طريقة موثوقة وسهلة الاستنساخ لإعداد وظيفية، والأشعة تحت الحمراء القريبة تنبعث منها مجموعات نانوية الذهب المنبعث بالضوء والكشف المباشر داخل خلايا هيلا عن طريق تدفق قياس الخلايا والمسح المجهري ليزر بؤري.
على مدى العقد الماضي، شهدت مجموعات النانو الذهبية الفلورية (AuNCs) شعبية متزايدة في التطبيقات البيولوجية وكرست جهود هائلة لتطويرها. في هذا البروتوكول، تم وصف طريقة متطورة وسهلة مؤخرًا لإعداد الأونيك القابلة للذوبان في الماء والمتوافقة بيولوجيًا والغروانية القريبة من الأشعة تحت الحمراء الباعثة للأشعة تحت الحمراء. هذا غرفة درجة الحرارة، من أسفل إلى أعلى التركيب الكيميائي يوفر AuNCs وظيفية بسهولة توج مع حمض الثيوتيك والبولي إيثيلين glycol المعدلة ثيول في محلول مائي. النهج الاصطناعية لا يتطلب المذيبات العضوية أو تبادل ليغاند إضافية ولا معرفة واسعة من الكيمياء الاصطناعية للتكاثر. تقدم الـ AuNCs الناتجة أحماض كربوكسيليك سطحية حرة ، والتي يمكن أن تكون وظيفية مع جزيئات بيولوجية مختلفة تحمل مجموعة أمين مجانية دون التأثير سلبًا على خصائص الإضاءة الضوئية للأونيك. كما تم وصف إجراء سريع وموثوق به للقياس الكمي للخلايا المتدفقة والتصوير المجهري المحوري لمن يناب أونك من قبل خلايا HeLa. بسبب التحول ستوكس كبيرة، الإعداد السليم للمرشحات في قياس التدفق الخلوي والمجهر confocal ضروري للكشف الفعال من photoluminescence الأشعة تحت الحمراء القريبة من AuNCs.
في العقد الماضي، ظهرت ultrasmall (≤ 2 نانومتر) photoluminescent الذهب nanoclusters (PL AuNCs) كتحقيقات واعدة لكل من البحوث الأساسية والتطبيقات العملية11،2،,3،,44،5،,6،,7،,8،,9،,10. وتشمل خصائصها العديدة المرغوبة ارتفاع عدم الاستقرار الضوئي، وأقصى قدر من الانبعاثات الغيرقابلة، وأعمار الانبعاثات الطويلة، وتحولات ستوكس الكبيرة، والسمية المنخفضة، والتوافق البيولوجي الجيد، وإزالة الكلى، والاقتران الحيوي السهل. يمكن أن توفر الـ PL AuNCs إضاءة ضوئية من الأزرق إلى المنطقة الطيفية القريبة من الأشعة تحت الحمراء (NIR) ، اعتمادًا على عدد الذرات داخل الكتلة11 وطبيعة الليغاند السطحي12. NIR (650-900 نانومتر) AuNCs الباعثة واعدة بشكل خاص لطويلة الأجل في المختبر وفي الجسم الحي تصوير الخلايا والأنسجة، لأنها توفر نسبة عالية إشارة إلى ضوضاء بسبب الحد الأدنى من التداخل مع الفلور الفلورية الجوهرية، وضعف التشتت والامتصاص، واختراق الأنسجة العالية من ضوء NIR13،14.
في السنوات الأخيرة، وقد وضعت النهج المختلفة التي تستفيد من التفاعلات الكوفة Au-S لإعداد NIR-PL AuNCs توج مع مجموعة متنوعة من الليغاند التي تحتوي على ثيول13،15،16،17. بالنسبة للتطبيقات الطبية الحيوية، يجب أن تكون أوانسياب المكونات الفعالة بمكون بيولوجي لتسهيل التفاعلات الملزمة. وهكذا، AuNCs مع استقرار الغرواني العالية التي هي قابلة للوظائف بسهولة في المذيبات المائية هي مرغوب ة للغاية. الهدف العام للبروتوكول الحالي هو وصف إعداد18 من AuNCs المبلغ عنها سابقًا مع مجموعة حمض كاربوكسيليك قابلة للتشغيل على السطح من خلال استخدام حمض الثيوكتيك وجلايكول البولي إيثيلين (PEG) في بيئة مائية بالتفصيل واقترانها مع جزيئات تحمل أمينًا أساسيًا يتبع طريقة اقتران الحمض الأمين. بسبب سهولة التوليف والتكاثر العالي ، يمكن استخدام هذا البروتوكول وتكييفه من قبل باحثين من خلفيات غير كيميائية.
أحد المتطلبات الرئيسية لتطبيقات AuNCs في البحوث الطبية الحيوية هو القدرة على مراقبة وقياس AuNCs داخل الخلايا. من بين الطرق المتاحة لرصد استيعاب الجسيمات النانوية من قبل الخلايا، والتدفق الخلوي (FCM) والمسح المجهري للأشعة المحورية (CLSM) توفر قوية، وطرق عالية الإنتاجية التي تسمح قياسات سريعة من استيعاب المواد النانوية الفلورية في عدد كبير من الخلايا19. هنا ، تم تقديم طريقة FCM و CLSM للقياس والتحليل المباشرين لـ PL AuNCs داخل الخلايا ، دون الحاجة إلى أصباغ إضافية.
تم تصنيع AuNCs الباعثة للنير باستخدام نهج من أسفل إلى أعلى حيث تم التعامل مع محلول السلائف الذهبية (HAuCl4)مع ليغاند اتيول مناسبة ، تليها تخفيض Au3 +. الحد من الأيونات المعدنية في محلول مائي تميل إلى تجميع والنتائج في الجسيمات النانوية الكبيرة بدلا من NCs صغيرة جدا21. لإعداد …
The authors have nothing to disclose.
المؤلفون ممتنون لAlzbeta Magdolenova لمساعدتها في تدفق قياس الخلايا. ويعترف المؤلفون بالدعم المالي المقدم من مشروع GACR Nr. 18-12533S. وقد أُجري الفحص المجهري في مختبر الكونكورت والتنظير المجهري للفلورسينس الذي شارك في تمويله صندوق التنمية الإقليمية الأوروبي وميزانية الدولة للجمهورية التشيكية، وهي مشاريع رقم 1000.100. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 و CZ.2.16/3.1.00/21515، وبدعم من مشروع جمهورية تحرير جمهورية التشيك-BioImaging الكبيرة LM2015062.
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride | TCI Chemicals | D1601 | https://www.tcichemicals.com/eshop/en/eu/commodity/D1601/;jsessionid=3AD046E5389206AAE33C8AAB5036CDD6?gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYrO69K6Np3tYeSsAouqGndUvzzsy1hStBPuHG-X3cpTIsAqq9z0cDBoC76MQAvD_BwE |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4161 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a4161?lang=en®ion=CZ |
Disodium hydrogen phosphate dihydrate | PENTA s.r.o. | 15130-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_281.pdf |
DL-Thioctic acid, 98% | Alfa Aesar | L04711 | https://www.alfa.com/en/catalog/L04711/ |
Hydrochloric acid 35% | PENTA s.r.o. | 19350-11000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_512.pdf |
Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate, ACS, 99.99% (metals basis), Au 49.0% min | Alfa Aesar | 36400 | https://www.alfa.com/en/catalog/036400/ |
O-(2-Mercaptoethyl)-O′-methylpolyethylene glycol 2000 | Sigma-Aldrich | 743127 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/743127?lang=en®ion=CZ |
Potassium chloride | PENTA s.r.o. | 16200-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_346.pdf |
Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/452882?lang=en®ion=CZ&gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYuoZKvdK_fH24F1gGugG4pamF2FFZLd36YyZmRTdGgkbm5SbyGP0jBoCoo0QAvD_BwE |
Sodium chloride | PENTA s.r.o. | 16610-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_376.pdf |
Sodium dihydrogenphosphate dihydrate | PENTA s.r.o. | 12330-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_124.pdf |
Sodium hydroxide pellets | PENTA s.r.o. | 15740-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_307.pdf |
XTT (sodium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt) | Thermo Fisher Scientific | X12223 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/X12223#/X12223 |