcolo delle trazioni cellulari è semplificata per promuovere misurazioni della forza di trazione ad alta produttività.

Abstract

La quantificazione della deformazione del materiale indotta dalle cellule fornisce informazioni utili sul modo in cui le cellule rilevano e rispondono alle proprietà fisiche del loro microambiente. Sebbene esistano molti approcci per misurare la deformazione dei materiali indotta dalle cellule, qui forniamo una metodologia per monitorare la deformazione con risoluzione sub-micron in modo privo di riferimenti. Utilizzando un processo di modellazione fotolitografica attivata a due fotoni, dimostriamo come generare substrati sintetici meccanicamente e bio-attivamente regolabili contenenti array incorporati di marcatori fiduciali fluorescenti per misurare facilmente tridimensionali ( 3D) profili di deformazione del materiale in risposta alle trazioni superficiali. Utilizzando questi substrati, i profili di tensione delle cellule possono essere mappati utilizzando una singola pila di immagini 3D di una cella di interesse. Il nostro obiettivo con questa metodologia è quello di rendere la microscopia a trazione uno strumento più accessibile e più facile da implementare per i ricercatori che studiano i processi di meccanotrazione cellulare, in particolare i nuovi arrivati sul campo.

Introduction

La microscopia a forza di trazione (TFM) è il processo di approssimazione delle trazioni cellulari utilizzando campi di spostamento interpolati di marcatori fiduciari generati da una cellula aderente e contrattile. Utilizzando TFM, l'influenza dei segnali meccanici nell'ambiente extracellulare su importanti processi cellulari come la proliferazione, la differenziazione e la migrazione può essere studiata1,2,3,4 ,5,6,7,8,9,10,11,12. Sfortunatamente, molti approcci esistenti possono essere difficili da implementare o richiedono familiarità con strumenti analitici e computazionali altamente specializzati che rendono la TFM difficile da usare per i ricercatori inesperti. Descriviamo una metodologia per generare una piattaforma TFM che elimina alcune delle difficoltà nell'analisi, fornendo allo stesso tempo l'acquisizione di dati ad alto eveloce.

Tra gli attuali approcci TFM, i più comunemente utilizzati per quantificare la deformazione del ceppo materiale comporta l'incorporazione di piccoli marcatori fluorescenti (tipicamente perline fluorescenti di dimensioni nanometriche o micrometriche) in un idrogel deformabile, come la poliacrilammide (PAA) o il polimetro (etilene glicole) diacrilato (PEGDA)13,14,15. Questi approcci basati sul tallone forniscono la capacità di ammassare densamente marcatori fiduciari intorno a una cella di interesse per massimizzare il campionamento di spostamento. Sfortunatamente, la distribuzione delle perline in tutto l'idrogel non può essere controllata direttamente, quindi l'organizzazione spaziale è casuale. Questo posizionamento casuale porta a problemi come perline che sono troppo vicine l'una all'altra per risolvere con precisione, o così diffuse che le patch del substrato producono dati di bassa qualità. L'incapacità di prevedere dove si trovano i marcatori fiduciari in assenza di cellule crea anche un vincolo che, per ogni insieme raccolto di dati di trazione cellulare, deve essere acquisita anche un'immagine di riferimento aggiuntiva dei marcatori sottostanti in uno stato rilassato. L'immagine di riferimento è necessaria in modo che lo spostamento nell'immagine sollecitata possa essere approssimato come differenza tra le immagini sollecitate e non sollecitate. Per ottenere uno stato rilassato, le cellule misurate sono chimicamente rilassate o completamente rimosse. Questo processo spesso impedisce l'acquisizione di ulteriori misurazioni sperimentali, inibisce gli studi sulle cellule a lungo termine e limita la produttività. Un'immagine di riferimento richiede anche tecniche di registrazione delle immagini per accogliere la deriva che potrebbe essersi verificata durante la sperimentazione, spesso portando a un ingombrante abbinamento manuale delle immagini dello stato di sollecitazione alle immagini di riferimento.

Altri metodi TFM considerati privi di riferimento, implementano una qualche forma di controllo sulla distribuzione dei marcatori fiduciari, sia mediante litografia ad alta risoluzione, stampa di microcontatto o micromolding16,17,18 ,19,20. La TFM senza riferimenti si ottiene presupponendo che lo stato rilassato per ogni marcatore fiduciario possa essere previsto in base al modo in cui le posizioni dei marcatori sono state prescritte durante il processo di fabbricazione. Questi metodi consentono di acquisire completamente lo stato di tensione di una cella all'interno di una singola acquisizione di immagine in cui gli spostamenti dei marcatori fiduciari vengono misurati rispetto a un riferimento implicito di quanto possa essere dedotto dalla geometria del marcatore fiduciario. Mentre la coerenza nel posizionamento dei marcatori è in genere raggiunta utilizzando queste piattaforme, in genere soffrono di carenze proprie rispetto agli approcci basati sul tallone ampiamente utilizzati, tra cui: 1) diminuzione della risoluzione di trazione; 2) diminuzione della precisione degli spostamenti fuori piano (in alcuni casi una completa incapacità di misurare); e 3) diminuzione della personalizzazione dei substrati e dei materiali della piattaforma (ad esempio, presentazione del ligando, proprietà meccaniche).

Per far fronte a queste carenze, abbiamo progettato una nuova piattaforma TFM senza riferimenti. La piattaforma utilizza la chimica attivata multifotone per incrociare un piccolo volume di un fluoroforo in specifiche posizioni 3D all'interno dell'idrogel che fungono da marcatori fiduciali per misurare la varietà del materiale. In questo modo, abbiamo progettato una piattaforma che opera in modo simile ad approcci basati su perline, ma con il vantaggio significativo che i marcatori fiduciali sono organizzati in array grigliati che consentono il tracciamento della deformazione dei materiali senza riferimenti. Questa proprietà senza riferimenti offre molti vantaggi. In primo luogo, permette un monitoraggio non intrusivo degli stati di trazione cellulare (cioè, elude la necessità di rilassare o rimuovere le cellule per acquisire posizioni di riferimento di marcatori fiduciari spostati). Questo era il nostro obiettivo primario nella progettazione di questo sistema, in quanto avevamo intenzione di incorporare altri metodi analitici a valle in tandem con TFM, che può essere difficile con approcci TFM di fine punto distruttivi. In secondo luogo, l'utilizzo di un riferimento implicito basato su array grigliati consente un'automazione quasi completa dell'analisi dello spostamento. La regolarità delle matrici crea un flusso di lavoro prevedibile in cui la occorrenza di casi eccezionali (ad esempio, dati di cella di esempio contenenti artefatti imprevisti, ad esempio spaziatura dei marcatori non ottimali o mancata corrispondenza di registrazione) può essere mantenuta al minimo. In terzo luogo, l'ocquali dire la necessità di acquisire un'immagine di riferimento offre la libertà di monitorare molte celle su un singolo campione per lunghi periodi di tempo. Questo contrasta con gli approcci tradizionali basati sul tallone, dove, a seconda della fedeltà dei movimenti automatici dello stadio del microscopio, gli errori di posizionamento possono accumularsi e aumentare la difficoltà di registrare correttamente le immagini di riferimento alla tensione cellulare Immagini. Nel complesso, questa piattaforma facilita una maggiore velocità effettiva nella raccolta dei dati di tensione cellulare.

Con questo protocollo, speriamo di familiarizzare i lettori con la tecnica litografia a scansione laser a due fotoni che abbiamo implementato per generare questa piattaforma TFM senza riferimenti per misurare i componenti di trazione in piano e fuori piano generati dalle cellule semi-seme sulla superficie. Non trattata in questo protocollo è la sintesi di alcuni dei componenti monomerici. In generale, queste reazioni includono schemi di reazione di sintesi di sintesi quasi identici "one-pot" descritti in precedenza21, e alternative a questi prodotti possono anche essere acquistati. Il nostro obiettivo è anche quello di familiarizzare i lettori con gli strumenti basati su software che abbiamo generato per promuovere l'uso di microscopi a scansione laser disponibili in commercio come strumenti di stampa 3D e per facilitare l'analisi degli spostamenti dei marcatori fiduciari.

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Protocol

1. Fotopolimerizzare un idrogel di base PEGDA

  1. Raccolta di reagenti
    1. Raccogliere fenilio di litio-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP), 3.4 kDa poli(ethylene) diacritaglio glicole (PEGDA), n-vi Pirrodonenyl (NVP), AlexaFluor 488 con etichetta PEGDA (PEG-488), AlexaFluor 633 con etichetta PEGDA (PEG-633) e peptide RGDS PEGylated ( PEG-RGDS) dai rispettivi congelatori e portare ciascuno a temperatura ambiente.
    2. Nei tubi separati di microcentrismo d'ambra, misurare 3 mg di LAP, 10 mg di PEGDA, 5 mg di PEG-488, 20 mg di PEG-633 e 6 mg di peptide RGDS.
  2. Preparazione della soluzione pre-polimero
    1. Sciogliere il LAP in 1 mL di salina tampina bufferdi fosfato (PBS, pH 7.4). Utilizzare 200 l della soluzione LAP disciolta per sciogliere il PEGDA. Quindi, utilizzare 200 l della soluzione PEGDA per sciogliere il PEG-RGDS.
      NOTA: Se si desidera il controllo della forma delle cellule, omettere la dissoluzione PEG-RGDS nella soluzione prepolimeria dell'idrogel di base, in quanto verrà aggiunta tramite due fotoni, la litografia a scansione laser più avanti nel protocollo.
    2. Utilizzare 80 l di PBS per sciogliere il PEG-488. Aggiungere 2,5 l di questa soluzione alla soluzione prepolimerica.
      NOTA: Il PEG-488 darà all'idrogel finale un segnale fluorescente che può essere utilizzato per navigare durante il patterning e la concentrazione può essere modificata per alterare l'intensità del segnale.
    3. Filtrare la soluzione prepolimerica completa con un filtro PTFE (polytetrafluoroeetilene) da 0,2 m per rimuovere eventuali particolato presenti nella soluzione. Se i reattori sono correttamente sintetizzati, il filtro non deve intasarsi.
  3. Fotopolimerizzo dell'idrogel di base
    1. Mettere 3 -L della soluzione prepolimea su un sottile foglio piatto di alcaci perfluoroalkoxy (PFA). Posizionare le strisce piatte di polidimero (PDMS) spesse 150 m che circondano, ma non a contatto con, la caduta della soluzione prepolimerica. Posizionare una coverslip a listepe a acrilata21,22,23,24 sul PDMS - con la gocciolina prepolimerica centrata sotto la coverslip - per appiattire la goccia prepolime Distanziali PDMS.
    2. Esporre la soluzione prepolimerica inserita alla luce UV fino a quando un idrogel è completamente formato (circa 1 min a 14 mW/cm2 di 370-400nm luce).
    3. Separare con cura il coperchio dai distanziali PDMS e collegarlo a un piatto Petri a fondo aperto utilizzando un adesivo acrilico a doppio lato ad alte prestazioni. Applicare la pressione sulla superficie di contatto adesiva per creare una guarnizione completa tra la coverslip, l'adesivo e il piatto Petri, con la cura di non rompere il vetro.
    4. Sciacquare l'idrogel nella parabola di Petri utilizzando PBS sterilemente filtrato per ridurre al minimo i contaminanti biologici e particolati.
    5. Ripetere i passaggi da 1.3.1-1.3.4 necessari per creare il numero desiderato di idrogel.
    6. Aggiungete 8 Ll di NVP alla soluzione rimanente di 800 L l di LAP e conservate questa soluzione, oltre a un PEG-633 non dissolto, fino a quando non saranno pronte per la ripetizione.
      NOTA: La soluzione LAP con NVP è molto sensibile alla luce e polimerizzerà se non tenuta al buio. Avvolgere il tubo in un foglio di alluminio può contribuire a migliorare la sua durata di conservazione.

2. Creazione di istruzioni di patterning

  1. Progettazione di un'immagine binaria
    1. Per creare una maschera virtuale per la prescrizione di array di marcatori fiduciari, utilizzare un software di elaborazione delle immagini o di disegno per creare un'immagine con proporzioni di 100:1 (ad esempio, 2000 pixel di lunghezza x 20 pixel di larghezza).
    2. Creare una riga di 100 pixel bianchi equidistanti su uno sfondo nero centrato lungo l'asse lungo dell'immagine.
    3. Salvare l'immagine come tipo di file con estensione tif.
      NOTA: se si desidera che il controllo della forma delle cellesia 21,25,26,27,28, creare una maschera virtuale aggiuntiva. Utilizzare una tela immagine a forma quadrata e creare caratteristiche bianche positive su uno sfondo nero. Per approssimare una dimensione appropriata per le caratteristiche bianche (che alla fine supporteranno l'adesione cellulare) presuppongono che la dimensione totale dell'immagine sia equivalente alla dimensione del campo di visualizzazione del microscopio utilizzato per la litografia a scansione laser.
  2. Conversione di un'immagine binaria in una maschera digitale
    1. Scaricare le funzioni LSM-ROI-Generator disponibili gratuitamente nell'archivio software29.
    2. Aprire Matlab e trovare la directory dei file delle funzioni scaricati. Una volta nella directory, aprire lo script run_script.m Matlab ed eseguire lo script.
    3. Selezionare il file binario tif per la conversione. Quindi, selezionare una cartella per salvare i file delle regioni.
    4. Immettere la dimensione finale desiderata, in micron, dell'immagine selezionata. L'immagine di input verrà ridimensionata e quotata in base a questi parametri. Affinché l'intera immagine si adatti al campo di visualizzazione del microscopio, la dimensione totale dell'immagine deve essere inferiore o uguale alla dimensione del campo di visualizzazione del microscopio.
    5. Se si crea una singola matrice di pixel, in Opzioni del generatore di ROI, assicurarsi di deselezionare la casella di controllo Rimuovi in Piccole regioni/Pixel singoli, per selezionare la casella di controllo Quadratie per deselezionare Usa in Linee di interruzione orizzontali. Quindi, fare clic su OK.
      NOTA: se si crea un file di regioni per creare modelli di celle singole, le opzioni di default sono appropriate.
    6. Trovare il file con estensione ovl risultante nella cartella specificata in precedenza. Questo file deve essere portato al microscopio per caricare le regioni desiderate che controllano l'otturatore laser durante la litografia a scansione laser a due fotoni.

3. Fabbricazione di array di marcatori fiduciari

  1. Immergere l'idrogel di base
    1. In condizioni di scarsa illuminazione, aggiungere 200 l della soluzione LAP/NVP all'AF633 (entrambi preparati nel passaggio 1). Mescolare accuratamente proteggendo dalla luce.
    2. Rimuovere tutta la soluzione PBS dalla parabola Petri contenente un idrogel PEGDA dal passaggio 1.
    3. Aggiungere il PEG-633 disciolto all'idrogel per formare una goccia che racchiude completamente l'idrogel di base.
      NOTA: Se il foro nella piastra Petri è solo leggermente più grande dell'idrogel, può servire come un bene per tenere la soluzione di patterning. In caso contrario, assicurarsi che il coperchio sia completamente asciutto prima di aggiungere la soluzione di modellazione o potrebbe fuoricorrere l'idrogel causando la disidratazione dell'idrogel durante la modellazione.
    4. Caricare il piatto Petri sul portacampioni sullo stadio del microscopio e posizionare il coperchio sul piatto Petri. Lasciare in ammollo la soluzione di patterning nell'idrogel per almeno 30 min al buio.
      NOTA: il microscopio può essere acceso e configurato durante questo periodo di ammollo. Usare il laser da 488 nm per l'immagine dell'idrogel durante l'ammollo va bene.
  2. Configurazione del microscopio
    1. Utilizzando una linea laser da 488 nm e i filtri appropriati per l'immagine di AlexaFluor 488, individuare l'idrogel utilizzando il segnale PEG-488. Bloccare la raccolta di lunghezze d'onda a emissione più lunghe dal rivelatore in quanto queste saranno sature di segnale dal PEG-633.
    2. Trova il centro dell'idrogel nel piano XY utilizzando scansioni di piastrelle verticali e orizzontali e azzera la posizione dello stage qui.
    3. Trovare la superficie dell'idrogel utilizzando le scansioni di linea e la funzione z-stack. Azzerare la posizione di messa a fuoco qui. Livellare l'idrogel ripetendo queste scansioni di linea lontano dal centro XY per identificare la posizione della superficie e regolare le viti impostate per lo stadio del microscopio.
    4. All'interno dell'area di lavoro del software al microscopio, creare un file di esperimento separato per il fotopatterning. Impostare la potenza multifotona su 1,8% (15,5 mW a 740 nm misurata all'apertura posteriore dell'obiettivo) e la velocità di scansione su 6 (0,1 m/z). Regola tele del fotogramma dell'immagine in pixel per ottenere una dimensione in pixel di 0,1 m per pixel e una proporzione di 100:1.
    5. Caricare il file delle regioni (con estensione ovl) creato nel passaggio 2.2 nella scheda Regioni.
    6. Attivare la funzione z-stack e impostare la spaziatura su 3,5 m per una profondità totale di 28 m e un numero totale di fette z di 9.
    7. Utilizzare la funzione positions per impostare posizioni specifiche sull'idrogel in cui verranno fotodizzati gli array di marcatori fiduciali.
      NOTA: La posizione z di queste posizioni determinerà la posizione centrale di ogni z-stack; quando si posizionano le posizioni, assicurarsi che ogni posizione garantisca che il volume modellato si sovrapponga con l'idrogel in tutte le posizioni della superficie.
    8. Utilizzare la funzione di tessera per specificare righe e colonne aggiuntive in ogni posizione. Prestare attenzione a evitare la sovrapposizione di aree con motivi. Idealmente, assicurarsi che le aree con motivi siano abbastanza vicine da rimuovere le posizioni vuote e inutilizzabili tra le posizioni.
  3. Fotopatterning degli array di marcatori fiduciari
    1. Quando il tempo di ammollo si avvicina al segno di 30 minuti, prendere successive scansioni di linea z-stack della superficie dell'idrogel ogni 5 min per verificare il gonfiore in base alle variazioni nella posizione della superficie rispetto alla posizione di messa a fuoco azzerata.
    2. Se non si verifica alcuna modifica nella posizione della superficie su un intervallo di 5 min, caricare ed eseguire le impostazioni di modellazione create nel passaggio 3.2.4
    3. Al termine dell'esecuzione dell'esperimento di modellazione, utilizzare il laser da 488 nm per verificare che la superficie dell'idrogel non si sia spostata durante la ripetizione.
      NOTA: Se la superficie dell'idrogel non si trova nella stessa posizione di prima del patterning, esistono diversi scenari. L'idrogel non aveva raggiunto l'equilibrio gonfiante prima del patterning, l'idrogel ha cominciato ad asciugarsi durante il patterning, o il microscopio ha sperimentato z-drift. L'origine di questa traslazione di superficie deve essere identificata e corretta nelle esecuzioni di modellisuccessive.
    4. Togliere l'idrogel dal microscopio e aspirare la soluzione PEG-633 dalla parabola Petri.
      NOTA: L'idrogel è ancora estremamente sensibile alla luce. Mantenere l'idrogel al buio è molto importante fino a quando tutto il risciacquo è completo.
    5. Sciacquare l'idrogel 3 volte con PBS filtrato sterile, assicurandosi di rimuovere completamente il risciacquo tra ogni risciacquo successivo. Ripetere questo triplo risciacquo ogni 15 min per 1 h.
    6. Lasciare che l'idrogel si risciacqua in PBS durante la notte.
      NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.
    7. Risciacquare triplicare l'idrogel con PBS. Quindi triplicare rapidamente l'idrogel con una soluzione di etanolo a 200 prove, seguito da un altro triplo risciacquo con PBS. Non lasciare che l'idrogel si sieda in 200 prova etanolo per lunghi periodi di tempo.
      NOTA: Alcuni componenti della soluzione di patterning possono schiantarsi fuori soluzione e depositarsi sulla superficie dell'idrogel e appaiono come un solido strato di fluorescenza (spesso 1-5 micron) sotto l'illuminazione di 633 nm. Il risciacquo con 200 etanolo di prova dovrebbe rimuovere questi componenti indesiderati.
  4. Utilizzo di fotopattern successivi per generare modelli a cella singola (facoltativo)
    NOTA: Se si desidera controllare l'area di diffusione delle celle e la forma, è possibile eseguire più cicli di patterning. Il gel di base deve avere PEG-RGDS omesso dalla sua formulazione iniziale. Si raccomanda di eseguire per ultimo il patterning degli array di marcatori fiduciari per evitare lo sbiancamento dei marcatori fiduciari fluorescenti.
    1. Sciogliere 20 mg di PEG-RGDS nella soluzione LAP/NVP preparata nel passaggio 1.
    2. Ripetere i passaggi da 3.1 – 3.3 utilizzando la soluzione PEG-RGDS anziché la soluzione PEG-633. Utilizzare il file delle regioni appropriato che definisce i modelli di celle singole (vedere il passaggio 2 per istruzioni).
      NOTA: per visualizzare le matrici di modelli PEG-RGDS, sono disponibili diverse opzioni. Una variante fluorescente di PEG-RGDS può essere utilizzata21,30 o peg-RGDS può essere dopato con PEG fluorescente. Consigliato: In alternativa, la linea laser da 488 nm può essere eseguita in tandem con il laser multifotone per sbiancare il segnale PEG-488 nell'idrogel di base, creando regioni non fluorescenti che coincidono con l'incorporazione RGDS.

4. Visualizzazione di array di marcatori fiduciari

  1. Acquisizione di un'immagine z-stack dell'array fabricated
    1. Sostituire PBS nel piatto Petri con i supporti cellulari utilizzati per la coltura cellulare.
      NOTA: Si raccomanda l'uso di supporti liberi rossi Fenolo per l'uso durante l'acquisizione dell'immagine per prevenire la fototossicità.
    2. Dopo 1 h di tempo di ammollo, utilizzare un microscopio a fluorescenza widefield dotato di un modulo di illuminazione strutturato e di una lente ad alta ingrandimento dell'immersione dell'acqua per visualizzare gli idrogel utilizzando un set di filtri appropriato per i marcatori fiduciari fluorescenti.
    3. Raccogliere uno z-stack ad alta risoluzione di immagini (distanziate di 0,4 m in z) che comprendono almeno 20 m di profondità dalla superficie dell'idrogel nell'idrogel nell'area con motivi, assicurandosi che il limite superiore dello z-stack includa almeno 1-2 immagini fisicamente al di sopra area modellata (cioè dove i marcatori fiduciari fluorescenti non sono più visibili e solo il rumore è presente).
      NOTA: l'acquisizione di questa pila di immagini è necessaria per verificare che tutti i parametri di patterning siano corretti e possano essere analizzati insieme ai dati delle celle nel passaggio 5.3.

5. Esecuzione di TFM con idrogel fotodizzati

  1. Seeding Cells
    NOTA: Per mantenere la sterilità, seguire tutte le pratiche standard di coltura dei tessuti.
    1. Prima del seeding cellulare, seguire i protocolli standard per la rispettiva linea cellulare per la coltura cellulare e la manutenzione.
    2. (Facoltativo) Se la sterilità dell'idrogel è una preoccupazione, incubare l'idrogel per 24 h in supporti contenenti antibiotici seguiti dal risciacquo con i normali mezzi di comunicazione.
    3. Per le cellule di semi, prima sospendere le cellule tripsinizzate nel volume finale dei supporti da utilizzare nella parabola di idrogel Petri.
    4. Rimuovere tutta la soluzione dalla parabola idrogel e sostituirla con il supporto carico di cellule.
    5. Lasciare che l'idrogel resti indisturbato nei supporti carichi di cellule per 10 min.
    6. Spostare con cura il piatto Petri in un'incubatrice. Mantenere le cellule nell'incubatrice per 4 h o fino a quando le cellule sono visibilmente aderenti.
    7. Sostituire il supporto carico di celle con supporti privi di celle per rimuovere le celle non comprese.
  2. Acquisizione di immagini di cellule e marcatori fiduciari
    1. Impostare la temperatura per la camera di incubazione al microscopio a 37 gradi centigradi e da2 a 5% e consentire alla camera di raggiungere i punti prestabiliti.
    2. Posizionare il piatto Petri sul supporto del campione e individuare le aree modellate.
    3. Individuare una cellula di interesse (COI) e acquisire un'immagine trasmessa o fluorescente del COI.
      NOTA: Questa immagine verrà utilizzata per segmentare il contorno della cella durante l'analisi, quindi l'immagine dovrebbe visualizzare chiaramente i bordi delle celle.
    4. Acquisire uno z-stack dell'array con motivi sotto il COI come nel passaggio 4.1.4.
    5. Acquisire una seconda serie di immagini trasmesse o fluorescenti della cella.
      NOTA: Confrontare la seconda immagine impostata sulla prima per determinare se il danno cellulare a causa della fototossicità viene osservato e se le impostazioni di acquisizione dell'immagine devono essere regolate. Le cellule che si restringono dopo l'esposizione hanno probabilmente subito effetti fototossici significativi, che possono influenzare i risultati.
    6. Ripetere i passaggi 5.2.3-5.2.5 per ogni COI.

6. Analisi delle immagini

  1. Preparazione dei file di immagine per l'analisi
    1. Utilizzando i dati raccolti nel passaggio 5.2, preparare una pila di immagini ritagliate dell'area intorno a un COI in modo che l'immagine inferiore (prima immagine) della pila rappresenti il primo fotogramma in cui: (1) >80% delle colonne del marcatore con motivi sono visibili, (2) l'immagine più in alto (ultima immagine) nella pila non contiene più marcatori fiduciari visibili (cioè sopra la superficie dell'idrogel) e (3) vi sono almeno 20 m di marcatori fiduciari non stressati che circondano il COI.
      NOTA: il ritaglio delle immagini riduce notevolmente il tempo di calcolo durante l'analisi. Il codice di analisi nei passaggi successivi può essere eseguito senza ritagliare le immagini, ma questa operazione non è consigliata.
    2. Create un'immagine ritagliata dell'immagine trasmessa e/o fluorescente in modo che corrisponda al ritaglio XY della pila nel passaggio precedente.
    3. Utilizzare l'immagine ritagliata trasmessa o fluorescente, a seconda di quale sia più rappresentativa della forma della cella, per segmentare l'immagine a mano (tracciare il bordo della cella) o tramite gli strumenti di elaborazione delle immagini.
    4. Convertire questa immagine in un'immagine binaria in cui l'interno della cella è nero (ad esempio, l'intensità è 0) e l'area che circonda la cella è bianca (ad esempio, l'intensità è pari a 0). Salvare l'immagine come Binary Mask.tif.
    5. Per ogni COI, raccogliere il file dello stack di immagini, il file di immagine trasmesso e il file maschera binaria in un'unica cartella.
  2. Esecuzione di script di analisi sulle immagini
    1. Clonare o scaricare le funzioni di analisi TFM disponibili gratuitamente nel repository software29. L'intero repository deve essere scaricato in quanto nelle sottocartelle è presente un numero significativo di dipendenze.
    2. Aprire Matlab e aggiungere la directory e tutte le sottocartelle del clone locale del repository di codice al percorso.
    3. Impostare la directory all'interno dell'area di lavoro di Matlab sul percorso della cartella in cui sono state archiviate le immagini preparate nel passaggio 6.1.
    4. Aprire ed eseguire lo script tracking.m. Quando richiesto, seguire le istruzioni per caricare le immagini appropriate, eseguire i passaggi di pre-elaborazione iniziali e controllare l'algoritmo di rilevamento degli errori.
    5. Una volta completato lo script, aprire ed eseguire la funzione dispShear.m. Questo script non deve richiedere l'input dell'utente.
    6. Una volta completato lo script dispShear.m, aprire ed eseguire disp3D.m. Se viene richiesto di aprire le immagini, seguire le istruzioni.
      NOTA: durante il runtime, lo script può chiedere all'utente di disegnare una linea su un'immagine dell'array di modelli. Questa linea deve rappresentare l'asse di movimento primario del laser di scansione durante la ripetizione e deve allinearsi con una fila di marcatori fiduciari con motivi. Questo processo indica al codice la direzione (ovvero righe o colonne di marcatori fiduciari) che probabilmente restituisce le righe più allineate di indicatori fiduciari.
    7. Una volta completato il codice dispShear.m, eseguire il codice dispSurface.m seguito dal codice interpFinal3D_2.m. Questi script non devono richiedere input da parte dell'utente.
      NOTA: lo script interpFinal3D_2.m converte i dati di spostamento in trazioni di superficie utilizzando un software ottenuto esternamente, che è stato descritto in precedenza31. Per applicare queste funzioni esterne, interpFinal3D_2.m interpola i dati di spostamento in griglie uniformi per fungere da input per le funzioni di conversione. Se si utilizza un metodo di conversione diverso o se le trazioni non sono necessarie, questo passaggio può essere saltato.
    8. Una volta eseguiti tutti gli script, verificare che tutti i dati e gli output siano disponibili nella directory iniziale.
    9. Ripetere i passaggi 6.2.3 – 6.2.8 per ogni COI.
      NOTA: all'interno del repository di codice, è presente una cartella contenente gli script che consentono l'esecuzione in batch automatica di ciascuno degli script in un elenco di directory. Fare riferimento agli script di automazione stessi (ad esempio, commenti all'interno del codice) per istruzioni su come utilizzarli.

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Representative Results

Nel corso del protocollo, vi sono una serie di punti di controllo che forniscono feedback per valutare la qualità della procedura di modellazione. Per fornire alcune informazioni su come valutare i progressi in ciascuno di questi punti di controllo, forniamo risultati rappresentativi di un esperimento vero e proprio. I risultati evidenziano l'applicazione di questo protocollo eseguito su un idrogel fotofatto preparato per l'analisi TFM delle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC). I risultati includono i dati immagine non elaborati e gli output dei dati elaborati in ogni passaggio critico.

Il primo checkpoint si verifica al passaggio 4, una volta che l'array di marcatori fiduciari è stato fotofatto nell'idrogel. Quando si raccoglie uno stack di immagini, le immagini risultanti devono visualizzare una normale serie di feature con motivi (Figura 1A-C) che oscillano in intensità in funzione della posizione z all'interno dello stack di immagini. Se la superficie modellata non era perfettamente livellata, diverse regioni di ogni sezione di immagine possono sembrare fuori fase l'una con l'altra rispetto a queste oscillazioni; questo è previsto e non dovrebbe influenzare l'analisi se non in casi estremi.

I checkpoint rimanenti utilizzano gli output di ciascuno degli script eseguiti durante l'analisi di un determinato COI. Lo script tracking.m fornisce diverse immagini diagnostiche, tra cui una proiezione z di marcatori fiduciari fluorescenti (Figura 2A) per valutare la qualità di pre-elaborazione, un grafico dei centriidi rilevati a colori codificati in funzione della posizione z ( Figura 2B) per valutare la qualità di rilevamento degli oggetti e un grafico di tracce che rappresentano i centriii i marcatori rilevati che sono stati collegati in colonne nella direzione z (Figura 2C) per valutare la qualità di tracciamento degli oggetti.

Per un rilevamento centricidico 3D accurato necessario per calcolare le coordinate di riferimento e gli spostamenti, i marcatori fiduciali fluorescenti dovrebbero assomigliare a forme ellissoidali con intensità che diminuisce radialmente dal centro. Lo script disp3D.m fornisce una traccia di intensità in funzione della posizione z per ogni colonna di funzioni rilevate in un determinato stack di immagini (Figura 3A,B) per valutare la qualità dei profili di intensità del marcatore fiduciario. Sia disp3D.m che dispShear.m insieme forniscono istogrammi di rumore di spostamento misurato inciascunadelle dimensioni delle coordinate cartesiane ( Figura 4A-C) e mappe di calore interpolate di spostamento(Figura 4 E,F). Infine, interpFinal3D_2.m fornisce mappe di calore delle trazioni superficiali calcolate utilizzando codice esternalizzato (Figura 5)31.

Figure 1
Figura 1: Risultati di modellitura tipici.
(A) Immagini fluorescenti di marcatori fiduciari che mostrano fluttuazioni di intensità attraverso la dimensione s dalla superficie dell'idrogel a 12,4 m all'interno dell'idrogel. (B) Un rendering volumetrico elaborato rivela la forma ellissoide dei marcatori fiduciari. (C) Le viste profilo seziose del rendering volumetrico visualizzano i dati grezzi dei marcatori. A,C: Barra della scala n. 5 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Uscite diagnostiche dall'algoritmo di tracciamento delle particelle.
Il software di rilevamento e tracciamento degli oggetti restituisce diverse immagini diagnostiche, tra cui (A) una proiezione ponderata a z dei marcatori fiduciari fluorescenti e (B) un grafico a dispersione delle posizioni dei marcatori con posizione a z codificata a colori. (C) Un output aggiuntivo visualizza una proiezione ponderata in z, come in (A), con rilevamenti 2D da ogni fotogramma collegato in colonne. (D) Uno sguardo più attento a (B) mostra più chiaramente i singoli rilevamenti 2D del colore codificati in base alla posizione z. A: Barra della scala di 20 m. C: Barra della scala n. 5 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Uscite diagnostiche dall'algoritmo di spostamento 3D.
(A, B) I grafici di linea dell'intensità del marcatore in funzione della posizione del fotogramma visualizzano oscillazioni tra i marcatori raggruppati nella direzione verticale. Questi grafici di linea consentono una valutazione qualitativa dell'allineamento della griglia con il piano di imaging, nonché la qualità complessiva dei marcatori fiduciari modellati. (A) Le oscillazioni sovrapposte nell'intensità del marcatore confermano l'allineamento accettabile del piano di imaging con gli array di marcatori fiduciari modellati. L'inclusione di fotogrammi vuoti nella parte superiore di uno stack z consente il calcolo automatico di una soglia di rumore nel software di elaborazione. (B) La scarsa sovrapposizione tra oscillazioni è spesso indicativa di uno scarso allineamento delle griglie modellate con il piano di imaging, ma può anche suggerire che la griglia stessa è disallineata e può produrre scarsi risultati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Uscite diagnostiche dagli algoritmi di spostamento 2D e 3D.
(A-C) Gli istogrammi degli spostamenti misurati in regioni considerate "non deformate" (cioè il rumore di spostamento) forniscono una valutazione quantitativa dell'accuratezza delle linee di riferimento calcolate per l'approssimazione delle posizioni di riferimento dei marcatori. I campi di spostamento forniscono una rappresentazione visiva degli spostamenti misurati sia (D) in piano (taglio) che (E) fuori piano (normale). D: Barra della scala 20 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Output diagnostici dall'algoritmo di conversione Traction.
(A-C) Le sollecitazioni di trazione possono essere calcolate in base ai campi di spostamento interpolati per determinare la trazione totale (B), la trazione di taglio (C)e la trazione normale(D). A: Barra della scala 20 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

L'obiettivo di questo protocollo è quello di fornire un flusso di lavoro che allevia gran parte della difficoltà associata alla generazione e all'analisi dei dati TFM. Una volta preparati, gli idrogel fotodorali sono semplici da usare, richiedendo solo la conoscenza delle pratiche standard di coltura dei tessuti e la microscopia a fluorescenza. L'aspetto senza riferimenti consente una navigazione spensierata sugli idrogel carichi di cellule ed elimina passaggi di elaborazione delle immagini ingombranti come la registrazione delle immagini tra immagini di riferimento e deformate. L'analisi risultante è quasi completamente automatizzata e i dati provenienti da singoli COI possono essere analizzati dall'inizio alla fine in meno di 10 min.

Le sfide principali di questo protocollo derivano dalla fabbricazione dell'idrogel fotofatto. Poiché la maggior parte dei reagenti utilizzati nel protocollo sono sintetizzati internamente, ci aspettiamo che gli utenti con poca esperienza nell'utilizzo di materiali idrogel sintetici possano essere in qualche modo scoraggiati dal tentare questo protocollo. Detto questo, tutti i componenti PEGylated utilizzati in questo protocollo sono sintetizzati da protocolli quasi identici utilizzando reazioni one-pot e molti dei componenti possono essere acquistati da fornitori commerciali.

Questo protocollo richiede anche una certa padronanza sull'uso di microscopi a scansione laser. I parametri di scansione laser devono essere ottimizzati per ogni microscopio diverso, poiché intensità laser, obiettivi e altri componenti del microscopio varieranno, anche tra microscopi dello stesso modello. Un approccio semplice per determinare le migliori impostazioni del microscopio per il fotomodellamento consiste nell'eseguire un pannello di scansioni con impostazioni diverse. Qualsiasi impostazione che influisce sull'esposizione laser totale ricevuta dal campione influirà sulle dimensioni e sulla qualità dei marcatori con motivi. Questo include: velocità di scansione, dimensione dei pixel, numero medio, potenza/intensità/influenza laser, ingrandimento e apertura numerica32,33. Spesso è più facile regolare la potenza del laser e la velocità di scansione e quindi si consiglia di iniziare con questi due parametri. Va anche notato che il software utilizzato per generare regioni file è stato progettato specificamente per la marca di microscopi che usiamo e potrebbe essere necessario essere aumentata per ospitare altre marche di microscopi e modelli. Con le impostazioni fornite nel protocollo, l'utente dovrebbe aspettarsi di generare marcatori ellissidi con profili di intensità gaussiani 3D di dimensioni mezza max a larghezza intera pari a 0,84 x 0,11 m in XY e 3,73 x 0,30 m in . L'algoritmo di rilevamento degli oggetti utilizza un centro di massa di intensità per identificare i centriidi dei marcatori e funziona meglio quando i marcatori presentano un gradiente definito di intensità.

Il risciacquo corretto dell'idrogel e la sua protezione dalla luce e dai contaminanti sono di fondamentale importanza per la coltura cellulare. Come accennato nel protocollo, alcuni dei componenti di modellazione possono schiantarsi fuori soluzione e depositarsi sulla superficie dell'idrogel. Se questi componenti non vengono completamente sciacquati dalla superficie, l'adesione cellulare può essere influenzata in modo imprevedibile. Se esposto alla luce dello spettro UV, anche in piccole dosi, mentre l'idrogel è ammollo nella soluzione di modellazione, la soluzione di modellazione inizierà a polimerizzare e produrrà scarsi risultati. Infine, il particolato trasportato dall'aria o il particolato non filtrato complicheranno l'analisi, soprattutto se sono fluorescenti. Occorre prestare particolare attenzione per impedire a questi contaminanti di entrare nel campione in tutte le fasi del protocollo.

Il codice di analisi stima le posizioni di riferimento dei marcatori fiduciari deformati stimando la matrice originale da marcatori non deformati nella stessa riga o colonna del marcatore deformato. Anche se questo semplifica notevolmente l'analisi, impone anche alcune restrizioni su ciò che può o non può essere analizzato. Come minimo, ogni marcatore deformato analizzato deve avere 2 o più membri di entrambe le colonne e righe di marcatori che non sono deformati in modo che sia possibile fare una stima accurata. Una riga è definita dal gruppo di punti stampati in una scansione a riga singola al microscopio e una colonna è definita da marcatori modellati su un singolo asse verticale utilizzando una funzione z-stack. Questo limita l'analisi a singole celle o piccoli cluster di cellule in base alla lunghezza e alla profondità di ogni area modellata. È importante notare che ciò non viene rimediato posizionando due regioni modellate perfettamente una accanto all'altra. Questo perché, anche se i componenti XY possono allinearsi, non è possibile allineare perfettamente i componenti di posizione z degli array, a meno che la superficie del campione non sia perfettamente livellata sia con il piano focale che con lo stage. Il modo migliore per evitare questa limitazione consiste nell'utilizzare ulteriori cicli di patterning che dettano specificamente il posizionamento dei ligandi di adesione. Se allineata correttamente, l'adesione cellulare può essere limitata alle aree utilizzabili sui modelli.

Il codice di analisi è stato ottimizzato per le matrici quadrate in cui i marcatori sono distanziati di circa 3,5 m tra loro in X e Y. La spaziatura finale varia in base alla fedeltà e al gonfiore, ma ciò non dovrebbe influire notevolmente sulle prestazioni se la spaziatura nella riga è coerente (la variabilità della spaziatura tra righe non influisce sul rilevamento). Mentre il codice può essere eseguito fino al completamento su matrici prescritte in modo diverso, il suo stato corrente può produrre risultati scarsi se le matrici non corrispondono ai parametri elencati di seguito. I nostri obiettivi attuali per il codice di analisi sono includere il supporto per la spaziatura variabile e le matrici triangolari, che possono migliorare la precisione della ricostruzione della trazione e ridurre la distorsione regionale rispetto alle matrici quadrate.

Per concludere, forniamo un approccio alla TFM che consente la facile raccolta e analisi dei dati TFM senza perturbare la funzione cellulare. Il nostro obiettivo con questo approccio è quello di fornire un approccio TFM più accessibile e non intrusivo, senza compromettere la risoluzione e la qualità dei dati TFM. Ci aspettiamo che questa metodologia promuoverà la convergenza della conoscenza biochimica dei fenotipi cellulari con le proprietà fisiche osservate delle cellule.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

O. A. Banda è stato sostenuto dal finanziamento di una borsa di studio NSF IGERT SBE2 (1144726), fondi di avvio forniti dall'Università del Delaware e dal National Institutes of Health/National Cancer Institute IMAT Program (R21CA214299). JHS è sostenuta da finanziamenti da parte del National Institutes of Health/National Cancer Institute IMAT Program (R21CA214299) e del National Science Foundation CAREER Award Program (1751797). L'accesso alle microscopie è stato sostenuto dalle sovvenzioni del NIH-NIGMS (P20 GM103446), della NSF (IIA-1301765) e dello Stato del Delaware. Il microscopio di illuminazione strutturata è stato acquisito con fondi dello State of Delaware Federal Research and Development Grant Program (16A00471). Il microscopio confocale LSM880 utilizzato per la litografia a scansione laser a due fotoni è stato acquisito con una sovvenzione di strumentazione condivisa (S10 OD016361).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrodisc Syringe Filter, 0.2 μm Supor Membrane, Low Protein Binding Pall PN 4602 Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips in-house in-house Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24
Axio-Observer Z1 w/Apotome Zeiss Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM.
Chameleon Vision ii Coherent Inc. Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography.
Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil 3M Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes.
Flexmark90 PFW Liner FLEXcon FLX000620 Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter.
LSM-880 Zeiss Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography.
MATLAB Mathworks R2018a Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data.
Model SC Plotter USCutter SC631E Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes.
Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27 Zeiss Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM.
PEG-AF633 in-house in-house Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21
PEG-DA in-house in-house Base material for hydrogels. See reference: 21
PEG-RGDS in-house in-house RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21
Petri Dishes CELLTREAT 229638 8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 3097358-1004 For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS).
Syringe, Leur-Lok, 1 mL BD 309628 Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
UV Lamp UVP Blak-Ray® B-100AP Polymerizes base hydrogel.
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) Sigma-Aldrich V3409-5G Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography.

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References

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Banda, O. A., Slater, J. H. Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform. J. Vis. Exp. (152), e60383, doi:10.3791/60383 (2019).

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