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Bioengineering

Fabrication et mise en œuvre d'une plate-forme de microscopie de traction sans référence

Published: October 6, 2019 doi: 10.3791/60383
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Department of Biomedical Engineering, University of Delaware, 2Department of Materials Science & Engineering, University of Delaware, 3Delaware Biotechnology Institute

Summary

Ce protocole fournit des instructions pour la mise en œuvre de la lithographie multiphoton pour fabriquer des tableaux tridimensionnels de marqueurs fiducial fluorescents intégrés dans des hydrogels à base de poly(éthylène glycol) pour une utilisation comme microscopie sans force de traction sans référence. Plates-formes. À l'aide de ces instructions, la mesure de la souche de matériau 3D et le calcul des tractions cellulaires sont simplifiés afin de promouvoir des mesures de la force de traction à haut débit.

Abstract

La quantification de la déformation des matériaux induits par les cellules fournit des informations utiles sur la façon dont les cellules détectent et réagissent aux propriétés physiques de leur microenvironnement. Bien qu'il existe de nombreuses approches pour mesurer la souche matérielle induite par les cellules, nous fournissons ici une méthodologie pour la surveillance de la souche avec une résolution sous-micron d'une manière sans référence. À l'aide d'un processus de modelage photolithographique à deux photons, nous démontrons comment générer des substrats synthétiques réglables mécaniquement et bioactivement contenant des rangées intégrées de marqueurs fiducial fluorescents pour mesurer facilement les trois dimensions ( 3D) profils de déformation des matériaux en réponse aux tractions de surface. À l'aide de ces substrats, les profils de tension cellulaire peuvent être cartographiés à l'aide d'une seule pile d'images 3D d'une cellule d'intérêt. Notre objectif avec cette méthodologie est de faire de la microscopie de force de traction un outil plus accessible et plus facile à mettre en œuvre pour les chercheurs qui étudient les processus de mécanotransduction cellulaire, en particulier les nouveaux arrivants sur le terrain.

Introduction

La microscopie de force de traction (TFM) est le processus d'approximation des tractions cellulaires à l'aide de champs de déplacement interpolés de marqueurs fiducial générés par une cellule adhérente et contractile. En utilisant TFM, l'influence des indices mécaniques dans l'environnement extracellulaire sur les processus cellulaires importants tels que la prolifération, la différenciation et la migration peut être étudiée1,2,3,4 ,5,6,7,8,9,10,11,12. Malheureusement, de nombreuses approches existantes peuvent être difficiles à mettre en œuvre ou exiger une connaissance des outils d'analyse et de calcul hautement spécialisés qui rendent l'ondes de POINTE difficile à utiliser pour les chercheurs inexpérimentés. Nous décrivons une méthodologie pour générer une plate-forme TFM qui élimine une partie de la difficulté d'analyse tout en fournissant également l'acquisition de données à haut débit.

Parmi les approches TFM existantes, la plus couramment utilisée pour quantifier la souche matérielle consiste à incorporation de petits marqueurs fluorescents (généralement des perles fluorescentes de la taille d'un nanomètre ou d'un micromètre) dans un hydrogel déformable, comme le polyacrylamide (PAA) ou le poly (éthylène glycol) diacrylate (PEGDA)13,14,15. Ces approches à base de perles permettent de regrouper densément les marqueurs fiduciaux autour d'une cellule d'intérêt afin de maximiser l'échantillonnage par déplacement. Malheureusement, la distribution des perles dans l'hydrogel ne peut pas être directement contrôlée de sorte que l'organisation spatiale est aléatoire. Ce placement aléatoire conduit à des problèmes tels que les perles qui sont trop proches les uns des autres pour résoudre avec précision, ou si la propagation que les taches du substrat donnent des données de faible qualité. L'incapacité de prédire où se trouvent les marqueurs fiducial en l'absence de cellules crée également une contrainte que, pour chaque ensemble collecté de données de traction cellulaire, une image de référence supplémentaire des marqueurs sous-jacents dans un état détendu doit également être capturée. L'image de référence est nécessaire pour que le déplacement dans l'image stressée puisse être approximatif comme la différence entre les images stressées et non stressées. Pour atteindre un état détendu, les cellules mesurées sont soit chimiquement détendues, soit complètement enlevées. Ce processus empêche souvent l'acquisition d'autres mesures expérimentales, inhibe les études cellulaires à long terme et limite le débit. Une image de référence nécessite également des techniques d'enregistrement d'images pour tenir compte de la dérive qui peut avoir eu lieu pendant l'expérimentation, conduisant souvent à l'appariement manuel encombrant des images d'état de stress aux images de référence.

D'autres méthodes TFM jugées sans référence, mettent en œuvre une certaine forme de contrôle sur la distribution des marqueurs fiducial, soit par lithographie haute résolution, impression par microcontact, ou micromolding16,17,18 ,19,20. Le TFM sans référence est réalisé en supposant que l'état détendu de chaque marqueur fiducial peut être prédit en fonction de la façon dont les positions de marqueur ont été prescrites pendant le processus de fabrication. Ces méthodes permettent de saisir complètement l'état de tension d'une cellule au sein d'une seule capture d'image dans laquelle les déplacements de marqueurs fiducial sont mesurés par rapport à une référence implicite que l'on peut déduire de la géométrie du marqueur fiducial. Bien que l'uniformité dans le placement des marqueurs soit généralement atteinte à l'aide de ces plates-formes, elles souffrent généralement de leurs propres lacunes par rapport aux approches largement utilisées basées sur les perles, y compris : 1) une diminution de la résolution de traction; 2) diminution de l'exactitude des déplacements hors avion (dans certains cas, une incapacité totale de mesurer); et 3) diminution de la personnalisation des substrats et des matériaux de plate-forme (p. ex., présentation de ligands, propriétés mécaniques).

Pour remédier à ces lacunes, nous avons conçu une nouvelle plate-forme TFM sans référence. La plate-forme utilise la chimie activée par multiphoton pour relier un petit volume d'un fluorophore dans des emplacements 3D spécifiques dans l'hydrogel qui servent de marqueurs fiducial pour mesurer la souche matérielle. De cette façon, nous avons conçu une plate-forme qui fonctionne de la même façon que les approches basées sur les perles, mais avec l'avantage significatif que les marqueurs fiducial sont organisés en tableaux quadrillés permettant le suivi sans référence des souches matérielles. Cette propriété sans référence offre de nombreux avantages. D'abord et avant tout, il permet une surveillance non intrusive des états de traction cellulaire (c.-à-d., contourne la nécessité de détendre ou d'enlever les cellules pour acquérir des positions de référence des marqueurs fiduciaux déplacés). C'était notre objectif principal dans la conception de ce système, car nous avions l'intention d'intégrer d'autres méthodes d'analyse en aval en tandem avec TFM, ce qui peut être difficile avec des approches destructrices de point final TFM. Deuxièmement, l'utilisation d'une référence implicite basée sur des tableaux quadrillés permet une automatisation quasi complète de l'analyse des déplacements. La régularité des tableaux crée un flux de travail prévisible où l'occurrence de cas exceptionnels (c.-à-d. des données de cellules d'échantillon contenant des artefacts imprévus tels que l'espacement sous-optimal des marqueurs ou les décalages d'enregistrement) peut être maintenue au minimum. Troisièmement, l'oubli de la nécessité d'acquérir une image de référence offre la liberté de surveiller de nombreuses cellules sur un seul échantillon sur de longues périodes de temps. Cela contraste avec les approches traditionnelles à base de perles, où, selon la fidélité des mouvements automatisés de stade du microscope, les erreurs de positionnement peuvent s'accumuler et augmenter la difficulté d'enregistrer correctement les images de référence à la tension cellulaire Images. Dans l'ensemble, cette plate-forme facilite un débit plus élevé dans la collecte de données sur les tensions cellulaires.

Avec ce protocole, nous espérons familiariser les lecteurs avec la technique de lithographie à balayage laser à deux photons que nous avons mise en œuvre pour générer cette plate-forme TFM sans référence pour mesurer les composants de traction en avion et hors plane générés par les cellules enseduites en surface. Non couvert dans ce protocole est la synthèse de certains des composants monomériques. En général, ces réactions comprennent des schémas de réaction de synthèse « un pot » presque identiques décrits précédemment21, et des alternatives à ces produits peuvent également être achetées. Nous visons également à familiariser les lecteurs avec les outils logiciels que nous avons générés pour promouvoir l'utilisation de microscopes à balayage laser disponibles dans le commerce comme outils d'impression 3D et pour faciliter l'analyse des déplacements de marqueurs fiducials.

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Protocol

1. Photopolymérisation d'un hydrogel de base PEGDA

  1. Rassemblement de réactifs
    1. Recueillir le lithium phényl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP), 3.4 kDa poly (éthylène) diacrylate de glycol (PEGDA), pyrrol n-vinyl (NVP), AlexaFluor 488 étiqueté PEGDA (PEG-488), AlexaFluor 633 étiqueté PEGDA (PEG-633), et PEPtide RGDS PEGylated ( PEG-RGDS) de leurs congélateurs respectifs et amener chacun à la température ambiante.
    2. Dans les tubes de microcentrifuge ambre séparés, mesurez 3 mg de LAP, 10 mg de PEGDA, 5 mg de PEG-488, 20 mg de PEG-633, et 6 mg de peptide RGDS.
  2. Préparation de la solution pré-polymère
    1. Dissoudre le LAP dans 1 ml de phosphate tamponné salin (PBS, pH 7.4). Utilisez 200 l de la solution LAP dissoute pour dissoudre le PEGDA. Ensuite, utilisez 200 L de la solution PEGDA pour dissoudre le PEG-RGDS.
      REMARQUE : Si le contrôle de la forme cellulaire est souhaité, omettez de dissoudre PEG-RGDS dans la solution pré-polymère d'hydrogel de base, car il sera ajouté par l'intermédiaire de la lithographie de balayage laser de deux-photon plus tard dans le protocole.
    2. Utilisez 80 L de PBS pour dissoudre le PEG-488. Ajoutez 2,5 L de cette solution à la solution pré-polymère.
      REMARQUE : Le PEG-488 donnera à l'hydrogel final un signal fluorescent qui peut être utilisé pour naviguer pendant le modelage et la concentration peut être modifiée pour modifier l'intensité du signal.
    3. Filtrer la solution pré-polymère complète à l'intermédiaire d'un filtre polytétrafluoroéthylène (PTFE) de 0,2 m pour éliminer les particules qui pourraient être présentes dans la solution. Si les réactifs sont correctement synthétisés, le filtre ne doit pas être obstrué.
  3. Photopolymérisation de l'hydrogel de base
    1. Placer 3 ll de la solution pré-polymère sur une mince feuille plate d'alcanes perfluoroalkoxy (PFA). Placez des bandes plates de polydiméthylsiloxane (PDMS) plates de 150 m d'épaisseur qui entourent, mais non en contact, la goutte de solution pré-polymère. Placez un bordereau en acrylilate21,22,23,24 sur le PDMS, avec la gouttelette pré-polymère centrée sous la feuille de couverture, pour aplatir la gouttelette pré-polymère à l'épaisseur de la Entretemps PDMS.
    2. Exposer la solution pré-polymère en sandwich à la lumière UV jusqu'à ce qu'un hydrogel soit entièrement formé (environ 1 min à 14 mW/cm2 de 370-400 nm de lumière).
    3. Séparez soigneusement la bande de couverture des espaceurs PDMS et attachez-les à un plat Petri à fond ouvert à l'aide d'adhésif acrylique haute performance et à double face. Appliquer une pression sur la surface de contact adhésive pour créer un joint complet entre le couvercle, l'adhésif et le plat Petri, avec soin de ne pas casser le verre.
    4. Rincer l'hydrogel dans le plat Petri à l'aide de PBS filtré sténué pour minimiser les contaminants biologiques et particulaires.
    5. Répétez les étapes 1.3.1-1.3.4 au besoin pour créer le nombre désiré d'hydrogels.
    6. Ajoutez 8 L de NVP aux 800 oL restants de la solution LAP et conservez cette solution ainsi que PEG-633 non dissous jusqu'à ce qu'il soit prêt à être modelé.
      REMARQUE: La solution LAP avec NVP est très sensible à la lumière et polymérisera si elle n'est pas maintenue dans l'obscurité. Envelopper le tube dans du papier d'aluminium peut aider à améliorer sa durée de conservation.

2. Création d'instructions de modelage

  1. Conception d'une image binaire
    1. Pour créer un masque virtuel pour prescrire des tableaux de marqueurs fiduciaux, utilisez un logiciel de traitement d'image ou de dessin pour créer une image avec un rapport d'aspect de 100:1 (p. ex., 2000 pixels de long x 20 pixels de large).
    2. Créez une rangée de 100 pixels blancs uniformément espacés sur un fond noir centré le long axe de l'image.
    3. Enregistrer cette image en tant que fichier.tif.
      REMARQUE: Si le contrôle de la forme cellulaire est souhaité21,25,26,27,28, créer un masque virtuel supplémentaire. Utilisez une toile d'image en forme de carré et créez des traits blancs positifs sur un fond noir. Pour approximer une taille appropriée pour les caractéristiques blanches (qui éventuellement soutiendra l'adhérence cellulaire) supposent que la taille totale de l'image est équivalente à la taille du champ de vision du microscope utilisé pour la lithographie de balayage laser.
  2. Conversion d'une image binaire en masque numérique
    1. Téléchargez gratuitement les fonctions LSM-ROI-Generator disponibles au dépôt de logiciels29.
    2. Ouvrez Matlab et trouvez le répertoire des fichiers de fonction téléchargés. Une fois dans le répertoire, ouvrez le script Matlab de run-script.m et exécutez le script.
    3. Sélectionnez le fichier binaire.tif pour la conversion. Ensuite, sélectionnez un dossier pour enregistrer les fichiers régions.
    4. Entrez la taille finale désirée, en microns, de l'image sélectionnée. L'image d'entrée sera mise à l'échelle et dimensionnée pour correspondre à ces paramètres. Pour que l'image entière s'adapte dans le champ de vision du microscope, la taille totale de l'image doit être inférieure ou égale à la taille du champ de vision du microscope.
    5. Si vous créez un tableau de pixels unique, dans les options ROI-Générateur, assurez-vous de décocher la case À cocher Supprimer sous Les Petites Régions/Single Pixels, de cocher la case à cocher étiquetée Squares, et de décocher l'utilisation sous Lignes de rupture horizontales. Ensuite, cliquez sur OK.
      REMARQUE : Si la création d'un fichier de régions pour créer des modèles de cellules uniques est appropriée.
    6. Trouvez le fichier '.ovl'ovl qui en résulte dans le dossier spécifié précédemment. Ce fichier doit être apporté au microscope pour charger les régions désirées qui contrôlent l'obturateur laser pendant la lithographie de balayage laser à deux photons.

3. Fabrication de tableaux de marqueurs fiducial

  1. Trempage de l'hydrogel de base
    1. Dans des conditions de faible luminosité, ajouter 200 'L de la solution LAP/NVP à l'AF633 (tous deux préparés à l'étape 1). Bien mélanger tout en protégeant de la lumière.
    2. Retirez toute la solution PBS du plat Petri contenant un hydrogel PEGDA de l'étape 1.
    3. Ajouter le PEG-633 dissous à l'hydrogel pour former une gouttelette qui englobe complètement l'hydrogel de base.
      REMARQUE: Si le trou dans le plat Petri est seulement légèrement plus grand que l'hydrogel, il peut servir comme un puits pour tenir la solution de modelage. Sinon, assurez-vous que le bordereau est complètement sec avant d'ajouter la solution de modelage ou il peut s'échapper de l'hydrogel provoquant l'hydrogel de se déshydrater pendant le modelage.
    4. Chargez le plat Petri sur le porte-échantillon sur la scène du microscope et placez le couvercle sur le plat Petri. Laissez la solution de modelage s'infiltrer dans l'hydrogel pendant au moins 30 min dans l'obscurité.
      REMARQUE : Le microscope peut être allumé et configuré pendant ce temps de trempage. L'utilisation du laser 488 nm pour l'image de l'hydrogel pendant le trempage est très bien.
  2. Configuration du microscope
    1. À l'aide d'une ligne laser de 488 nm et de filtres appropriés pour l'image AlexaFluor 488, localisez l'hydrogel à l'aide du signal PEG-488. Bloquer la collecte des longueurs d'onde d'émission plus longues du détecteur car celles-ci seront saturées de signal du PEG-633.
    2. Trouvez le centre de l'hydrogel dans le plan XY en utilisant des balayages de tuiles verticales et horizontales et zéro la position de la scène ici.
    3. Trouvez la surface de l'hydrogel à l'aide de balayages de ligne et de la fonction z-stack. Zéro la position de mise au point ici. Nivelez l'hydrogel en répétant ces balayages de ligne loin du centre XY pour identifier la position de surface et ajuster les vis de jeu pour l'étape de microscope.
    4. Dans l'espace de travail du logiciel microscope, créez un fichier d'expérience distinct pour le photopatterning. Définir la puissance multiphoton à 1,8 % (15,5 mW à 740 nm mesurée à l'ouverture arrière de l'objectif) et la vitesse de numérisation à 6 (0,1 m/s). Ajustez la taille du cadre d'image en pixels pour obtenir une taille de pixel de 0,1 m par pixel et un rapport d'aspect de 100:1.
    5. Chargez le fichier des régions (.ovl) créé à l'étape 2.2 dans l'onglet régions. Utilisez une macro pour définir toutes les régions à l'acquisition.
    6. Activez la fonction z-stack et fixez l'espacement à 3,5 m pour une profondeur totale de 28 m et un nombre total de z-tranches de 9.
    7. Utilisez la fonction de position pour définir des emplacements spécifiques sur l'hydrogel où les tableaux de marqueurs fiducial seront photopatterned.
      REMARQUE : L'emplacement z de ces positions dictera la position centrale de chaque z-stack ; lors de la mise en place des positions, assurez-vous que chaque position garantira que le volume modelé se chevauchera avec l'hydrogel à tous les emplacements de surface.
    8. Utilisez la fonction de tuile pour spécifier des lignes et des colonnes supplémentaires à chaque position. Veillez à éviter les chevauchements de régions à motifs. Idéalement, assurez-vous que les zones à motifs sont suffisamment proches pour éliminer les emplacements vides et inutilisables entre les positions.
  3. Photopatterning les tableaux de marqueurs fiducial
    1. Comme le temps de trempage s'approche de la marque de 30 min, prendre successivement z-pile scans ligne de la surface de l'hydrogel toutes les 5 min pour vérifier le gonflement basé sur les changements dans l'emplacement de la surface par rapport à la position de mise au point zéro.
    2. Si aucun changement de position de surface ne se produit sur un intervalle de 5 min, chargez et exécutez les paramètres de modelage créés à l'étape 3.2.4
    3. Une fois l'expérience de modelage terminée, utilisez le laser de 488 nm pour vérifier que la surface de l'hydrogel ne bougeait pas pendant le modelage.
      REMARQUE : Si la surface de l'hydrogel n'est pas dans la même position qu'avant le modelage, plusieurs scénarios existent. L'hydrogel n'avait pas atteint l'équilibre de gonflement avant le modelage, l'hydrogel a commencé à sécher pendant le modelage, ou le microscope a éprouvé la z-drift. La source de cette traduction de surface doit être identifiée et corrigée dans les exécutions de modelage suivantes.
    4. Retirer l'hydrogel du microscope et aspirer la solution PEG-633 du plat Petri.
      REMARQUE : L'hydrogel est encore extrêmement sensible à la lumière. Garder l'hydrogel dans l'obscurité est très important jusqu'à ce que tout le rinçage est terminé.
    5. Rincer l'hydrogel 3 fois avec du PBS filtré stérile, en veillant à éliminer complètement le rinçage entre chaque rinçage successif. Répétez ce triple rinçage toutes les 15 min pendant 1 h.
    6. Laisser l'hydrogel rincer en PBS pendant la nuit.
      REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici.
    7. Tripler l'hydrogel avec PBS. Ensuite, tripler rapidement l'hydrogel avec une solution d'éthanol à 200 preuves, suivie d'un autre triple rinçage avec PBS. Ne laissez pas l'hydrogel reposer dans 200 éthanol de preuve pendant de longues périodes de temps.
      REMARQUE : Certains composants de la solution de modelage peuvent s'écraser hors de la solution et se déposer sur la surface de l'hydrogel et apparaître comme une couche solide de fluorescence (1-5 microns d'épaisseur) sous l'éclairage de 633 nm. Le rinçant à l'éthanol 200 devrait éliminer ces composants indésirables.
  4. Utilisation de photopatterning successifs pour générer des modèles de cellules uniques (facultatif)
    REMARQUE : Si le contrôle de la zone et de la forme de propagation cellulaire est souhaité, plusieurs tours de modelage peuvent être effectués. Le gel de base doit avoir PEG-RGDS omis de sa formulation initiale. Il est recommandé d'effectuer le modelage des tableaux de marqueurs fiducial s'effectuer en dernier pour éviter le blanchiment des marqueurs fiducial fluorescents.
    1. Dissoudre 20 mg de PEG-RGDS dans la solution LAP/NVP préparée à l'étape 1.
    2. Répétez les étapes 3.1 à 3.3 en utilisant la solution PEG-RGDS au lieu de la solution PEG-633. Utilisez le fichier régions appropriés qui définit les modèles de cellules individuelles (voir l'étape 2 pour les instructions).
      REMARQUE : Pour visualiser les tableaux de modèles PEG-RGDS, il existe plusieurs options. Une variante fluorescente de PEG-RGDS peut être utilisée21,30 ou le PEG-RGDS peut être dopé avec PEG fluorescent. Recommandé: Alternativement, la ligne laser de 488 nm peut être exécuté en tandem avec le laser à motifs multiphoton pour blanchir le signal PEG-488 dans l'hydrogel de base, créant des régions non fluorescentes qui coïncident avec l'incorporation de RGDS.

4. Visualiser les tableaux de marqueurs fiducial

  1. Acquisition d'une image z-pile du tableau fabriqué
    1. Remplacer PBS dans le plat Petri avec le support cellulaire utilisé pour la culture cellulaire.
      REMARQUE : Le support sans phenol rouge est recommandé pour une utilisation lors de l'acquisition d'image afin de prévenir la phototoxicité.
    2. Après 1 h de temps de trempage, utilisez un microscope à fluorescence à champ large équipé d'un module d'éclairage structuré et d'une lentille objective d'immersion d'eau à haute grossissement pour visualiser les hydrogels à l'aide d'un filtre approprié pour les marqueurs fiducial fluorescents.
    3. Recueillir une pile d'images à haute résolution (espacée de 0,4 m en Z) englobant au moins 20 m de profondeur de la surface de l'hydrogel dans l'hydrogel dans la zone à motifs, en s'assurant que la limite supérieure de la z-pile comprend au moins 1-2 images physiquement au-dessus de la zone à motifs (c.-à-d. où les marqueurs fiducial fluorescents ne sont plus visibles et où seul le bruit est présent).
      REMARQUE : L'acquisition de cette pile d'images est nécessaire pour vérifier que tous les paramètres de modélisation sont corrects et peuvent être analysés à côté des données cellulaires à l'étape 5.3.

5. Exécution de TFM à l'aide d'hydrogels photopatterned

  1. Cellules d'ensemencement
    REMARQUE : Pour maintenir la stérilité, suivez toutes les pratiques standard de culture tissulaire.
    1. Avant l'ensemencement cellulaire, suivez les protocoles standard pour la lignée cellulaire respective pour la culture et l'entretien cellulaires.
    2. (Facultatif) Si la stérilité de l'hydrogel est une préoccupation, incubez l'hydrogel pendant 24 h dans les médias contenant des antibiotiques suivis d'un rinçage avec des supports normaux.
    3. Pour les cellules de semence, d'abord re-suspendre les cellules trypsinisées dans le volume final de la presse à utiliser dans le plat hydrogel Petri.
    4. Retirez toute la solution du plat hydrogel et remplacez-la par le support chargé de cellules.
    5. Laisser l'hydrogel reposer sans être dérangé dans un support chargé de cellules pendant 10 min.
    6. Déplacer délicatement le plat Petri dans un incubateur. Maintenir les cellules de l'incubateur pendant 4 h ou jusqu'à ce que les cellules soient visiblement respectées.
    7. Remplacez les supports chargés de cellules par des supports sans cellules pour enlever les cellules non respectées.
  2. Acquisition d'images de cellules et des marqueurs fiducial
    1. Fixer la température de la chambre d'incubation sur le microscope à 37 oC et CO2 à 5 % et permettre à la chambre d'atteindre les points fixés.
    2. Placez le plat Petri sur le porte-échantillon et localisez les zones à motifs.
    3. Localiser une cellule d'intérêt (COI) et acquérir une image transmise ou fluorescente de la COI.
      REMARQUE : Cette image sera utilisée pour segmenter la limite cellulaire pendant l'analyse, de sorte que l'image doit clairement visualiser les pensionnaires cellulaires.
    4. Acquérir une pile z du tableau à motifs sous le COI comme à l'étape 4.1.4.
    5. Acquérir une deuxième ensemble d'images transmises ou fluorescentes de la cellule.
      REMARQUE : Comparez la deuxième image réglée à la première pour déterminer si les dommages cellulaires dus à la phototoxicité sont observés et si les paramètres d'acquisition d'image doivent être ajustés. Les cellules qui rétrécissent après l'exposition ont probablement subi des effets phototoxiques importants, ce qui peut affecter les résultats.
    6. Répétez les étapes 5.2.3-5.2.5 pour chaque IC.

6. Analyse des images

  1. Préparation des fichiers d'images aux fins d'analyse
    1. À l'aide des données recueillies à l'étape 5.2, préparez une pile d'images recadrées de la zone autour d'une ICo de telle sorte que l'image inférieure (première image) de la pile représente la première image où : (1) -80% des colonnes de marqueurs à motifs sont visibles, (2) l'image la plus haute (dernière image) dans la pile ne contient plus de marqueurs fiduciaux visibles (c.-à-d., au-dessus de la surface d'hydrogel), et (3) il y a au moins 20 m de marqueurs fiducial non stressés entourant le COI.
      REMARQUE : Le recadrage des images réduit considérablement le temps de calcul pendant l'analyse. Le code d'analyse dans les étapes ultérieures peut être exécuté sans recadrage des images, mais ce n'est pas recommandé.
    2. Créez une image recadrée de l'image transmise et/ou fluorescente pour correspondre au recadrage XY de la pile dans l'étape précédente.
    3. Utilisez l'image transmise ou fluorescente recadrée, selon la forme la plus représentative de la forme de la cellule, pour segmenter l'image à la main (tracer la bordure cellulaire) ou via des outils de traitement d'image.
    4. Convertissez cette image en une image binaire où l'intérieur de la cellule est noir (c.-à-d. intensité 0) et où la zone entourant la cellule est blanche (c.-à-d. intensité 0). Enregistrer cette image comme Mask.tif binaire.
    5. Pour chaque COI, collectez le fichier de pile d'images, le fichier d'image transmis et le fichier de masque binaire dans un seul dossier.
  2. Exécution des scripts d'analyse sur les images
    1. Cloneoutélécharger ou télécharger les fonctions d'analyse TFM disponibles gratuitement au dépôt de logiciels29. L'ensemble du référentiel doit être téléchargé car il y a un nombre important de dépendances dans les sous-dossiers.
    2. Ouvrez Matlab et ajoutez le répertoire et tous les sous-dossiers du clone local du référentiel de code au chemin.
    3. Définir le répertoire dans l'espace de travail Matlab à l'emplacement du dossier où les images préparées à l'étape 6.1 ont été stockées.
    4. Ouvrez et exécutez le script tracking.m. Lorsque vous êtes invité, suivez les instructions pour charger les images appropriées, effectuer les étapes initiales de pré-traitement et vérifier l'algorithme de suivi des objets.
    5. Une fois le script terminé, ouvrez et exécutez la fonction dispShear.m. Ce script ne doit pas nécessiter l'entrée de l'utilisateur.
    6. Une fois que le script dispShear.m est terminé, ouvrez et exécutez disp3D.m. Si vous êtes invité à ouvrir des images, suivez les instructions.
      REMARQUE : Pendant l'exécution, le script peut demander à l'utilisateur de tracer une ligne sur une image du tableau à motifs. Cette ligne doit représenter l'axe de mouvement primaire du laser à balayage pendant le modelage et devrait s'aligner avec une rangée de marqueurs fiduciaux à motifs. Ce processus indique le code quant à la direction (c.-à-d. des lignes ou des colonnes de marqueurs fiducial) donne probablement les lignes les plus alignées des marqueurs fiducial.
    7. Une fois le code dispShear.m terminé, exécutez le code dispSurface.m suivi du code interpFinal3D-2.m. Ces scripts ne doivent pas nécessiter d'entrées de la part de l'utilisateur.
      REMARQUE : Le script interpFinal3D-2.m convertit les données de déplacement en tractions de surface à l'aide d'un logiciel obtenu à l'externe, qui a été précédemment décrit31. Pour appliquer ces fonctions externes, l'interpFinal3D-2.m interpole les données de déplacement dans des grilles uniformes pour servir d'entrées pour les fonctions de conversion. Si vous utilisez une méthode de conversion différente, ou si les tractions ne sont pas nécessaires, cette étape peut être ignorée.
    8. Une fois que tous les scripts ont été exécutés, assurez-vous que toutes les données et les sorties peuvent être trouvées dans le répertoire initial.
    9. Répétez les étapes 6.2.3 -6.2.8 pour chaque ICo.
      REMARQUE : Dans le référentiel de code, il y a un dossier contenant des scripts qui permettent l'exécution automatique par lots de chacun des scripts sur une liste d'annuaires. Consultez les scripts d'automatisation eux-mêmes (c.-à-d. les commentaires dans le code) pour obtenir des instructions sur la façon de les utiliser.

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Representative Results

Tout au long du protocole, il y a un certain nombre de points de contrôle qui fournissent des commentaires pour évaluer la qualité de la procédure de modelage. Afin de fournir un aperçu de la façon d'évaluer les progrès réalisés à chacun de ces points de contrôle, nous fournissons les résultats représentatifs d'une expérience réelle. Les résultats mettent en évidence l'application de ce protocole effectué sur un hydrogel photopatterned préparé pour l'analyse de TFM des cellules endothéliales ombilicales humaines (HUVECs). Les résultats comprennent des données d'image brute ainsi que des sorties de données traitées à chaque étape critique.

Le premier point de contrôle se produit à l'étape 4, une fois que le tableau de marqueur fiducial a été photopatterned dans l'hydrogel. Lors de la collecte d'une pile d'images, les images résultantes doivent afficher un tableau régulier de caractéristiques à motifs (Figure 1A-C) qui oscillent en intensité en fonction de la position z dans la pile d'images. Si la surface modelée n'était pas parfaitement plane, différentes régions de chaque tranche d'image peuvent sembler hors de phase les unes avec les autres en ce qui concerne ces oscillations; cela est prévu et ne devrait pas affecter l'analyse, sauf dans les cas extrêmes.

Les points de contrôle restants utilisent les sorties de chacun des scripts exécutés pendant l'analyse d'un ICo donné. Le script tracking.m fournit plusieurs images diagnostiques, y compris une projection z de marqueurs fiduciaux fluorescents (Figure 2A) pour évaluer la qualité de prétraitement, une parcelle de couleur centroïdes détectées codée en fonction de la position z ( Figure 2B) pour évaluer la qualité de détection des objets, et une parcelle de pistes représentant des centroïdes marqueurs détectés qui ont été reliés en colonnes dans la direction z (figure 2C) pour évaluer la qualité du suivi des objets.

Pour une détection centroïde 3D précise nécessaire pour calculer les coordonnées de référence et les déplacements, les marqueurs fiducial fluorescents doivent ressembler à des formes ellipsoïdales avec une intensité diminuant radialement à partir du centre. Le script disp3D.m fournit une parcelle d'intensité en fonction de la position Z pour chaque colonne de fonctionnalités détectées dans une pile d'images donnée (Figure 3A,B) pour évaluer la qualité des profils d'intensité des marqueurs fiducial. Les deux disp3D.m et dispShear.m ensemble fournissent des histogrammes de bruit de déplacement mesuré dans chacune des dimensions de coordonnées cartésiennes (figure 4A-C) ainsi que des cartes de chaleur interpolées du déplacement (Figure 4 E,F). Enfin, l'interpFinal3D-2.m fournit des cartes thermiques des tractions de surface calculées à l'aide du code externalisé (figure 5)31.

Figure 1
Figure 1 : Résultats typiques de modelage.
(A) Images fluorescentes de marqueurs fiducial affichant des fluctuations d'intensité à travers la dimension Z de la surface de l'hydrogel à 12,4 m à l'intérieur de l'hydrogel. (B) Un rendu volumétrique traité révèle la forme ellipsoïdale des marqueurs fiducial. (C) Vues de profil sectionnelles du rendu volumétrique affichent des données de marqueurs brutes. A,C : Barre d'échelle de 5 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Sorties diagnostiques de l'algorithme de suivi des particules.
Le logiciel de détection et de suivi des objets produit plusieurs images diagnostiques, y compris (A) une projection pondérée en Z des marqueurs fiducial fluorescents et (B) une parcelle de dispersion des positions de marqueur avec la couleur codée Z-position. (C) Une sortie supplémentaire affiche une projection pondérée en z, comme dans (A), avec des détections 2D de chaque image reliée en colonnes. (D) Un examen plus attentif (B) montre plus clairement les détections 2D individuelles couleur codée par z-position. A: Barre d'échelle de 20 m. C : Barre d'échelle de 5 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Sorties diagnostiques de l'algorithme de déplacement 3D.
(A, B) Les parcelles de ligne d'intensité de marqueur en fonction de la position du cadre affichent des oscillations entre les marqueurs regroupés dans la direction verticale. Ces parcelles de ligne permettent une évaluation qualitative de l'alignement de la grille avec le plan d'imagerie, ainsi que la qualité globale des marqueurs fiducial modelés. (A) Les oscillations qui se chevauchent dans l'intensité des marqueurs confirment l'alignement acceptable du plan d'imagerie avec les tableaux de marqueurs fiducial à motifs. L'inclusion d'images vides en haut d'une pile Z permet le calcul automatisé d'un seuil de bruit dans le logiciel de traitement. (B) Le mauvais chevauchement entre les oscillations est souvent révélateur d'un mauvais alignement des grilles à motifs avec le plan d'imagerie, mais peut également suggérer que la grille elle-même est mal alignée et peut donner de mauvais résultats. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Sorties diagnostiques des algorithmes de déplacement 2D et 3D.
(A-C) Les histogrammes des déplacements mesurés dans les régions considérées comme « non déformées » (c.-à-d. le bruit de déplacement) fournissent une évaluation quantitative de l'exactitude des lignes de référence calculées pour les positions de référence des marqueurs approximatives. Les champs de déplacement fournissent une représentation visuelle des déplacements mesurés hors plan (normal) à la fois(D) dans le plan (cisaillement) et (E) hors du plan (normal). DB : Barre d'échelle de 20 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Sorties diagnostiques de l'algorithme de conversion de traction.
(A-C) Les contraintes de traction peuvent être calculées en fonction des champs de déplacement interpolés pour déterminer la traction totale (B) (C) et (D) la traction normale. R : Barre d'échelle de 20 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

L'objectif de ce protocole est de fournir un flux de travail qui atténue une grande partie de la difficulté associée à la génération et à l'analyse des données TFM. Une fois préparés, les hydrogels photopatterned sont simples à utiliser, exigeant seulement la connaissance des pratiques standard de culture de tissu et de la microscopie de fluorescence. L'aspect sans référence permet une navigation insouciante sur les hydrogels chargés de cellules et élimine les étapes encombrantes de traitement d'image telles que l'enregistrement d'images entre les images de référence et les images déformées. L'analyse qui en résulte est presque entièrement automatisée et les données des ICO individuelles peuvent être analysées du début à la fin en moins de 10 min.

Les principaux défis de ce protocole découlent de la fabrication de l'hydrogel photopatterned. Étant donné que la plupart des réactifs utilisés dans le protocole sont synthétisés à l'interne, nous nous attendons à ce que les utilisateurs ayant peu d'expérience à l'aide de matériaux hydrogel synthétiques puissent être quelque peu dissuadés de tenter ce protocole. Cela dit, tous les composants PEGylated utilisés dans ce protocole sont synthétisés à partir de protocoles presque identiques à l'aide de réactions d'un pot et de nombreux composants peuvent être achetés auprès de fournisseurs commerciaux.

Ce protocole nécessite également une certaine maîtrise de l'utilisation de microscopes à balayage laser. Les paramètres de balayage laser doivent être optimisés pour chaque microscope différent, car les intensités laser, les lentilles objectives et d'autres composants du microscope varient, même entre les microscopes d'un même modèle. Une approche simple pour déterminer les meilleurs réglages de microscope pour le photo-modèle est d'effectuer un panneau de balayages avec des paramètres variés. Tout réglage qui affecte l'exposition totale au laser reçue par l'échantillon aura une incidence sur la taille et la qualité des marqueurs à motifs. Cela comprend : la vitesse de balayage, la taille des pixels, le nombre moyen, la puissance/intensité/fluence laser, le grossissement et l'ouverture numérique32,33. Il est souvent plus facile d'ajuster la puissance laser et la vitesse de balayage et il est donc recommandé de commencer avec ces deux paramètres. Il convient également de noter que le logiciel utilisé pour générer des fichiers régions a été conçu spécifiquement pour la marque de microscopes que nous utilisons et peut-être besoin d'être augmenté pour accueillir d'autres marques de microscope et des modèles. Avec les paramètres fournis dans le protocole, l'utilisateur doit s'attendre à générer des marqueurs ellipsoïdaux avec des profils d'intensité 3D gaussien-like de pleine largeur demi-max dimensions de 0,84 - 0,11 m en XY et 3,73 - 0,30 m en Z. L'algorithme de détection d'objets utilise un centre de masse d'intensité pour identifier les centroïdes marqueurs et fonctionnera mieux lorsque les marqueurs présentent un gradient d'intensité défini.

Le rinçage adéquat de l'hydrogel et sa protection contre la lumière et contre les contaminants est d'une importance cruciale pour la culture cellulaire. Comme mentionné dans le protocole, certains des composants de modelage peuvent s'écraser hors de la solution et le dépôt sur la surface de l'hydrogel. Si ces composants ne sont pas complètement rincés à partir de la surface, l'adhérence cellulaire peut être affectée de façon imprévisible. Si elle est exposée à la lumière du spectre UV, même à petites doses, tandis que l'hydrogel est trempé dans la solution de modelage, la solution de modelage va commencer à polymériser et donnera de mauvais résultats. Enfin, les particules en suspension dans l'air ou les particules non filtrées compliqueront l'analyse, surtout si elles sont fluorescentes. Une attention particulière devrait être prise pour empêcher ces contaminants d'entrer dans l'échantillon à toutes les étapes du protocole.

Le code d'analyse prédit les emplacements de référence des marqueurs fiduciaux déformés en prédisant le tableau original à partir de marqueurs non déformés dans la même ligne ou colonne que le marqueur déformé. Bien que cela simplifie considérablement l'analyse, il impose également certaines restrictions sur ce qui peut ou ne peut pas être analysé. À tout le moins, chaque marqueur déformé analysé devrait avoir 2 ou plusieurs membres de sa colonne et de sa rangée de marqueurs qui ne sont pas déformés de sorte qu'une prédiction précise peut être faite. Une ligne est définie par le groupe de points imprimés dans une seule ligne scan sur le microscope, et une colonne est définie par des marqueurs modelés sur un seul axe vertical à l'aide d'une fonction z-stack. Cela limite l'analyse aux cellules individuelles ou aux petits amas cellulaires en fonction de la longueur et de la profondeur de chaque zone à motifs. Il est important de noter que cela n'est pas corrigé en plaçant deux régions à motifs parfaitement à côté de l'autre. C'est parce que bien que les composants XY peuvent s'aligner, il n'est pas possible d'aligner parfaitement les composants positionnels Z des tableaux, à moins que la surface de l'échantillon est parfaitement au niveau du plan focal et de la scène. La meilleure façon d'éviter cette limitation est d'employer des tours supplémentaires de modelage qui dictent spécifiquement le placement de ligand d'adhérence. Si aligné correctement, l'adhérence cellulaire peut être limitée aux zones utilisables sur les modèles.

Le code d'analyse a été optimisé pour les tableaux carrés où les marqueurs sont espacés d'environ 3,5 m en Z et de 2,1 m en X et Y. L'espacement final variera en fonction de la fidélité et de l'enflure des motifs, mais cela ne devrait pas avoir d'impact considérable sur les performances si l'espacement dans la rangée est constant (la variabilité de l'espacement inter-lignes n'affectera pas le suivi). Bien que le code puisse s'exécuter jusqu'à l'achèvement sur des tableaux prescrits différemment, son état actuel peut donner de mauvais résultats si les tableaux ne correspondent pas aux paramètres énumérés ici. Nos objectifs actuels pour le code d'analyse sont d'inclure le support de l'espacement variable ainsi que des tableaux triangulaires, ce qui peut améliorer la précision de la reconstruction de traction et réduire les biais régionaux par rapport aux tableaux carrés.

Pour conclure, nous fournissons une approche de TFM qui permet la collecte et l'analyse faciles des données DEM sans perturber la fonction cellulaire. Notre objectif avec cette approche est de fournir une approche TFM plus accessible et non intrusive, sans compromettre la résolution et la qualité des données TFM. Nous nous attendons à ce que cette méthodologie favorise la convergence des connaissances biochimiques des phénotypes cellulaires avec les propriétés physiques observées des cellules.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

O. A. Banda a reçu le soutien d'une bourse NSF IGERT SBE2 (1144726), de fonds de démarrage fournis par l'Université du Delaware et du National Institutes of Health/National Cancer Institute IMAT Program (R21CA214299). Le JHS bénéficie d'un financement du Programme IMAT des National Institutes of Health/National Cancer Institute (R21CA214299) et du Programme de prix CAREER de la National Science Foundation (1751797). L'accès à la microscopie a été soutenu par des subventions du NIH-NIGMS (P20 GM103446), de la NSF (IIA-1301765) et de l'État du Delaware. Le microscope à éclairage structuré a été acquis avec des fonds du Programme fédéral de subventions à la recherche et au développement de l'État du Delaware (16A00471). Le microscope confocal LSM880 utilisé pour la lithographie à balayage laser à deux photons a été acquis grâce à une subvention d'instrumentation partagée (S10 OD016361).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrodisc Syringe Filter, 0.2 μm Supor Membrane, Low Protein Binding Pall PN 4602 Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips in-house in-house Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24
Axio-Observer Z1 w/Apotome Zeiss Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM.
Chameleon Vision ii Coherent Inc. Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography.
Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil 3M Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes.
Flexmark90 PFW Liner FLEXcon FLX000620 Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter.
LSM-880 Zeiss Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography.
MATLAB Mathworks R2018a Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data.
Model SC Plotter USCutter SC631E Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes.
Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27 Zeiss Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM.
PEG-AF633 in-house in-house Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21
PEG-DA in-house in-house Base material for hydrogels. See reference: 21
PEG-RGDS in-house in-house RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21
Petri Dishes CELLTREAT 229638 8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 3097358-1004 For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS).
Syringe, Leur-Lok, 1 mL BD 309628 Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
UV Lamp UVP Blak-Ray® B-100AP Polymerizes base hydrogel.
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) Sigma-Aldrich V3409-5G Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography.

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References

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Fabrication et mise en œuvre d'une plate-forme de microscopie de traction sans référence
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Banda, O. A., Slater, J. H. Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform. J. Vis. Exp. (152), e60383, doi:10.3791/60383 (2019).

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