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Bioengineering

Fabricação e implementação de uma plataforma de microscopia de força de tração sem referência

Published: October 6, 2019 doi: 10.3791/60383
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Department of Biomedical Engineering, University of Delaware, 2Department of Materials Science & Engineering, University of Delaware, 3Delaware Biotechnology Institute

Summary

Este protocolo fornece instruções para implementar a litografia multifóton para fabricar matrizes tridimensionais de marcadores de referência fluorescente incorporados em hidrogéis de poli (etileno glicol) para uso como microscopia de força de tração, livre de referências Plataformas. Usando estas instruções, a medida da tensão material 3D e o cálculo de trações celulares são simplificados para promover medidas da força da tração da elevado-produção.

Abstract

Quantificar a deformação material induzida por células fornece informações úteis sobre como as células se sentem e respondem às propriedades físicas de seu microambiente. Embora existam muitas abordagens para medir a cepa material induzida por células, aqui fornecemos uma metodologia para monitorar a deformação com resolução de submícron de forma livre de referência. Usando um processo de padronização fotolitográfica ativado de dois fótons, demonstramos como gerar substratos sintéticos mecanicamente e bioativamente ajustáveis contendo matrizes incorporadas de marcadores de energia fluorescente para medir facilmente três dimensões ( 3D) perfis de deformação de material em resposta a tracções superficiais. Usando esses substratos, os perfis de tensão celular podem ser mapeados usando uma única pilha de imagens 3D de uma célula de interesse. Nosso objetivo com esta metodologia é tornar a microscopia de força de tração uma ferramenta mais acessível e mais fácil de implementar para pesquisadores que estudam processos de mecanotransdução celular, especialmente os recém-chegados ao campo.

Introduction

A microscopia de força de tração (TFM) é o processo de aproximação das tracções celulares, utilizando campos de deslocamento interpolados de marcadores de geração de células, gerados por uma célula aderente e contrátil. Usando TFM, a influência de pistas mecânicas no ambiente extracelular em importantes processos celulares como proliferação, diferenciação e migração pode ser investigada1,2,3,4 ,5,6,7,8,9,10,11,12. Infelizmente, muitas abordagens existentes podem ser difíceis de implementar ou exigir familiaridade com ferramentas analíticas e computacionais altamente especializadas, tornando a TFM difícil para os pesquisadores inexperientes usarem. Nós descrevemos uma metodologia para gerar uma plataforma de TFM que elimine alguma da dificuldade na análise ao igualmente fornecer a aquisição de dados da elevado-taxa de transferência.

Das aproximações existentes de TFM, o mais geralmente usado para quantificar a tensão material envolve a incorporação de marcadores fluorescentes pequenos (tipicamente grânulos fluorescentes nano-ou micrômetro-feitos medida) em um Hydrogel deformável, tal como o poliacrilamida (PAA) ou poli (etileno glicol) diacrylate (Pegda)13,14,15. Essas abordagens baseadas em talão fornecem a capacidade de densamente agrupar marcadores de confiança em torno de uma célula de interesse para maximizar a amostragem de deslocamento. Infelizmente, a distribuição dos grânulos durante todo o hidrogel não pode diretamente ser controlada assim que a organização Spatial é aleatória. Esta colocação aleatória leva a problemas como grânulos que são muito próximos uns dos outros para resolver com precisão, ou assim espalhar que os patches do substrato produzem dados de baixa qualidade. A incapacidade de prever onde os marcadores de origem estão na ausência de células também cria uma restrição que, para cada conjunto coletado de dados de tração celular, uma imagem de referência adicional dos marcadores subjacentes em um estado relaxado também deve ser capturada. A imagem de referência é necessária para que o deslocamento na imagem forçada possa ser aproximado como a diferença entre as imagens estressadas e não estressados. Para alcançar um estado relaxado, as células que estão sendo medidos são quimicamente relaxado ou completamente removido. Este processo impede frequentemente a aquisição de umas medidas experimentais mais adicionais, inibe estudos a longo prazo da pilha, e limita a taxa de transferência. Uma imagem de referência também requer técnicas de registro de imagem para acomodar a deriva que pode ter ocorrido durante a experimentação, muitas vezes levando a uma combinação manual complicada de imagens de estado de stress para fazer referência a imagens.

Outros métodos de TFM considerados livres de referência, implementam alguma forma de controle sobre a distribuição de marcadores de uma espécie, seja por litografia de alta resolução, impressão de microcontato ou micromoldagem16,17,18 ,19,20. A TFM sem referência é alcançada através do pressuposto de que o estado relaxado para cada marcador de produção pode ser previsto com base em como as posições dos marcadores foram prescritas durante o processo de fabricação. Esses métodos permitem a captura completa do estado de tensão de uma célula dentro de uma única captura de imagem na qual os deslocamentos de marcador de referência são medidos em comparação com um referencial implícito do que pode ser inferido a partir da geometria do marcador de origem. Embora a consistência na colocação do marcador seja tipicamente alcançada usando essas plataformas, elas geralmente sofrem de suas próprias deficiências em relação às abordagens baseadas em talão amplamente utilizadas, incluindo: 1) diminuição da resolução de tração; 2) diminuição da precisão dos deslocamentos fora do plano (em alguns casos, uma completa incapacidade de medir); e 3) diminuição da customizabilidade dos substratos e materiais da plataforma (por exemplo, apresentação de ligantes, propriedades mecânicas).

Para abordar essas deficiências, projetamos uma nova plataforma TFM sem referência. A plataforma utiliza a química ativada multifóton para Crosslink um pequeno volume de um fluoróforo em locais 3D específicos dentro do hidrogel que servem como marcadores para medir a cepa material. Desta maneira, nós projetamos uma plataforma que opere similarmente às aproximações grânulo-baseadas mas com o benefício significativo que os marcadores de base são organizados em matrizes gridded permitindo o seguimento material referência-livre da tensão. Esta propriedade livre de referência oferece muitas vantagens. Em primeiro lugar, ele permite o monitoramento não intrusivo dos Estados de tração celular (ou seja, contorna a necessidade de relaxar ou remover células para adquirir posições de referência de marcadores de condensação deslocados). Este era nosso objetivo preliminar em projetar este sistema, como nós pretendemos incorporar outros métodos analíticos a jusante em conjunto com o TFM, que pode ser difícil com aproximações destrutivas do ponto final TFM. Em segundo lugar, usando uma referência implícita com base em matrizes de grade permite a automação Near-Complete da análise de deslocamento. A regularidade das matrizes cria um fluxo de trabalho previsível em que a ocorrência de casos excepcionais (ou seja, dados de células de amostra contendo artefatos inesperados, como espaçamento de marcador suboptimal ou incombinações de registro) podem ser mantidos no mínimo. Em terceiro lugar, renunciar à necessidade de adquirir uma imagem de referência fornece a liberdade de monitorar muitas células em uma única amostra durante longos períodos de tempo. Isso contrasta com as abordagens tradicionais baseadas em esferas, onde, dependendo da fidelidade dos movimentos automáticos de estágio do microscópio, erros no posicionamento podem acumular e aumentar a dificuldade de registrar corretamente as imagens de referência à tensão celular Imagens. Globalmente, esta plataforma facilita uma maior taxa de transferência na recolha de dados de tensão celular.

Com este protocolo, esperamos familiarizar os leitores com a técnica de litografia de digitalização a laser de dois fótons que implementamos para gerar esta plataforma TFM sem referência para medir os componentes de tração no plano e fora do plano gerados pelas células semeadas na superfície. Não coberto neste protocolo é a síntese de alguns dos componentes monoméricos. Em geral, essas reações incluem esquemas de reação de síntese quase idênticos de "um pote" descritos anteriormente21, e alternativas para esses produtos também podem ser compradas. Também pretendemos familiarizar os leitores com as ferramentas baseadas em software que geramos para promover o uso de microscópios de digitalização a laser comercialmente disponíveis como ferramentas de impressão 3D e para facilitar a análise de deslocamentos de marcadores de base.

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Protocol

1. fotopolimerização de um hidrogel base PEGDA

  1. Coleta de reagentes
    1. Colete o lítio Phenyl-2, 4, 6-trimetilbenzoilfosforato (colo), 3,4 kDa poli (etileno) diacrilato de glicol (Pegda), n-vinil pirrolidona (NVP), alexafluor 488 rotulado Pegda (PEG-488), alexafluor 633 rotulado Pegda (PEG-633), e peptídeo pegylated RG PEG-RGDS) de seus respectivos freezers e trazer cada um para a temperatura ambiente.
    2. Em tubos de microcentrífuga âmbar separados, meça 3 mg de LAP, 10 mg de PEGDA, 5 mg de PEG-488, 20 mg de PEG-633 e 6 mg de peptídeo RGDS.
  2. Preparação da solução pré-polímero
    1. Dissolva o LAP em 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4). Utilize 200 μL da solução LAP dissolvida para dissolver o PEGDA. Em seguida, use 200 μL da solução PEGDA para dissolver o PEG-RGDS.
      Nota: se o controle da forma celular é desejado, omitir dissolução PEG-RGDS na base de hidrogel pré-polímero solução, como ele será adicionado através de dois-fóton, laser de digitalização litografia mais tarde no protocolo.
    2. Use 80 μL de PBS para dissolver o PEG-488. Adicionar 2,5 μL desta solução à solução pré-polímero.
      Nota: o Peg-488 dará o hidrogel final um sinal fluorescente que possa ser usado para navegar durante o padronização e a concentração pode ser modificada para alterar a intensidade do sinal.
    3. Filtre a solução completa do pre-polímero através de um filtro do politetrafluoretileno do μm 0,2 (PTFE) para remover todas as partículas que podem estar atuais na solução. Se os reagentes forem sintetizados corretamente, o filtro não deve ficar entupido.
  3. Fotopolimerização do hidrogel de base
    1. Coloc 3 μl da solução do pre-polímero em uma folha lisa fina de alcanos com (PFA). Coloque o plano de 150 μm de espessura polidimetilsiloxano (PDMS) tiras circundantes, mas não em contato com, a gota de solução de pré-polímero. Coloque uma lamínula de acrylate-silanized21,22,23,24 no PDMS — com a gota do pre-polímero centrada o lamela — para aplainar a gota do pre-polímero à espessura do Espaçadores PDMS.
    2. Expor a solução pré-polímero imprensada à luz UV até que um hidrogel esteja totalmente formado (aproximadamente 1 min a 14 mW/cm2 de 370-400nm de luz).
    3. Separe cuidadosamente o lamela dos espaçadores PDMS e anexar a um prato de Petri de fundo aberto usando alto desempenho, adesivo acrílico de dupla face. Aplique pressão na superfície de contato adesiva para criar um selo completo entre a lamínula, o adesivo e a placa de Petri — com cuidado para não rachar o vidro.
    4. Enxágüe o hidrogel na placa de Petri usando o PBS estéril-filtrado para minimizar contaminadores biológicos e particulados.
    5. Repita as etapas 1.3.1-1.3.4 conforme necessário para criar o número desejado de hidrogéis.
    6. Adicionar 8 μL de NVP aos restantes 800 μL de solução LAP e manter esta solução, bem como o PEG-633 não dissolvido até estar pronto para o padrão.
      Nota: a solução LAP com NVP é muito sensível à luz e irá polimerizar se não for mantida no escuro. Envolver o tubo na folha de alumínio pode ajudar a melhorar sua vida de prateleira.

2. criando instruções de padronização

  1. Projetando uma imagem binária
    1. Para criar uma máscara virtual para prescrever matrizes de marcadores de dados, use o software de processamento de imagem ou desenho para criar uma imagem com uma proporção de 100:1 (por exemplo, 2000 pixels de comprimento x 20 pixels de largura).
    2. Crie uma linha de 100 pixels brancos uniformemente espaçados em um fundo preto centrado ao longo do eixo longo da imagem.
    3. Guarde esta imagem como um *. tif filetype.
      Nota: se o controle da forma da célula for desejado21,25,26,27,28, crie uma máscara virtual adicional. Use uma tela de imagem quadrada em forma e crie feições brancas positivas em um fundo preto. Para aproximar um tamanho apropriado para as características brancas (que eventualmente suportarão a adesão da pilha) supor que o tamanho total da imagem é equivalente ao tamanho do viewfield do microscópio usado para a litografia da exploração do laser.
  2. Convertendo uma imagem binária em uma máscara digital
    1. Baixe as funções LSM-ROI-Generator disponíveis gratuitamente no repositório de software29.
    2. Abra o MATLAB e encontre o diretório dos arquivos de função baixados. Uma vez no diretório, abra o script MATLAB run_script. m e execute o script.
    3. Selecione o arquivo *. tif binário para conversão. Em seguida, selecione uma pasta para salvar arquivos de regiões.
    4. Insira o tamanho final desejado, em mícrons, da imagem selecionada. A imagem de entrada será dimensionada para corresponder a esses parâmetros. Para que a imagem inteira se encaixe no campo de visão do microscópio, o tamanho total da imagem deve ser menor ou igual ao tamanho do campo de visão do microscópio.
    5. Se criar uma única matriz de pixel, nas opções de gerador de ROI, certifique-se de desmarcar a caixa de seleção remover em pequenas regiões/pixels simples, para verificar a caixa de verificação rotulada praçase desmarque usar em Linhas de ruptura horizontais. Em seguida, clique em OK.
      Observação: se criar um arquivo de regiões para criar padrões de célula única as opções padrão são apropriadas.
    6. Localize o arquivo *. OVL resultante na pasta especificada anteriormente. Este arquivo deve ser trazido ao microscópio para carregar as regiões desejadas que controlam o obturador do laser durante a litografia da exploração do laser do dois-fóton.

3. fabricando matrizes de marcador de

  1. Embebendo o hidrogel baixo
    1. Em condições de pouca luz, adicione 200 μL da solução LAP/NVP ao AF633 (ambos preparados na etapa 1). Misture completamente enquanto protege da luz.
    2. Remova toda a solução de PBS da placa de Petri que contem um hidrogel de Pegda da etapa 1.
    3. Adicione o Peg-633 dissolvido ao hidrogel para dar forma a uma gota que abranja completamente o hidrogel baixo.
      Nota: se o furo na placa de Petri é somente ligeiramente maior do que o Hydrogel, pode serir como um poço para prender a solução do padronização. Caso contrário, certifique-se de que a lamínula está completamente seca antes de adicionar a solução de padronização ou pode ser executado fora do hidrogel causando o hidrogel para desidratar durante a padronização.
    4. Carregue a placa de Petri no suporte da amostra no estágio do microscópio e coloc a tampa no prato de Petri. Permita que a solução de padronização mergulhe no hidrogel por pelo menos 30 minutos no escuro.
      Nota: o microscópio pode ser ligado e configurado durante este tempo de imersão. Usando o laser 488 nm para a imagem do hidrogel durante a imersão é bom.
  2. Configurando o microscópio
    1. Usando uma linha laser de 488 nm e filtros apropriados para a imagem AlexaFluor 488, localize o hidrogel usando o sinal PEG-488. Bloco de coleta de comprimentos de onda de emissão mais longo do detector como estes serão saturados com sinal do PEG-633.
    2. Encontre o centro do hidrogel no plano XY usando varreduras verticais e horizontais da telha e zero a posição do estágio aqui.
    3. Encontre a superfície do hidrogel usando varreduras de linha e a função z-Stack. Zero a posição de foco aqui. Nivelar o hidrogel repetindo estas varreduras da linha longe do centro XY para identificar a posição de superfície e ajustar os parafusos ajustados para a fase do microscópio.
    4. Dentro do espaço de trabalho do software do microscópio, crie um arquivo experimental separado para o photopatterning. Defina a potência multifóton para 1,8% (15,5 mW a 740 nm conforme medido na abertura traseira do objetivo) e a velocidade de digitalização para 6 (0,1 μm/μs). Ajuste o tamanho do quadro de imagem em pixels para atingir um tamanho de pixel de 0,1 μm por pixel e uma proporção de 100:1.
    5. Carregar o arquivo de regiões (*. OVL) criado na etapa 2,2 na guia regiões. Use uma macro para definir todas as regiões para aquisição.
    6. Ative a função z-Stack e defina o espaçamento para 3,5 μm para uma profundidade total de 28 μm e o número total de fatias z de 9.
    7. Use a função de posições para definir locais específicos no hidrogel onde as matrizes de marcadores de base serão fotomodeladas.
      Nota: o z-Location destas posições irá ditar a posição central de cada z-Stack; ao posicionar posições, certifique-se de que cada posição garantirá que o volume padronizado se sobreponha ao hidrogel em todas as localizações de superfície.
    8. Use a função Tile para especificar linhas e colunas adicionais em cada posição. Tenha cuidado para evitar sobreposição de regiões padronizadas. Idealmente, certifique-se de que as áreas padronizadas estejam próximas o suficiente para remover locais vazios e inutilizáveis entre as posições.
  3. Photopatterning os arrays de marcador de
    1. Como o tempo de imersão se aproxima da marca de 30 min, tome sucessivas varreduras de linha z-Stack da superfície do hidrogel a cada 5 min para verificar se há inchaço com base em alterações na localização da superfície em relação à posição de foco zerada.
    2. Se nenhuma alteração na posição da superfície ocorrer ao longo de um intervalo de 5 min, carregue e execute as configurações de padronização criadas na etapa 3.2.4
    3. Uma vez que o experimento de padronização tenha terminado de funcionar, use o laser de 488 nm para verificar se a superfície do hidrogel não se movimentou durante a padronização.
      Nota: se a superfície do hidrogel não estiver na mesma posição que era antes da padronização, existem vários cenários. O hidrogel não tinha alcangado o equilíbrio do inchamento antes do patterning, o hidrogel começou a secar durante a padronização, ou o microscópio experimentou o z-Drift. A fonte desta Tradução superficial deve ser identificada e corrigida em execuções de padronização subsequentes.
    4. Retire o hidrogel do microscópio e aspirar a solução PEG-633 da placa de Petri.
      Nota: o hidrogel ainda é extremamente sensível à luz. Manter o hidrogel no escuro é muito importante até que toda a enxaguadela esteja completa.
    5. Enxágüe o hidrogel 3 vezes com PBS estéril-filtrado, certificando-se remover completamente o equipamento entre cada enxaguadura sucessiva. Repita este enxágüe triplo a cada 15 min por 1 h.
    6. Permitir que o hidrogel para enxaguar em PBS durante a noite.
      Observação: o protocolo pode ser pausado aqui.
    7. Triple enxaguar o hidrogel com PBS. Em seguida, triplicar rapidamente o hidrogel com uma solução de etanol à prova de 200, seguido por outro enxágüe triplo com PBS. Não permita que o hidrogel se sente em etanol à prova de 200 por longos períodos de tempo.
      Nota: alguns componentes da solução de padronização podem travar fora da solução e depositar na superfície do hidrogel e aparecer como uma camada sólida de fluorescência (~ 1-5 mícrons de espessura) 633 nm iluminação. Enxaguar com etanol à prova de 200 deve remover esses componentes indesejados.
  4. Usando a fotopadronização sucessiva para gerar padrões de célula única (opcional)
    Observação: se o controle sobre a área de propagação da célula e a forma for desejada, várias rodadas de padronização podem ser executadas. O gel de base deve ter PEG-RGDS omitido de sua formulação inicial. Recomenda-se que a padronização das matrizes de marcador de sua marca seja realizada por último para evitar o branqueamento dos marcadores de "fluorescente".
    1. Dissolver 20 mg de PEG-RGDS na solução LAP/NVP preparada na etapa 1.
    2. Repita as etapas 3,1 – 3,3 usando a solução PEG-RGDS em vez da solução PEG-633. Use o arquivo de regiões apropriado que define os padrões de célula única (consulte a etapa 2 para obter instruções).
      Nota: para visualizar as matrizes de padrões de PEG-RGDS, existem várias opções. Uma variante fluorescente de Peg-Rgds pode ser usado21,30 ou o Peg-Rgds pode ser dopado com Peg fluorescente. Recomendado: Alternativamente, a linha de laser de 488 nm pode ser executada em conjunto com o laser de padronização multifóton para branquear o sinal PEG-488 no hidrogel de base, criando regiões não fluorescentes que coincidem com a incorporação de RGDS.

4. visualizando matrizes de marcadores de

  1. Adquirindo uma imagem z-Stack da matriz fabricada
    1. Substitua PBS na placa de Petri com os meios de pilha usados para a cultura de pilha.
      Nota: a mídia livre de fenol é recomendada para uso durante a aquisição de imagens para evitar a fototoxicidade.
    2. Após 1 h de tempo de imersão, use um microscópio de fluorescência Widefield equipado com um módulo de iluminação estruturado e uma lente objetiva de imersão em água de alta ampliação para visualizar os hidrogéis usando um conjunto de filtros apropriado para os marcadores de energia fluorescente.
    3. Colete uma pilha z de alta resolução de imagens (espaçadas 0,4 μm em Z) abrangendo pelo menos 20 μm de profundidade da superfície do hidrogel no hidrogel na área padronizada, certificando-se de que o limite superior da pilha z inclua pelo menos 1-2 imagens fisicamente acima do área padronizada (i.e., em que os marcadores de uma fluorescência não são mais visíveis e apenas o ruído está presente).
      Nota: a aquisição desta pilha de imagens é necessária para verificar se todos os parâmetros de padronização estão corretos e podem ser analisados juntamente com os dados da célula na etapa 5,3.

5. realização de TFM utilizando hidrogéis fotomodelados

  1. Células de semeadura
    Nota: para manter a esterilidade, siga todas as práticas de cultura de tecidos padrão.
    1. Antes da semeadura da célula, siga os protocolos padrão para a respectiva linha celular para a cultura e manutenção de células.
    2. Opcional Se a esterilidade do hidrogel é uma preocupação, incubar o hidrogel para 24 h nos meios que contêm antibióticos seguidos enxaguando com meios normais.
    3. Para células de semente, primeiro re-suspender células tripsinizadas no volume final de mídia a ser usado no prato de Petri hidrogel.
    4. Remova toda a solução do prato do hidrogel e substitua-a com os meios pilha-carregados.
    5. Deixe o hidrogel sentar-se não perturbado em meios pilha-carregados por 10 minutos.
    6. Mova cuidadosamente o prato de Petri para uma incubadora. Manter as células na incubadora para 4 h ou até que as células são visivelmente aderidos.
    7. Substitua a mídia carregada de células por mídia sem célula para remover células não aderadas.
  2. Aquisição de imagens de células e marcadores de
    1. Ajuste a temperatura para a câmara de incubação no microscópio a 37 ° c e a CO2 a 5% e permita que a câmara alcance os pontos ajustados.
    2. Coloque o prato de Petri no suporte da amostra e localize as áreas padronizadas.
    3. Localize uma célula de interesse (COI) e adquira uma imagem transmitida ou fluorescente do COI.
      Nota: esta imagem será usada para segmentar o limite da célula durante a análise, de modo que a imagem deve Visualizar claramente os pensionistas da célula.
    4. Adquira uma pilha z da matriz padronizada abaixo do COI como na etapa 4.1.4.
    5. Adquira um segundo conjunto de imagens transmitidas ou fluorescentes da célula.
      Observação: Compare a segunda imagem definida com a primeira para determinar se o dano de célula devido à fototoxicidade é observado e se as configurações de aquisição de imagem precisam ser ajustadas. As células que encolhem após a exposição provavelmente sofreram efeitos fototóxicos significativos, o que pode afetar os resultados.
    6. Repita os passos 5.2.3-5.2.5 para cada COI.

6. analisando as imagens

  1. Preparação dos arquivos de imagem para análise
    1. Usando dados coletados na etapa 5,2, prepare uma pilha cortada da imagem da área em torno de um COI tal que a imagem inferior (primeira imagem) da pilha represente o primeiro quadro onde: (1) > 80% das colunas modeladas do marcador são visíveis, (2) a imagem mais superior (última imagem) na pilha não contém mais nenhum marcador de valor visível (ou seja, acima da superfície do hidrogel), e (3) há pelo menos 20 μm de marcadores não estressados que cercam o COI.
      Observação: Recortar as imagens reduz consideravelmente o tempo computacional durante a análise. O código de análise em etapas posteriores pode ser executado sem recortar as imagens, mas isso não é recomendado.
    2. Crie uma imagem cortada da imagem transmitida e/ou fluorescente para corresponder ao recorte XY da pilha na etapa anterior.
    3. Use a imagem transmitida ou fluorescente cortada — o que for mais representativo da forma da célula — para segmentar a imagem manualmente (rastrear a borda da célula) ou por meio de ferramentas de processamento de imagem.
    4. Converta esta imagem em uma imagem binária em que o interior da célula é preto (ou seja, intensidade = 0) e a área que circunda a célula é branca (ou seja, intensidade de 0). Guarde esta imagem como máscara binária. tif.
    5. Para cada COI, colete o arquivo de pilha de imagens, o arquivo de imagem transmitido e o arquivo de máscara binária em uma única pasta.
  2. Executando scripts de análise nas imagens
    1. Clonar ou baixar as funções de análise TFM disponíveis gratuitamente no repositório de software29. O repositório inteiro deve ser baixado, pois há um número significativo de dependências nas subpastas.
    2. Abra o MATLAB e adicione o diretório e todas as subpastas do clone local do repositório de código ao caminho.
    3. Defina o diretório dentro do espaço de trabalho do MATLAB para o local da pasta onde as imagens preparadas na etapa 6,1 foram armazenadas.
    4. Abra e execute o script Tracking. m . Quando solicitado, siga as instruções para carregar as imagens apropriadas, execute as etapas iniciais de pré-processamento e verifique o algoritmo de rastreamento de erros.
    5. Depois que o script for concluído, abra e execute a função Dispshear. m . Este script não deve exigir a entrada do usuário.
    6. Depois que o script Dispshear. m tiver concluído, abra e execute disp3D. m. Se lhe for pedido para abrir quaisquer imagens, siga as instruções.
      Observação: durante o tempo de execução, o script pode solicitar ao usuário desenhar uma linha em uma imagem da matriz padronizada. Esta linha deve representar o eixo de movimento primário do laser de digitalização durante a padronização e deve line-up com uma fileira de marcadores de padrão de reanimação. Esse processo instrui o código a qual direção (ou seja, linhas ou colunas de marcadores de produção) provavelmente produz as linhas mais alinhadas de marcadores de produção.
    7. Depois que o código Dispshear. m for concluído, execute o código dispsurface. m seguido pelo código interpFinal3D_2. m . Esses scripts não devem exigir entradas do usuário.
      Observação: o script interpFinal3D_2. m converte dados de deslocamento em trações de superfície usando o software obtido externamente, que foi descrito anteriormente31. Para aplicar essas funções externas, o interpFinal3D_2. m interpola dados de deslocamento em grades uniformes para servir como entradas para as funções de conversão. Se estiver usando um método de conversão diferente, ou se não forem necessárias trações, essa etapa poderá ser ignorada.
    8. Uma vez que todos os scripts foram executados, assegure-se de que todos os dados e saídas possam ser encontrados no diretório inicial.
    9. Repita os passos 6.2.3 – 6.2.8 para cada COI.
      Observação: dentro do repositório de código, há uma pasta que contém scripts que permitem a execução automática em lote de cada um dos scripts em uma lista de diretórios. Refira os próprios scripts de automatização (isto é, comentários dentro do código) para instruções em como usá-los.

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Representative Results

Ao longo do protocolo, há uma série de pontos de verificação que fornecem feedback para avaliar a qualidade do procedimento de padronização. Para fornecer alguma introspecção a respeito de como avaliar o progresso em cada um destes checkpoints, nós fornecemos resultados representativos de um experimento real. Os resultados evidenciam a aplicação deste protocolo realizado em um hidrogel fotomodelado preparado para análise de TFM de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs). Os resultados incluem dados brutos de imagem, bem como saídas de dados processadas em cada etapa crítica.

O primeiro ponto de verificação ocorre na etapa 4, uma vez que a matriz de marcador de unidade foi fotomodelada no Hydrogel. Ao coletar uma pilha de imagem, as imagens resultantes devem exibir uma matriz regular de recursos padronizados (Figura 1a-C) que oscilam em intensidade como uma função da posição z dentro da pilha de imagens. Se a superfície padronizada não estava perfeitamente nivelada, as regiões diferentes de cada fatia da imagem podem parecer fora da fase com se com respeito a estas oscilações; Isso é esperado e não deve afetar a análise, exceto em casos extremos.

Os pontos de verificação restantes utilizam saídas de cada um dos scripts executados durante a análise de um determinado COI. O script Tracking. m fornece várias imagens de diagnóstico, incluindo uma projeção z de marcadores de produção fluorescente (Figura 2a) para avaliar a qualidade de pré-processamento, um gráfico de cor de centróides detectados codificado em função da posição z ( Figura 2B) para avaliar a qualidade da detecção de objetos e um gráfico de faixas representando os centróides de marcadores detectados que foram vinculados em colunas na direção z (Figura 2C) para avaliar a qualidade do rastreamento de objetos.

Para uma detecção precisa de centróide 3D necessária para calcular coordenadas de referência e deslocamentos, marcadores de base fluorescentes devem assemelhar-se a formas elipsoidais com intensidade diminuindo radialmente a partir do centro. O script disp3D. m fornece um gráfico de intensidade como uma função da posição z para cada coluna de feições detectadas em uma determinada pilha de imagens (Figura 3a, B) para avaliar a qualidade dos perfis de intensidade do marcador. Ambos disp3D. m e dispshear. m juntos fornecem histogramas de ruído de deslocamento medido em cada uma das dimensões coordenadas cartesianas (Figura 4A-C), bem como mapas de calor interpolados de deslocamento (Figura 4 E, F). Finalmente, o interpFinal3D_2. m fornece mapas de calor de trações de superfície calculados usando o código terceirizado (Figura 5)31.

Figure 1
Figura 1: resultados típicos de padronização.
(A) imagens fluorescentes de marcadores de sua intensidade, exibindo flutuações na dimensão Z da superfície do hidrogel até 12,4 μm dentro do hidrogel. (B) uma renderização volumétrica processada revela a forma elipsoidal dos marcadores de (C) as visualizações do perfil seccionado da renderização volumétrica exibem dados brutos do marcador. A, C: barra de escala = 5 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: saídas de diagnóstico do algoritmo de rastreamento de partículas.
O software de detecção e rastreamento de objetos produz várias imagens de diagnóstico, incluindo (a) uma projeção ponderada em z dos marcadores de difusão fluorescente e (B) um gráfico de dispersão de posições de marcador com posição Z codificada por cores. (C) uma saída adicional exibe uma projeção ponderada em z, como em (a), com detecções 2D de cada quadro vinculado em colunas. (D) um olhar mais atento (B) mostra mais claramente as detecções individuais 2D cor codificada por z-posição. A: barra de escala = 20 μm. C: barra de escala = 5 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: saídas de diagnóstico do algoritmo de deslocamento 3D.
(A, B) As parcelas de linha da intensidade do marcador em função da posição do quadro oscilam entre os marcadores agrupados na direção vertical. Estas parcelas de linha permitem a avaliação qualitativa do alinhamento da grade com o plano da imagem latente, assim como a qualidade total dos marcadores de referência padrão. (A) as oscilações sobrepostas na intensidade do marcador confirmam o alinhamento aceitável do plano de imagem com as matrizes de marcadores de referência padrão. Incluir frames vazios na parte superior de uma pilha Z permite o cálculo automatizado de um limiar de ruído no software de processamento. (B) a sobreposição deficiente entre oscilações é muitas vezes indicativa de mau alinhamento das grades padronizadas com o plano de imagem, mas também pode sugerir que a própria grade esteja desalinhada e possa produzir resultados ruins. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: saídas de diagnóstico dos algoritmos de deslocamento 2D e 3D.
(A-C) Histogramas de deslocamentos medidos em regiões consideradas "não deformadas" (ou seja, ruído de deslocamento) fornecem uma avaliação quantitativa da precisão das linhas de referência calculadas para aproximar posições de referência de marcadores. Campos de deslocamento fornecem uma representação visual de ambos (D) no plano (cisalhamento) e (e) fora-de-plano (normal) deslocamentos medidos. D: barra de escala = 20 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: saídas de diagnóstico do algoritmo de conversão de tração.
(A-C) As tensões de tração podem ser calculadas com base em campos de deslocamento interpolados para determinar a (B) tração total, (C) tração de cisalhamento e (D) tração normal. A: barra de escala = 20 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O objetivo deste protocolo é fornecer um fluxo de trabalho que alivia grande parte da dificuldade associada à geração e análise de dados de TFM. Uma vez preparados, os hidrogéis fotomodelados são simples de usar, exigindo apenas conhecimento de práticas padrão de cultura tecidual e microscopia de fluorescência. O aspecto livre de referência permite a navegação descuidadas em hidrogéis carregados de células e elimina etapas de processamento de imagens complicadas, como registro de imagem entre imagens de referência e deformado. A análise resultante é quase completamente automatizada e os dados de COIs individuais podem ser analisados do início ao fim em menos de 10 min.

Os principais desafios deste protocolo decorrem da fabricação do hidrogel fotomodelado. Porque a maioria dos reagentes utilizados no protocolo são sintetizados em casa, esperamos que os usuários com pouca experiência usando materiais de hidrogel sintético pode ser um pouco Dissuado de tentar este protocolo. Dito isto, todos os componentes PEGylated usados neste protocolo são sintetizados a partir de protocolos quase idênticos usando reações de um pote e muitos dos componentes podem ser comprados de vendedores comerciais.

Este protocolo também requer algum domínio sobre o uso de microscópios de digitalização a laser. Os parâmetros da laser-exploração precisam de ser aperfeiçoados para cada microscópio diferente, como intensidades do laser, lentes objetivas, e outros componentes do microscópio variarão, mesmo entre microscópios do mesmo modelo. Uma abordagem simples para determinar as melhores configurações de microscópio para Photo-patterning é executar um painel de varreduras com configurações variadas. Qualquer configuração que afete a exposição total a laser recebida pela amostra afetará o tamanho e a qualidade dos marcadores padronizados. Isso inclui: velocidade de digitalização, tamanho do pixel, número médio, potência do laser/intensidade/Fluence, ampliação e abertura numérica32,33. É frequentemente mais fácil ajustar a potência do laser e a velocidade da varredura e assim que recomenda-se começar com aqueles dois parâmetros. Também deve ser notado que o software usado para gerar arquivos de regiões foi projetado especificamente para a marca de microscópios que usamos e pode precisar de ser aumentada para acomodar outras marcas de microscópio e modelos. Com as configurações fornecidas no protocolo, o usuário deve esperar gerar marcadores elipsoidais com perfis de intensidade de forma gaussiana 3D de dimensões de largura total meia-máx de 0,84 ± 0,11 μm em XY e 3,73 ± 0,30 μm em Z. O algoritmo de detecção de objeto usa um centro-de-massa de intensidade para identificar os centróides do marcador e executará melhor quando os marcadores apresentarem um gradiente definitivo de intensidade.

Enxaguar corretamente o hidrogel e protegê-lo da luz e dos contaminadores é crìticamente importante para a cultura de pilha. Como mencionado no protocolo, alguns dos componentes de padronização podem travar fora da solução e depositar na superfície do Hydrogel. Se estes componentes não são completamente enxaguados a partir da superfície, a adesão celular pode ser imprevisível afetado. Se exposto à luz do espectro UV, mesmo em pequenas doses, enquanto o hidrogel está embebendo na solução de padronização, a solução de padronização começará a polimerizar e produzirá resultados ruins. Por fim, as partículas no ar ou as partículas não filtradas complicarão a análise, especialmente se forem fluorescentes. Cuidados especiais devem ser tomados para evitar que esses contaminantes entrem na amostra em todos os passos do protocolo.

O código de análise prevê locais de referência de marcadores de dados deformados, prevendo a matriz original de marcadores não deformados na mesma linha ou coluna como o marcador deformado. Enquanto isso simplifica muito a análise, também impõe algumas restrições sobre o que pode ou não ser analisado. No mínimo, cada marcador deformado que está sendo analisado deve ter 2 ou mais membros de sua coluna e fileira dos marcadores que não são deformados de modo que uma predição exata possa ser feita. Uma linha é definida pelo grupo de pontos impressos em uma varredura de linha única no microscópio, e uma coluna é definida por marcadores padronizados em um único eixo vertical usando uma função de pilha z. Isso limita a análise para células individuais ou pequenos clusters de célula com base no comprimento e na profundidade de cada área padronizada. É importante notar que isso não é remediado, colocando duas regiões padronizadas perfeitamente ao lado do outro. Isso porque, embora os componentes XY podem se alinham, não é viável para perfeitamente alinhe os componentes posicionais Z das matrizes, a menos que a superfície da amostra esteja perfeitamente nivelada com o plano focal e o palco. A melhor maneira de evitar essa limitação é empregar rodadas adicionais de padronização que determinam especificamente a colocação do ligante de aderência. Se alinhado corretamente, a adesão da pilha pode ser restrita às áreas utilizáveis nos testes padrões.

O código de análise foi otimizado para matrizes quadradas onde os marcadores são espaçados aproximadamente 3,5 μm separados em Z e 2,1 μm em X e Y. O espaçamento final variará com base na fidelidade e inchaço de padronização, mas isso não deve afetar muito o desempenho se o espaçamento em linha for consistente (a variabilidade de espaçamento entre linhas não afetará o rastreamento). Enquanto o código pode ser executado para conclusão em matrizes prescritas diferentemente, seu estado atual pode gerar resultados ruins se as matrizes não corresponderem aos parâmetros listados aqui. Nossos objetivos atuais para o código de análise são incluir suporte para espaçamento variável, bem como matrizes triangulares, o que pode melhorar a precisão de reconstrução de tração e reduzir o viés regional em comparação com matrizes quadradas.

Para concluir, nós fornecemos uma aproximação a TFM que permite a coleção e a análise facile de dados de TFM sem perturbar a função celular. Nosso objetivo com essa abordagem é fornecer uma abordagem TFM mais acessível e não intrusiva, sem comprometer a resolução e a qualidade dos dados de TFM. Esperamos que essa metodologia promova a convergência do conhecimento bioquímico dos fenótipos celulares com as propriedades físicas observadas das células.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

O. A. banda foi apoiado pelo financiamento de uma bolsa NSF IGERT SBE2 (1144726), os fundos de arranque fornecidos pela Universidade de Delaware, e os institutos nacionais de saúde/Instituto Nacional do câncer programa IMAT (R21CA214299). O JHS é apoiado pelo financiamento do programa nacional institutos de saúde/Instituto Nacional de câncer IMAT (R21CA214299) e pelo programa de premiação de carreira da Fundação Nacional de ciência (1751797). O acesso à microscopia foi apoiado por subsídios do NIH-NIGMS (P20 GM103446), do NSF (IIA-1301765) e do estado de Delaware. O microscópio estruturado da iluminação foi adquirido com os fundos do estado do programa federal da concessão da pesquisa e do desenvolvimento de Delaware (16A00471). O microscópio confocal LSM880 usado para a litografia da exploração do laser do dois-fóton foi adquirido com uma concessão compartilhada da instrumentação (S10 OD016361).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrodisc Syringe Filter, 0.2 μm Supor Membrane, Low Protein Binding Pall PN 4602 Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips in-house in-house Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24
Axio-Observer Z1 w/Apotome Zeiss Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM.
Chameleon Vision ii Coherent Inc. Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography.
Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil 3M Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes.
Flexmark90 PFW Liner FLEXcon FLX000620 Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter.
LSM-880 Zeiss Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography.
MATLAB Mathworks R2018a Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data.
Model SC Plotter USCutter SC631E Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes.
Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27 Zeiss Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM.
PEG-AF633 in-house in-house Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21
PEG-DA in-house in-house Base material for hydrogels. See reference: 21
PEG-RGDS in-house in-house RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21
Petri Dishes CELLTREAT 229638 8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 3097358-1004 For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS).
Syringe, Leur-Lok, 1 mL BD 309628 Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
UV Lamp UVP Blak-Ray® B-100AP Polymerizes base hydrogel.
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) Sigma-Aldrich V3409-5G Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography.

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References

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Fabricação e implementação de uma plataforma de microscopia de força de tração sem referência
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Banda, O. A., Slater, J. H.… More

Banda, O. A., Slater, J. H. Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform. J. Vis. Exp. (152), e60383, doi:10.3791/60383 (2019).

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