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Bioengineering

无参考牵引力显微镜平台的制造和实施

Published: October 6, 2019 doi: 10.3791/60383
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Department of Biomedical Engineering, University of Delaware, 2Department of Materials Science & Engineering, University of Delaware, 3Delaware Biotechnology Institute

Summary

该协议提供了用于实施多光子光刻的指令，以制造嵌入聚（乙二醇）水凝胶中的荧光基准标记的三维阵列，用作无参考、牵引力显微镜平台。使用这些说明，简化了 3D 材料应变的测量和蜂窝牵引力的计算，以促进高通量牵引力测量。

Abstract

量化细胞引起的材料变形提供了有关细胞如何感知和响应其微环境的物理特性的有用信息。虽然有许多方法可用于测量细胞引起的材料应变，但这里我们提供了一种以无参考方式以亚微米分辨率监测应变的方法。使用双光子激活光刻图案化过程，我们演示如何生成机械和生物主动可调合成基板，其中包含嵌入式荧光基准标记阵列，以轻松测量三维 （3D） 材料变形轮廓，以响应表面牵引力。使用这些基板，可以使用感兴趣的细胞的单个 3D 图像堆栈映射细胞张力曲线。我们采用这种方法的目标是使牵引力显微镜成为研究细胞干扰转导过程的研究人员，尤其是该领域新手更容易获得和更容易实施的工具。

Introduction

牵引力显微镜 （TFM） 是使用附着细胞和收缩细胞生成的基准标记的插值位移场近似细胞牵引力的过程。使用TFM，可以研究细胞外环境中的机械线索对重要的细胞过程的影响，如增殖、分化和迁移。，5，6，7，8，9，10，11，12。 遗憾的是，许多现有方法可能难以实现，或者需要熟悉高度专业化的分析和计算工具，从而使没有经验的研究人员难以使用 TFM。我们描述了一种生成 TFM 平台的方法，该方法消除了分析中的一些困难，同时还提供高吞吐量数据采集。

在现有的TFM方法中，最常用的用于量化材料应变的方法包括将小荧光标记物（通常是纳米或微米大小的荧光珠）加入可变形的水凝胶中，如聚丙烯酰胺（PAA）或聚烯酰胺（PAA）或聚烯酰胺（乙二醇）二甲苯甲酸酯（PEGDA）13，14，15 。这些基于珠的方法提供了在感兴趣的细胞周围密集聚类基准标记的能力，以最大化位移采样。不幸的是，磁珠在整个水凝胶中的分布不能直接控制，因此空间组织是随机的。这种随机放置会导致诸如珠子太近而无法准确解决等问题，或者扩散到基板的斑块产生低质量的数据。无法预测基准标记在没有单元格的情况下的位置也会产生一个约束，对于每组收集的单元牵引数据，还必须捕获处于宽松状态的基础标记的附加参考图像。需要参考图像，以便可以近似于强调图像和无应力图像之间的差异。为了达到放松状态，被测量的细胞要么化学放松，要么完全去除。此过程通常阻止进一步的实验测量，抑制长期细胞研究，并限制吞吐量。参考图像还需要图像配准技术来适应实验期间可能发生的漂移，这通常导致将应力状态图像与参考图像进行繁琐的手动匹配。

其他被视为无参考的TFM方法，通过高分辨率光刻、微接触印刷或微成型16、17、18对基准标记的分布实施某种形式的控制，19，20.无参考 TFM 是通过假设每个基准标记的宽松状态可以根据制造过程中标记位置的指定方式预测的。这些方法允许在单个图像捕获中完全捕获细胞的张力状态，其中基准标记位移与隐含参考相比，比从基准标记几何中推断的要低。虽然标记放置的一致性通常使用这些平台来实现，但相对于广泛使用的基于珠的方法，它们通常有其自身的缺点，包括：1） 牵引力降低;2） 降低平面外位移的精度（在某些情况下完全无法测量）;3） 平台基材和材料的可定制性降低（例如配体表示、机械性能）。

为了解决这些缺点，我们设计了一个新的无参考TFM平台。该平台利用多光子活性化学将少量荧光荧光酸与水凝胶内的特定 3D 位置交联，作为测量材料应变的基准标记。通过这种方式，我们设计了一个平台，其操作方式与基于珠子的方法类似，但具有显著优势的是，基准标记被组织成网格数组，允许无参考材料应变跟踪。这种无参考属性提供了许多优点。首先，它允许对细胞牵引状态进行非侵入性监测（即，避免需要放松或移除细胞以获得置换基准标记的参考位置）。这是我们设计该系统的主要目标，因为我们打算将其他下游分析方法与 TFM 结合使用，这与破坏性的端点 TFM 方法可能很困难。其次，使用基于网格数组的隐含引用可实现几乎完全自动化的位移分析。数组的规律性创建了一个可预测的工作流，其中异常情况（即包含意外伪影（如次优标记间距或注册不匹配）的样本单元格数据的发生可以保持在最低限度。第三，无需获取参考图像，即可在较长时间内对单个样本上的多个单元进行监视。这与传统的基于珠的方法形成鲜明对比，根据显微镜自动级运动的保真度，定位误差会累积并增加正确记录参考图像以控制细胞张力的难度。图像。总体而言，该平台有助于提高收集蜂窝张力数据的吞吐量。

通过该协议，我们希望让读者熟悉我们实现的双光子激光扫描光刻技术，以生成这种无参考的 TFM 平台，以测量由种子细胞生成的平面内和平面外牵引组件表面上。该协议未涵盖的一些单体组分的合成。一般来说，这些反应包括几乎相同的"一锅"合成反应方案，前面描述的21，和这些产品的替代品也可以购买。我们还致力于让读者熟悉我们生成的基于软件的工具，以推广使用市售的激光扫描显微镜作为 3D 打印工具，并促进基准标记位移的分析。

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Protocol

1. PEGDA基水凝胶的光聚合

  1. 收集试剂
    1. 收集锂苯基-2，4，6-三甲基苯甲酸酯（LAP），3.4 kDa聚（乙酰）乙二醇二甘醇（PEGDA），n-乙烯基丙酮（NVP），AlexaFluor 488标签PEGDA（PEG-488），AlexaFluor 633标记PEGDA（PEG-633），和PEGylatedPEG-RGDS）从各自的冰柜中，使每个冰柜都室温。
    2. 在单独的琥珀微离心管中，测量3毫克LAP、10毫克PEGDA、5毫克PEG-488、20mgPEG-633和6mgRGDS肽。
  2. 预聚合物溶液的制备
    1. 将 LAP 溶解在 1 mL 的磷酸盐缓冲盐水中（PBS，pH 7.4）。使用溶解的 LAP 溶液的 200 μL 溶解 PEGDA。然后，使用 PEGDA 溶液的 200 μL 溶解 PEG-RGDS。
      注：如果需要控制细胞形状，在基础水凝胶预聚合物溶液中省略PEG-RGDS，因为将在协议的后面通过双光子激光扫描光刻添加。
    2. 使用 80 μL 的 PBS 溶解 PEG-488。将2.5 μL的这种溶液添加到聚合物前溶液中。
      注：PEG-488将为最终水凝胶提供荧光信号，可用于在图案化期间导航，并可改变浓度以改变信号强度。
    3. 通过 0.2 μm 聚四氟乙烯 （PTFE） 过滤器过滤完整的预聚合物溶液，以去除溶液中可能存在的任何微粒。如果反应物合成正确，过滤器不应堵塞。
  3. 光聚合基础水凝胶
    1. 将 3 μL 的预聚合物溶液放在全氟烷基 （PFA） 薄平片上。将扁平150μm厚的聚二甲基硅氧烷（PDMS）条周围，但不与接触，滴前聚合物溶液。在 PDMS 上放置丙烯酸硅化盖玻片 21、22、23、24，将预聚合物滴集中在盖玻片下，将预聚合物滴平至厚度PDMS 垫垫。
    2. 将夹层预聚合物溶液暴露在紫外线下，直到水凝胶完全形成（在 370-400nm 光的 14 mW/cm2下约 1 分钟）。
    3. 小心地将盖玻片与 PDMS 垫片分离，并使用高性能双面丙烯酸粘合剂连接到开底培养皿上。对胶粘剂接触面施加压力，在盖玻片、粘合剂和培养皿之间形成完整的密封，小心不要打碎玻璃。
    4. 使用无菌过滤的 PBS 冲洗培养皿中的水凝胶，以尽量减少生物和颗粒污染物。
    5. 根据需要重复步骤 1.3.1-1.3.4 以创建所需数量的水凝胶。
    6. 将 8 μL 的 NVP 添加到剩余的 800 μL LAP 溶液中，并保持此解决方案以及未溶解的 PEG-633，直到准备好进行模式化。
      注： 具有 NVP 的 LAP 解决方案对光线非常敏感，如果不在黑暗中保存，就会聚合。将管子包裹在铝箔中有助于延长其保质期。

2. 创建图案说明

  1. 设计二进制映像
    1. 要创建用于处方基准标记数组的虚拟掩码，请使用图像处理或绘图软件创建纵横比为 100：1 的图像（例如，2000 像素长 x 20 像素宽）。
    2. 在沿图像长轴为中心的黑色背景上创建一行 100 个均匀间隔的白色像素。
    3. 将此映像另存为 *.tif 文件类型。
      注：如果需要控制细胞形状 21、25、26、27、28，则创建一个额外的虚拟掩膜。使用方形图像画布并在黑色背景上创建正白色要素。要近似于白色特征的适当大小（最终将支持细胞附着力），假定图像的总大小相当于用于激光扫描光刻的显微镜视场的大小。
  2. 将二进制图像转换为数字掩码
    1. 下载 LSM-ROI-生成器功能，可在软件存储库29免费。
    2. 打开 Matlab 并找到下载的函数文件的目录。进入目录后，打开run_script.m Matlab 脚本并运行该脚本。
    3. 选择要转换的二进制 *.tif 文件。然后，选择一个文件夹来保存区域文件。
    4. 输入所选图像所需的最终尺寸（以微米）。输入图像将被缩放和标注，以匹配这些参数。要使整个图像适合显微镜的视场，图像的总大小必须小于或等于显微镜视场的大小。
    5. 如果在 ROI-生成器选项中创建单个像素数组，请确保取消选中"删除小区域/单个像素"下的"删除刻度框"，以选中标记为"正方形"的刻度框，并取消选中"使用"在水平折断线.然后，单击"确定"。
      注： 如果创建区域文件以创建单个单元格模式，则默认选项是合适的。
    6. 在以前指定的文件夹中查找生成的 *.ovl 文件。在双光子激光扫描光刻期间，必须将该文件带到显微镜上，以加载控制激光快门的所需区域。

3. 制造基准标记数组

  1. 浸泡基水凝胶
    1. 在低光照条件下，将 200 μL 的 LAP/NVP 溶液添加到 AF633 中（两者都在步骤 1 中准备）。彻底混合，同时防止光线照射。
    2. 从步骤 1 中从含有 PEGDA 水凝胶的培养皿中取出所有 PBS 溶液。
    3. 将溶解的PEG-633添加到水凝胶中，形成完全包含基水凝胶的液滴。
      注：如果培养皿中的孔仅略大于水凝胶，它可以作为一口井来保存图案溶液。否则，在添加图案溶液之前，请确保盖玻片完全干燥，否则可能会跑出水凝胶，导致水凝胶在模式化期间脱水。
    4. 将培养皿加载到显微镜台上的样品架上，并将盖子放在培养皿上。让图案溶液在黑暗中浸泡在水凝胶中至少 30 分钟。
      注：显微镜可以在此浸泡时间内打开和配置。使用 488 nm 激光在浸泡过程中对水凝胶进行成像是一种良好功能。
  2. 配置显微镜
    1. 使用适用于 AlexaFluor 488 图像的 488 nm 激光线和滤波器，使用 PEG-488 信号定位水凝胶。从探测器收集较长发射波长的块，因为这些波长将饱和，来自PEG-633的信号。
    2. 使用垂直和水平平铺扫描在 XY 平面中查找水凝胶的中心，并在此处将舞台位置归零。
    3. 使用线扫描和 z 堆栈函数查找水凝胶的表面。在此处将焦点位置归零。通过重复这些线路扫描离开 XY 中心来识别表面位置并调整显微镜阶段的固定螺钉，从而对水凝胶进行水平。
    4. 在显微镜软件工作区中，创建用于照片图案的独立实验文件。将多光子功率设置为 1.8%（在 740 nm 时，在目标后孔处测量为 15.5 mW），扫描速度设置为 6 （0.1 μm/μs）。调整图像帧的大小（以像素为单位）以实现每像素 0.1 μm 的像素大小和 100：1 的纵横比。
    5. 将步骤 2.2 中创建的区域文件 （*.ovl） 加载到区域选项卡中。使用宏将所有区域设置为获取。
    6. 打开 z 堆栈函数，将间距设置为 3.5 μm，总深度为 28 μm，z 切片总数为 9。
    7. 使用位置函数在水凝胶上设置特定位置，其中基准标记数组将采用照片图案。
      注：这些位置的 z 位置将决定每个 z 堆栈的中心位置;放置位置时，请确保每个位置将保证阵列体积在所有曲面位置与水凝胶重叠。
    8. 使用切片函数在每个位置指定其他行和列。小心避免重叠的图案区域。理想情况下，请确保图案区域足够接近，以删除位置之间的空位置和不可用位置。
  3. 对基准标记数组进行照片图案
    1. 当浸泡时间接近 30 分钟标记时，每 5 分钟对水凝胶表面进行连续 z 堆栈线扫描，根据表面相对于零焦点位置位置的变化检查肿胀情况。
    2. 如果在 5 分钟间隔内表面位置没有变化，则加载并运行步骤 3.2.4 中创建的阵列设置
    3. 图案化实验完成后，使用 488 nm 激光验证水凝胶表面在阵列过程中是否移动。
      注：如果水凝胶表面与图案化前的位置不同，则存在几种情况。水凝胶在开模前未达到膨胀平衡，水凝胶在模式化期间开始干燥，或显微镜经历z漂移。应在后续模式运行中标识和更正此曲面平移的来源。
    4. 从显微镜中取出水凝胶，并从培养皿中吸出 PEG-633 溶液。
      注：水凝胶对光仍然极其敏感。在黑暗中保持水凝胶是非常重要的，直到所有的下水剂都完成。
    5. 用无菌过滤的PBS冲洗水凝胶3次，确保每次连续冲洗之间完全去除冲洗液。每 15 分钟重复一次三次冲洗 1 小时。
    6. 让水凝胶在PBS中冲洗过夜。
      注： 可以在此处暂停该协议。
    7. 用PBS三次冲洗水凝胶。然后用200个防乙醇溶液快速三次冲洗水凝胶，然后用PBS再三次冲洗。不要让水凝胶长时间坐在200个防氧化乙醇中。
      注：阵列溶液的某些组件可能会从溶液中崩溃并沉积在水凝胶表面，在 633 nm 照明下显示为荧光固体层（±1-5 微米厚）。用200种防腐乙醇进行下拉，可以去除这些不需要的成分。
  4. 使用连续照片图案生成单个单元格模式（可选）
    注：如果需要控制细胞扩散区域和形状，可以执行多轮模式。基础凝胶必须在其初始配方中省略 PEG-RGDS。建议最后对基准标记阵列进行图案化，以避免荧光基准标记的漂白。
    1. 在步骤 1 中制备的 LAP/NVP 溶液中溶解 20 mg PEG-RGDS。
    2. 使用 PEG-RGDS 解决方案（而不是 PEG-633 解决方案）重复步骤 3.1 = 3.3。使用定义单个单元格模式的相应区域文件（有关说明，请参阅步骤 2）。
      注： 要可视化 PEG-RGDS 模式的数组，有几个选项。PEG-RGDS的荧光变体可以使用21，30或PEG-RGDS可以掺杂荧光PEG。建议：或者，488 nm 激光线可与多光子图案激光配合运行，在基水凝胶中漂白 PEG-488 信号，从而创建与 RGDS 结合一致的非荧光区域。

4. 可视化基准标记数组

  1. 获取制造数组的 z 堆栈映像
    1. 将培养皿中的 PBS 替换为用于细胞培养的细胞介质。
      注：建议在图像采集过程中使用无苯酚无酚红介质，以防止光毒性。
    2. 浸泡时间1小时后，使用配备结构化照明模块和高放大水浸物镜的宽场荧光显微镜，使用适用于荧光基准标记的滤光片对水凝胶进行可视化。
    3. 收集高分辨率 z 堆栈图像（Z 间距 0.4 μm），从水凝胶表面到图案区域中的水凝胶中至少 20 μm 的深度，确保 z 堆栈的上限在物理上包含至少 1-2 个图像。图案区域（即荧光基准标记不再可见且仅存在噪声）。
      注： 采集此映像堆栈是验证所有模式参数是否正确所必需的，可以与步骤 5.3 中的单元格数据一起进行分析。

5. 使用光图案水凝胶执行 TFM

  1. 种子细胞
    注：为了保持无菌，请遵循所有标准组织培养方法。
    1. 在细胞播种之前，遵循各细胞系的标准协议进行细胞培养和维护。
    2. （可选）如果水凝胶的不育是一个问题，在含有抗生素的培养基中孵育水凝胶24小时，然后用正常介质进行注水。
    3. 种子细胞，首先重新暂停胰蛋白酶化细胞在水凝胶培养皿中使用的介质的最后体积。
    4. 从水凝胶盘中取出所有溶液，然后更换为装有细胞的介质。
    5. 让水凝胶在充满细胞的介质中不受干扰地坐10分钟。
    6. 小心地将培养皿移到培养箱。在孵化器中保持细胞4小时或直到细胞明显粘附。
    7. 用无细胞介质替换带细胞的介质，以去除未粘附的细胞。
  2. 获取细胞和基准标记的图像
    1. 将显微镜上的孵育室温度设置为 37°C 和 CO2到 5%，使腔室达到设定点。
    2. 将培养皿放在样品架上，并找到有图案的区域。
    3. 找到感兴趣的细胞 （COI）， 并获取 COI 的传输或荧光图像。
      注： 此图像将用于在分析期间分割细胞边界，因此图像应清楚地可视化细胞板。
    4. 如步骤 4.1.4 中那样，获取 COI 下方的图案阵列的 z 堆栈。
    5. 获取细胞的第二组透射或荧光图像。
      注：将第二个图像集与第一个图像集进行比较，以确定是否观察到由于光毒性造成的细胞损伤，以及是否需要调整图像采集设置。暴露后收缩的细胞可能遭受显著的光毒性作用，这可能会影响结果。
    6. 对每个 COI 重复步骤 5.2.3-5.2.5。

6. 分析图像

  1. 准备用于分析的图像文件
    1. 使用步骤 5.2 中收集的数据，准备 COI 周围区域的裁剪图像堆栈，以便堆栈的底部图像（第一个图像）表示第一帧，其中：（1） >80% 的图案标记列可见，（2） 最上面的图像（最后一个图像）堆栈中不再包含任何可见基准标记（即水凝胶表面上方），并且 （3） COI 周围至少有 20 μm 的非应力基准标记。
      注： 裁剪图像可大大缩短分析期间的计算时间。以后步骤中的分析代码可以在不裁剪图像的情况下运行，但不建议这样做。
    2. 创建传输和/或荧光图像的裁剪图像，以匹配上一步中堆栈的 XY 裁剪。
    3. 使用裁剪的传输图像或荧光图像（以更代表细胞形状者为准）手工分割图像（跟踪细胞边框）或通过图像处理工具进行分割。
    4. 将此图像转换为二进制图像，其中单元格内部为黑色（即强度 = 0），单元格周围的区域为白色（即强度 = 0）。保存此图像作为二进制掩码.tif .
    5. 对于每个 COI，在单个文件夹中收集图像堆栈文件、传输的图像文件和二进制掩码文件。
  2. 在图像上运行分析脚本
    1. 克隆或下载在软件存储库29免费提供的 TFM 分析功能。应下载整个存储库，因为子文件夹中存在大量依赖项。
    2. 打开 Matlab，并将代码存储库的本地克隆的目录和所有子文件夹添加到路径中。
    3. 将 Matlab 工作区中的目录设置为存储步骤 6.1 中已准备图像的文件夹位置。
    4. 打开并运行跟踪.m脚本。当出现提示时，按照说明加载适当的图像，执行初始预处理步骤，并错误检查对象跟踪算法。
    5. 脚本完成后，打开并运行dispShear.m函数。此脚本不应要求用户输入。
    6. 一旦dispShear.m脚本完成，打开并运行disp3D.m。如果系统提示您打开任何图像，请按照说明操作。
      注： 在运行时，脚本可能会要求用户在图案阵列的图像上绘制一条线。在图案化期间，此行应表示扫描激光的主要运动轴，并应与一排有图案的基准标记排列。此过程指示代码哪个方向（即基准标记的行或列）可能生成最对齐的基准标记行。
    7. dispShear.m代码完成后，运行dispSurface.m 代码，然后运行interFinal3D_2.m代码。这些脚本不应要求用户输入。
      注： interFinal3D_2.m脚本使用外部获取的软件将位移数据转换为表面牵引力，前面已描述31。为了应用这些外部函数，interFinal3D_2.m将位移数据插入统一网格中，作为转换函数的输入。如果使用不同的转换方法，或者如果不需要牵引力，则可以跳过此步骤。
    8. 运行所有脚本后，请确保可以在初始目录中找到所有数据和输出。
    9. 对每个 COI 重复步骤 6.2.3 = 6.2.8。
      注： 在代码存储库中，有一个包含脚本的文件夹，允许自动批处理目录列表中的每个脚本。有关如何使用自动化脚本的说明，请参阅自动化脚本本身（即代码中的注释）。

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Representative Results

在整个协议中，有许多检查点提供反馈，以评估模式化过程的质量。为了提供有关如何评估每个检查点的进度的见解，我们提供实际实验的代表性结果。研究结果强调了该协议在用于人类脐带内皮细胞（HUVECs）的TFM分析制备的光型水凝胶上的应用。结果包括原始图像数据以及每个关键步骤的处理数据输出。

第一个检查点发生在步骤 4，一旦基准标记阵列在水凝胶中进行了光图案。收集图像堆栈时，生成的图像应显示一个常规的图案特征数组（图1A-C），这些特征在强度上振荡，作为图像堆栈中的 z 位置的函数。如果图案表面不是完全水平，则每个图像切片的不同区域在这些振荡方面可能看起来不同相位;这是预料之中的，不应影响分析，除非在极端情况下。

其余检查点利用在分析给定 COI 期间运行的每个脚本的输出。track.m脚本提供了多个诊断图像，包括荧光基准标记的 z 投影 （图 2A） 以评估预处理质量，检测到的质心颜色的图解编码为 z 位置的函数 （图 2B）用于评估对象检测质量，以及表示已检测到的标记质心的轨迹图，这些轨迹已链接到 z 方向 （图 2C）中的列中，以评估对象跟踪质量。

为了精确检测计算参考坐标和位移所需的 3D 质心，荧光基准标记应类似于椭圆形形状，强度从中心径向减小。disp3D.m脚本提供强度图，作为给定图像堆栈中每列检测到的特征的 z 位置的函数（图3A，B），以评估基准标记强度配置文件的质量。disp3D.m和dispShear.m同时提供每个笛卡尔坐标尺寸（图 4A-C）中测量的位移噪声的直方图（图 4）以及插值位移热图（图 4E，F.最后，interFinal3D_2.m提供了使用外包代码计算的表面牵引力的热图 （图 5）31。

Figure 1
图 1：典型模式化结果。
（A） 基准标记的荧光图像，显示水凝胶表面通过 Z 维向水凝胶内 12.4 μm 的强度波动。（B） 处理过的体积渲染揭示了基准标记的椭圆形形状。（C） 体积渲染的分段剖面视图显示原始标记数据。A，C： 刻度条 =5 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图 2：粒子跟踪算法的诊断输出。
对象检测和跟踪软件输出多个诊断图像，包括 （A） 荧光基准标记的 Z 加权投影和 （B） 带有颜色编码 Z 位置的标记位置的散点图。（C） 附加输出显示 z 加权投影，如 （A） 中 ，每个帧的 2D 检测链接到列中。（D） 更仔细地观察 （B） 可以更清楚地显示由 z 位置编码的单个 2D 检测颜色。答：缩放条 =20 μm。C： 刻度杆 ±5 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图 3：3D 位移算法的诊断输出。
（A， B）标记强度的线图作为帧位置的函数显示垂直方向的标记之间的振荡。这些线图允许对网格与成像平面的对齐以及图案基准标记的整体质量进行定性评估。（A） 标记强度的重叠振荡确认成像平面与图案基准标记阵列的可接受对齐。在 Z 堆栈顶部包含空帧允许在处理软件中自动计算噪声阈值。（B） 振荡之间的重叠性差通常表明图案网格与成像平面的对齐方式较差，但也可能表明网格本身未对齐，并可能产生不良的结果。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图 4：2D 和 3D 位移算法的诊断输出。
（A-C）在被视为"未变形"的区域（即位移噪声）中测量位移的直方图提供了近似标记参考位置计算参考线精度的定量评估。位移场提供平面内（剪切）和（E）平面（正常）测量位移的可视表示。D： 比例尺 =20 μm.请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图 5：牵引力转换算法的诊断输出。
（A-C）牵引应力可以基于插值位移场计算，以确定 （B） 总牵引力、 （C） 剪切牵引力和 （D） 正常牵引力.答：比例尺 =20 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

该协议的目标是提供一个工作流，以缓解与生成和分析 TFM 数据相关的许多困难。一旦制备，光图案水凝胶易于使用，只需要了解标准组织培养实践和荧光显微镜。无参考方面允许在充满细胞的氢凝胶上无忧无虑地导航，并消除繁琐的图像处理步骤，如参考图像和变形图像之间的图像配准。生成的分析几乎完全自动化，从各个 COA 的数据可以从头到尾分析不到 10 分钟。

该协议的主要挑战来自光型水凝胶的制造。由于该协议中使用的大多数试剂都是内部合成的，我们预计使用合成水凝胶材料经验不足的用户可能会有些不敢尝试该协议。也就是说，该协议中使用的所有 PEGylated 组件都是使用一锅反应从几乎相同的协议中合成的，许多组件可以从商业供应商处购买。

该协议还需要掌握激光扫描显微镜的使用。激光扫描参数需要针对每台不同的显微镜进行优化，因为激光强度、物镜和其他显微镜组件会有所不同，即使在同一型号的显微镜之间也是如此。确定照片图案的最佳显微镜设置的一种简单方法是执行具有不同设置的扫描面板。任何影响样品接收到的总激光曝光的设置都会影响图案标记的大小和质量。这包括：扫描速度、像素大小、平均数、激光功率/强度/光度、放大倍率和数字光圈32、33。调整激光功率和扫描速度通常最容易，因此建议从这两个参数开始。还应注意的是，用于生成区域文件的软件是专门为我们使用的显微镜品牌设计的，可能需要加以增强以适应其他显微镜的制作和型号。使用协议中提供的设置，用户应期望生成具有 3D 高斯强度曲线的椭圆标记，全宽半最大尺寸为 XY 中的 0.84 ± 0.11 μm，Z 为 3.73 ± 0.30 μm。对象检测算法使用质量中心强度来识别标记质心，当标记显示一定的强度梯度时，该算法的性能最佳。

正确给水凝胶进行除液，保护水凝胶免受光和污染物的照射，对细胞培养至关重要。如协议所述，某些图案组件可能会从溶液中崩溃并沉积在水凝胶表面。如果这些组件没有从表面完全冲洗，细胞粘附可能会不可预知地受到影响。如果暴露于紫外线光谱光下，即使是小剂量，而水凝胶浸泡在图案溶液中，图案化溶液将开始聚合，并会产生不良的结果。最后，空气中的微粒或未经过滤的微粒会使分析复杂化，特别是如果它们是荧光的。应特别注意防止这些污染物在协议的所有步骤中进入样品。

分析代码通过预测与变形标记相同的行或列中的非变形标记的原始数组来预测变形基准标记的参考位置。虽然这大大简化了分析，但它也对可以分析或不能分析的内容施加了一些限制。至少，每个被分析的变形标记应具有其列和标记行的 2 个或更多成员，这些标记没有变形，以便进行准确的预测。行由在显微镜上的单行扫描中打印的点组定义，列由使用 z 堆栈函数在单个垂直轴上图案的标记定义。这将根据每个模式区域的长度和深度将分析限制为单个单元或小细胞簇。需要注意的是，通过将两个图案区域完全放在一起来纠正这一点。这是因为，尽管 XY 组件可能对齐，但除非样本表面与焦平面和舞台完全平齐，否则无法完美地排列阵列的 Z 位置分量。避免这种限制的最佳方法是采用额外的轮型，专门规定粘附配体放置。如果对齐正确，细胞粘附可以限制在图案上的可用区域。

分析代码针对方形数组进行了优化，其中标记在 Z 中间隔约 3.5 μm，X 和 Y 中间隔约 2.1 μm。最终间距将因模式保真度和膨胀而异，但如果行内间距一致（行间间距可变性不会影响跟踪），则这不应对性能产生很大影响。虽然代码可能会在不同规定的数组上运行到完成，但如果数组与此处列出的参数不匹配，则其当前状态可能会产生较差的结果。我们当前分析代码的目标是包括对可变间距和三角数组的支持，这可以提高牵引重建精度，减少与方形数组相比的区域偏差。

最后，我们提供了一种TFM方法，允许在不干扰细胞功能的情况下方便地收集和分析TFM数据。我们采用这种方法的目标是提供更易于访问和非侵入性的 TFM 方法，同时不影响 TFM 数据的分辨率和质量。我们期望这种方法将促进细胞表型的生化知识与观察到的细胞物理特性的融合。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

O. A. Banda得到了NSF IGERT SBE2研究金（1144726）、特拉华大学提供的启动基金以及国家卫生研究院/国家癌症研究所IMAT项目（R21CA214299）的资助。JHS得到国家卫生研究院/国家癌症研究所IMAT计划（R21CA214299）和国家科学基金会CAREER奖励计划（1751797）的资助。显微镜访问由NIH-NIGMS（P20 GM103446）、NSF（IIA-1301765）和特拉华州提供资助。结构化照明显微镜是使用特拉华州联邦研究与发展赠款计划（16A00471）获得资金购买的。用于双光子激光扫描光刻的LSM880共焦显微镜是使用共享仪器授予（S10 OD016361）获得的。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrodisc Syringe Filter, 0.2 μm Supor Membrane, Low Protein Binding Pall PN 4602 Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips in-house in-house Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24
Axio-Observer Z1 w/Apotome Zeiss Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM.
Chameleon Vision ii Coherent Inc. Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography.
Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil 3M Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes.
Flexmark90 PFW Liner FLEXcon FLX000620 Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter.
LSM-880 Zeiss Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography.
MATLAB Mathworks R2018a Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data.
Model SC Plotter USCutter SC631E Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes.
Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27 Zeiss Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM.
PEG-AF633 in-house in-house Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21
PEG-DA in-house in-house Base material for hydrogels. See reference: 21
PEG-RGDS in-house in-house RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21
Petri Dishes CELLTREAT 229638 8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 3097358-1004 For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS).
Syringe, Leur-Lok, 1 mL BD 309628 Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
UV Lamp UVP Blak-Ray® B-100AP Polymerizes base hydrogel.
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) Sigma-Aldrich V3409-5G Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography.

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Banda, O. A., Slater, J. H. Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform. J. Vis. Exp. (152), e60383, doi:10.3791/60383 (2019).

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