Summary
Um método confiável e facilmente reprodutível para a preparação de nanoaglomerados de ouro fotoluminescentes funcionais e quase infravermelhos e sua detecção direta dentro das células HeLa por citometria de fluxo e microscopia de varredura a laser confocal é descrito.
Abstract
Na última década, os nanoaglomerados de ouro fluorescentes (AuNCs) testemunharam uma crescente popularidade em aplicações biológicas e enormes esforços foram dedicados ao seu desenvolvimento. Neste protocolo, um método recentemente desenvolvido e fácil para a preparação de AuNCs emissores de água solúveis, biocompatíveis e coloides estáveis perto do infravermelho foram descritos em detalhes. Esta síntese química de baixa temperatura fornece AuNCs facilmente funcionalizáveis tampados com ácido tlástico e glicol de polietileno modificado por tiol em solução aquosa. A abordagem sintética não requer solventes orgânicos ou troca de ligantes adicionais, nem amplo conhecimento de química sintética para se reproduzir. Os AuNCs resultantes oferecem ácidos carboxílicos de superfície livre, que podem ser funcionalizados com várias moléculas biológicas com um grupo de amina livre sem afetar adversamente as propriedades fotoluminescentes dos AuNCs. Também foi descrito um procedimento rápido e confiável para quantificação citométrica de fluxo e imagens microscópicas confocais da captação de AuNC por células HeLa. Devido à grande mudança de Stokes, a configuração adequada dos filtros na citometria de fluxo e microscopia confocal é necessária para a detecção eficiente da fotoluminescência quase infravermelha dos AuNCs.
Introduction
Na última década, nanoaglomerados de ouro fotoluminescentes (PL AuNCs) emergiram como sondas promissoras tanto1para pesquisas fundamentais quanto para aplicações práticas1,2,,33,4,,55,6,,7,,8,,9,,10. Suas muitas características desejáveis incluem alta fotosestabilidade, máxima de emissões ajustáveis, longas vidas de emissões, grandes mudanças de Stokes, baixa toxicidade, boa biocompatibilidade, liberação renal e bioconjugação fácil. Os AuNCs pl podem fornecer fotoluminescência do azul à região espectral quase infravermelha (NIR), dependendo do número de átomos dentro do aglomerado11 e da natureza do ligante de superfície12. NIR (650-900 nm) emissores de AuNCs são particularmente promissores para imagens in vitro e in vivo de longo prazo de células e tecidos, pois oferecem alta relação sinal-ruído devido à sobreposição mínima com autofluorescência intrínseca, dispersão e absorção mais fracas e alta penetração tecidual da luz NIR13,14.
Nos últimos anos, várias abordagens que se aproveitam das interações covalentes Au-S foram desenvolvidas para preparar AuNCs NIR-PL tampados com uma variedade de ligantes contendo tiol13,,15,16,17. Para aplicações biomédicas, os AuNCs devem ser funcionalizados com um componente biológico para facilitar interações de ligação. Assim, AuNCs com alta estabilidade coloidal que são facilmente funcionais em solvente aquoso são altamente desejáveis. O objetivo geral do protocolo atual é descrever uma preparação previamente relatada de18 AuNCs com um grupo de ácido carboxílico funcionalizável na superfície, empregando ácido tiocitico e polietileno glicol (PEG) em um ambiente aquoso em detalhes e sua conjugação com moléculas com uma amina primária seguindo o método de acoplamento ácido-aminado. Devido à facilidade de síntese e alta reprodutibilidade, este protocolo pode ser usado e adaptado por pesquisadores de origens não químicas.
Um dos principais requisitos para aplicações de AuNCs em pesquisas biomédicas é a capacidade de observar e medir AuNCs dentro das células. Entre os métodos disponíveis para monitorar a captação de nanopartículas por células, a citometria de fluxo (FCM) e a microscopia de digitalização a laser confocal (CLSM) oferecem métodos robustos e de alto desempenho que permitem medições rápidas de internalização de nanomateriais fluorescentes em grande número de células19. Aqui, também foram apresentados métodos FCM e CLSM para medição direta e análise de PL AuNCs dentro das células, sem a necessidade de corantes adicionais.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparação de AuNCs emissores de infravermelho próximos (1)
- Adicione 7,8 mg (37,8 μmol) ácido tlárico (TA) e 60 μL de 2 M NaOH a 23,4 mL de água ultrapura (resistividade 18,2 MΩ.cm a 25 °C) e mexa (pelo menos 1.000 rpm) até dissolver completamente (~15-20 min). Para uma dissolução mais rápida de TA, sônica a mistura. Para a síntese, recomenda-se a solução TA recém-preparada.
- Adicionar 10,2 μL de HAuCl4·3H2O (470 mg/mL) de solução aquosa para a solução.
- Após 15 min, adicione 480 μL de NaBH4 (1,9 mg/mL) agitação vigorosa (pelo menos 1.000 rpm) e mexa a mistura de reação nas mesmas condições durante a noite.
NOTA: Prepare a solução NaBH4 em água ultrapura gelada e adicione à mistura de reação imediatamente após a preparação.
NOTA: A síntese de AuNCs é facilmente escalável. Até 2 L de AuNCs foi sintetizado em um único lote, sem qualquer alteração nas propriedades ópticas das partículas. - (Crítico) No dia seguinte, purifique a solução aplicando três ciclos de centrifugação/filtração usando um dispositivo de filtragem de membrana com um corte de peso molecular de 3 kDa. Sem este procedimento de purificação, a etapa seguinte não funciona corretamente.
- Adicione o polietileno glicol exterminado por tiol (MW 2.000; 15,6 mgs; 7,8 μmol) à solução, ajuste o pH para 7-7,5 e mexa a mistura durante a noite para obter 1. Purifique a dispersão aplicando três ciclos de centrifugação/filtração usando um dispositivo de filtragem de membrana com um corte de peso molecular de 3 kDa.
NOTA: O ajuste do pH para 7-7.5 é extremamente importante. O pH mais alto pode resultar em uma mudança azul de máxima de emissão.
2. Conjugação de brometo de 3(aminopropílico)tripenylfosfosfonia (TPP) na superfície de 1
- Misture a solução 1 (24 mL) preparada na etapa anterior e 3-(aminopropílico)brometo de tripenylfosfosfonia (12 mgs, ~30 μmol). Ajuste o pH para 4,5 com 1 M HCl.
NOTA: 3-(Aminopropyl)triphenylfosfosfonia (TPP) sal de brometo foi preparado conforme descrito na literatura20. - Inicie a reação adicionando um excesso de N-(3-dimetil-aminopropyl)-N'-etilcarbodiimide cloridrato (EDC·· HCl) (60 mgs, 312 μmol). O pH da solução aumentará e não deve ser permitido ir além de 6. Monitore o pH da mistura de reação durante a primeira hora. Se o pH aumentar acima de 6, reduza-o para 4,5-6 adicionando 1 M HCl.
- Mexa a mistura de reação durante a noite à temperatura ambiente.
- Purifique a dispersão aplicando três ciclos de centrifugação/filtração usando um dispositivo de filtragem de membrana com um corte de peso molecular de 3 kDa para obter 2. Diluir 2 obtidoaqui com água ultrapura para o volume inicial de 24 mL. A concentração de Au na solução é de 200 μg/mL.
3. Cultura celular
- Células de hela de cultura (coleção de cultura HPA) no Meio de Águia modificado de Dulbecco suplementado com 10% de soro bovino fetal em 5% DE CO2 a 37 °C.
- Dividam e passem as células quando atingirem ~80% de confluência. Para minimizar a aquisição de novos mutantes, o número de propagações celulares não deve exceder 30.
4. Internalização da AuNC nas células HeLa
- Semeie as células em uma placa de 12 poços a uma densidade de 20.000 células/mL (1 mL/poço). O objetivo é alcançar ~50% de confluência após 48 h.
- A 48 h pós-semeada, aspirar o meio de cultura e adicionar 400 μL de meio de cultura completo (para controles não tratados) ou 500 μg de nanopartículas em 400 μL de meio cultivado completo (para amostras tratadas) a cada poço. Devolva as culturas para uma incubadora de 37 °C.
NOTA: A adição de grandes volumes de solução AuNC afeta negativamente a viabilidade celular. As soluções AuNC precisam ser concentradas. Assim, 2 obtidos na etapa 2.4 estão concentrados 100 vezes. 40 mL AuNC estava concentrado a 400 μL. Uma alíquota de 25 μL desta solução concentrada foi adicionada à mídia de cultura celular de 400 μL para obter a concentração de AuNC desejada. - Após 2h de internalização, desconecte as células por tentativa padrão de acordo com o protocolo do fabricante.
- Coletar as amostras em tubos de microcentrifuge de polipropileno e centrífugas por 5 min a 350 x g a 4 °C.
- Prepare o seguinte tampão FCM: solução pré-refrigerada de soro tampão de fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1,47 mM NaH2PO4, pH 7.4) complementado com 2% de albumina de soro bovino a 4 °C.
- Lave as pelotas com 1 mL de tampão FCM e centrífuga por 5 min a 350 x g a 4 °C.
- Resuspender a pelota em 500 μL de tampão FCM e armazenar amostras a 4 °C antes da análise.
5. Análise de citometria de fluxo
- Filtrar todas as amostras usando um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL com uma tampa de coador de células.
- Antes de adquirir dados usando o software do instrumento, especifique a configuração do citómetro.
- Formatar todos os gráficos de taque e histogramas para 'Aquisições'.
- Plote um gráfico de dois parâmetros da área de dispersão para frente (FSC-A) e área de dispersão lateral (SSC-A) para mostrar a distribuição das células. Para excluir doublets, crie um gráfico de dois parâmetros de altura FSC (FSC-H) vs. FSC-A. Para monitorar a intensidade relativa de fluorescência na amostra, plote um histograma de parâmetro único para a área do canal fluorescente (FL-A). Use uma escala linear para retratar dados FSC e SSC, e uma escala logarítmica para todos os parâmetros fluorescentes.
- Adquira amostra não tratada (sem nanopartículas) a uma baixa taxa de fluxo para minimizar eventos coincidentes (se permitido pelo instrumento). Durante a aquisição, ajuste as tensões do tubo fotomultiplicador (PMT) para obter a população não tratada em escala no lote FSC vs SSC. Se necessário, ajuste as tensões pmt para o canal FL para colocar a população não manchada no canto esquerdo do histograma.
- Selecione a 'guia de portão' específica no software e desenhe um portão apropriado em torno da população desejada. As células dentro do portão se moverão para o próximo posto de controle.
- Registre 10.000 eventos por amostra.
- Registre todas as amostras as mesmas configurações do instrumento.
- Use um programa apropriado para analisar os dados de citometria de fluxo.
NOTA: Alguns aplicativos podem exigir a configuração personalizada dos filtros. Para troca de filtros sempre siga as recomendações do fabricante no guia do usuário.
NOTA: O experimento pode ser salvo e recarregado para preservar as configurações do instrumento e a estratégia de gating.
NOTA: Um gráfico de altura de dispersão lateral (SSC-H) vs. área de dispersão lateral (SSC-A) também pode ser usado para exclusão dupla. Este tipo de gating pode ser mais sensível, pois o detector FSC não costuma ser um PMT.
6. Internalização de 2 em células HeLa para microscopia de varredura a laser confocal (CLSM)
- Semeie as células em um prato de fundo de vidro de 4 câmaras de 35 mm a uma densidade de 250.000 células/mL (0,5 mL/câmara). Mantenha a câmara em uma incubadora de 37 °C com atmosfera de 5% de CO2. O objetivo é alcançar ~50% de confluência após 24 h.
- A 24 h pós-semeada, adicione 100 μg de 2 (ou 10 μL da solução de estoque de 10 mg/mL) a cada câmara de prato contendo 0,5 mL de meio com as células (para amostras tratadas).
- Devolva o prato para a incubadora. Deixe as células internalizarem os AuNCs por 24 h antes de usá-las para CLSM.
- Após o período de internalização, descarte o meio e lave as células com meio fresco pré-aquecido por 5 min. Repita o passo de lavagem mais uma vez. Em seguida, encha cada câmara com 800 μL de meio fresco.
7. Imagem CLSM de células Hela vivas rotuladas com 2
- Para imagens microscópicas, use lente objetiva de óleo 63x (n = 1.518) (NA = 1,4) em microscópio confocal com Plan-Apochromat.
- Monte o prato no estágio invertido do microscópio com a câmara aquecida a 37 °C e fornecida com atmosfera de 5% de CO2 umidificada.
- Para detectar AuNC internalizado, use um conjunto laser de 405 nm a 2% de potência com um divisor de feixe apropriado. Defina o alcance dos comprimentos de onda de detecção entre 650 e 760 nm.
- Defina a resolução da imagem para 2048 x 2048 pixels. Na configuração de velocidade de aquisição, aponte para um tempo de habitação de pixels em torno de 4 μs. Adquira a imagem com média de 2x (modo de linha, média média do método). Coloque o orifício em 1 unidade airy (para luz de 405 nm). Para maior sensibilidade, use o modo de contagem de fótons.
- Para iluminação correta na luz transmitida com contraste diferencial de interferência (DIC), use a configuração de Köhler do condensador e a parada de campo. Para aquisição de luz transmitida, utilize um laser de 488 nm a 0,7% de potência sem qualquer detector de fluorescência atribuído. Defina um divisor de feixe apropriado para o comprimento de onda do laser.
- Adquira duas imagens para cada faixa (fluorescência vermelha e DIC). Rastrear AuNCs por sua fluorescência vermelha; os limites das células são facilmente determinados na luz transmitida com imagens DIC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
NIR PL AuNCs foram preparados a partir de Au3+ na presença de TA, e então o PEG (MW 2.000) foi vinculado à superfície AuNC para obter 1 após o fluxo de trabalho mostrado na Figura 1. Acoplamento amidiano entre 1 e 3(aminopropílico) brometo de tripenylfosfonia (TPP) fornecido 2. Como esperado, os espectros de absorção (Figura 2a) indicaram que os AuNCs 1 e 2 não possuem uma faixa de plasmon de superfície característica e apresentam emissão ampla de 550 nm a 850 nm(Figura 2b). Após a fixação do TPP à superfície de 1,o PL aumentou fortemente. A emissão de AuNCs também foi visível luz UV (365 nm, Figura 2b inset). A emissão de AuNCs é estável e o comprimento de onda de emissão é independente do comprimento de onda de excitação(Figura 2c). No entanto, a intensidade das emissões é máxima quando excitada com luz UV.
2 foi detectado dentro das células HeLa monitorando o PL em um citómetro de fluxo. As células HeLa foram incubadas durante 2 horas com 2 concentrações de mídia entre 0,5 mg/mL e 2 mg/mL. Os dados do FCM confirmaram a captação de 2 por células HeLa. A fluorescência nir (>720 nm) dependia tanto do tempo(Figura 3a)quanto da concentração de 2 (Figura 3b). A intensidade máxima foi observada com o filtro 780/60 bandpass.
Os AuNCs dentro das células foram imagem não invasiva usando um microscópio padrão de varredura a laser confocal. A Figura 4 mostra a imagem confocal das células HeLa manchadas com 2 (200 μg/mL). Após 24 h de incubação foi observada fotoluminescência vermelha brilhante de 2 dentro das células.
Figura 1: Síntese dos nanoaglomerados de ouro. Fluxo de trabalho da preparação de 1 e 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Propriedades ópticas dos nanoaglomerados de ouro. Espectros de absorção normalizados(a)(Inset: Photograph of the aqueous solutions of 1 and 2 under white light) e (b) espectros fotoluminescentes de 200 μg/mL soluções aquosas de 1 e 2 (Inset: fotografia das soluções AuNC luz UV (365 nm)). (c) Mapa pl de excitação-emissão de 2. A excitação é deslocada por passos de 10 nm. O pico de emissão em torno de 750 nm é muito estável (não muda com excitação) e mostra uma enorme mudança de Stokes de excitação. A excitação mais eficiente ocorre em torno de 340 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Detecção de nanoaglomerados de ouro dentro das células HeLa por citometria de fluxo. A internalização de 2 em células HeLa foi estudada por meio de MFC. Os histogramas mostram(a)ba captação dependente da concentração de AuNCs por células HeLa. No experimento dependente do tempo, as células HeLa não foram tratadas (controle; 0 h) ou tratadas com 1,28 mg/mL 2 e incubadas a 37 °C para os tempos indicados. As células foram então lavadas com PBS e analisadas por MFC. No experimento dependente da concentração, as células HeLa não foram tratadas (controle; 0 mg/mL) ou tratadas com as concentrações indicadas de 2 e processadas da mesma forma. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagem CLSM de células HeLa rotuladas com os nanoaglomerados de ouro. As células HeLa foram incubadas com 2 (200 μg/mL) por 24 h e com imagem com CLSM. (a) Representa canal de fluorescência vermelha (650-760 nm); b Canal de luz transmitido (DIC) e(c)é sobreposição de (a) e (b). Barra de escala, 50 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura Suplementar 1: Teste de estabilidade de 1. Espectro spectra de fotoluminescência de 1 em 1 M NaCl a 0 h e depois de 72 h. A intensidade foi normalizada ao máximo. Clique aqui para baixar este número.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Os AuNCs emissores de NIR foram sintetizados utilizando-se uma abordagem de baixo para cima na qual a solução precursora de ouro (HAuCl4) foi tratada com ligantes thiol adequados, seguida de redução de Au3+. A redução de íons metálicos em solução aquosa tende a agregar e resulta em nanopartículas grandes em vez de NCs ultrapequenas21. Para preparar os AuNCs PL ultrapequenos (≤2 nm), as condições sintéticas foram ajustadas para evitar a formação de grandes partículas e promover a formação de aglomerados ultrapequenos. A natureza dos ligantes utilizados para tampar a superfície AuNC também desempenha um papel importante na influência da estrutura, propriedades eletrônicas e ópticas das partículas12,,22,,23,,24,,25,26,27,,28,,29,,30. Portanto, escolher ligantes adequados capazes de estabilizar clusters ultrapequenos é a chave para obter AuNCs altamente fluorescentes. Os ligantes contendo tiol são os estabilizadores mais utilizados na síntese de AuNCs, devido à forte ligação covalente entre tiols e ouro. Um relatório anterior31 indica que os ligantes à base de multitiol são muito superiores aos ligantes monotiol na estabilização dos AuNCs PL. Os ligantes multi-tiol proporcionam maior estabilidade coloidal aos AuNCs devido ao maior número de locais de ligação entre a superfície do ligante e a auNC. Bidentate thiol TA foi usado para a síntese de NIR PL AuNCs porque fornece estabilidade coloidal muito melhorada para AuNCs em uma ampla gama de condições adversas em comparação com ligantes monotiol32. TA também fornece crescimento de fase aquosa de nanopartículas com controle de tamanho discreto, e o mais importante, oferece um grupo de ácido carboxílico na superfície das nanopartículas que podem ser utilizados para conjugação de moléculas biologicamente relevantes33,34.
TA estabiliza AuNCs por repulsão eletrostática causada por grupos de carboxilato deprotonados na superfície35. No entanto, em soluções ácidas, os AuNCs protegidos por TA tornam-se coloides instáveis devido à protonação do grupo carboxilato. Nanopartículas podem ser estabilizadas eletrostericamente, em vez de puramente eletrostáticamente. Essa abordagem proporciona estabilização coloidal mesmo na presença de altas concentrações de sal e alterações de pH, o que é importante para aplicações biomédicas. Para conferir estabilização eletrostérica aos TA-AuNCs, os clusters foram posteriormente funcionalizados com PEG (MW 2.000) com finalização de tiol a uma razão molar de 5:1 de TA:PEG, produzindo 1 (Figura 1). Para obter a fixação bem-sucedida do PEG com thiol,, os TA-AuNCs devem ser purificados. A funcionalização do AuNC com PEG melhorou a solubilidade aquosa no pH ácido e um aumento na estabilidade coloidal em meios de alta resistência iônica. É importante que a fixação do PEG com tiol-terminado seja realizada em pH 7.0-7.5. O pH mais alto resultaria em mudança azul da máxima de emissão. Os ligantes não ligados foram removidos por centrifugação/filtração usando um dispositivo de filtragem de membrana com um corte de peso molecular de 3 kDa. Os ligantes associados a nanopartículas experimentam uma ampliação significativa da linha em 1H NMR em comparação com ligantes livres, o que pode obscurecer as atribuições de pico e integração36. O pico de RMNsignificativamente amplo 1 H associado ao ácido tlácitico e ao polietileno glicol modificado por tiol sugere que os ligantes estão ligados à superfície auNC e à remoção de ligantes livres18. A integração bem-sucedida de AuNCs luminescentes em um ambiente biológico requer estabilidade sobre condições, como alta força iônica porque a mídia biológica é rica em excesso de íons. A estabilidade de 1 foi verificada pelo monitoramento da fotoluminescência em 1 M NaCl durante um período de 72 h. Nenhuma alteração significativa nas propriedades de fotoluminescência em 1 M NaCl indica alta estabilidade das AuNCs(Figura Suplementar 1). As AuNCs ficaram estáveis em solução tamponada por mais de um ano sem qualquer evidência de precipitação (dados não mostrados).
1 oferece ácido carboxílico na superfície. Os reagentes de acoplamento à base de carbodiimida são amplamente utilizados para ligar covalentemente ácidos carboxílicos a aminas através da formação de ligação de amida37. O reagente de acoplamento carbodiimida mais usado em solução aquosa é o cloreto de carbodiimida 1-etilaminopropida (EDC⁄HCl). Edc⁄HCl tem sido utilizado para acoplamento covalente de brometo TPP com 1 para obter 2. Uma das principais vantagens deste protocolo é a conjugação de moléculas com um grupo de amina primária através da formação de ligação amida sem comprometer a fluorescência e estabilidade coloidal. A caracterização da microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução (HRTEM) mostrou que os AuNCs 1 e 2 têm um diâmetro médio de 1,15 ± 0,2 nm, o que indica que o acoplamento funcional não altera o tamanho do núcleo dos AuNCs18. Alternativamente, os grupos de carboxil gratuitos podem ser ativados usando EDC e Sulfo-NHS38. Soluções de 1 e 2 animados com uma lâmpada UV (365 nm) fluorescem vermelho brilhante(Figura 1b,entrada),enquanto aparecem amarelo claro iluminação ambiente(Figura 1a,inset). A conjugação tpp aumenta o PL AuNC devido à transferência de carga metal-ligand (MLCT)18.
Nanopartículas podem causar efeitos biológicos adversos que podem limitar suas aplicações na biologia. Para avaliar a citotoxicidade de 2 nas células HeLa, foi realizado o ensaio de viabilidade da célula de viabilidade da célula XTT (sódio 2, 3-bis (2-metoxi-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(fenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inopermeais) ensaio de viabilidade celular. As células HeLa tratadas com 2 (200 μg/mL) para 48 h não apresentaram perda de viabilidade celular em comparação com as células de controle. Esta observação sugere que as AuNCs são biocompatíveis, o que os torna candidatos promissores como sondas fluorescentes para aplicação em pesquisa biológica.
Quando animado com um laser de 405 nm, 2 fornece uma emissão ampla com um máximo em torno de ~750 nm. A mudança de Stokes extremamente grande (~350 nm) permite que a luz emitida seja confiável mente distinta da fonte de luz emocionante; no entanto, a configuração do filtro FCM precisa ser configurada adequadamente. Para 2, o filtro de bandpass de 780/60 nm é ideal devido à ampla zatura do filtro e ao fato de que o máximo de emissão de AuNCs está na mesma região. É muito importante utilizar filtros de bandpass largos na região da máxima de emissão para detecção eficiente do PL39,,40,,41,,42. O sinal de fluorescência dependente de tempo e dose das células tratadas com 2 sugere que o FCM pode ser usado para monitorar convenientemente estudos celulares usando AuNCs. Quando o tempo de incubação foi aumentado para 24 h, uma concentração de 40 μg/mL de 2 foi suficiente para detectar AuNCs por fluorescência em MFC (dados não mostrados). No entanto, para tempos curtos de incubação (1-2 h), são necessárias concentrações mais elevadas de AuNCs. Este método de detecção de AuNCs por sinal de fluorescência NIR com um citómetro de fluxo padrão ajudará a ampliar ainda mais as aplicações potenciais de AuNCs na ciência biomédica. A abordagem aqui descrita poderia ser usada para avaliar taxas e mecanismos de absorção celular14, relações entre concentração de nanopartículas e toxicidade celular, ou efeitos da química superficial na absorção de nanoaglomerados de forma rápida e quantitativa usando MFC.
A captação celular de 2 por células HeLa foi imagem da CLSM. Após 24 h de incubação, a emissão vermelha brilhante de 2 foi detectada após a excitação com laser de 405 nm. No entanto, um laser de 405 nm também excita os fluoróforos intrínsecos dentro das células. Para distinguir o sinal de AuNC da autofluorescência, a emissão de AuNC foi coletada acima de 650 nm. As propriedades atraentes, como luminescência quase infravermelha brilhante, alta estabilidade coloidal, boa biocompatibilidade e resultados acima demonstram que os AuNCs são agentes de imagem promissores para aplicações de imagens biomédicas e celulares.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Algumas partes dos métodos e resultados foram previamente apresentados no artigo de Pramanik et al.18 Aqui, esses métodos foram convertidos em protocolos práticos ponto a ponto. Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Alzbeta Magdolenova por sua ajuda com a citometria do fluxo. Os autores reconhecem o apoio financeiro do projeto GACR nº 18-12533S. A microscopia foi realizada no Laboratório de Microscopia Confocal e Fluorescência co-financiado pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional e pelo orçamento estadual da República Tcheca, projetos nº. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 e CZ.2.16/3.1.00/21515, e apoiado pelo projeto de RI de grande bioimagem tcheca-bioimagem LM2015062.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride | TCI Chemicals | D1601 | https://www.tcichemicals.com/eshop/en/eu/commodity/D1601/;jsessionid=3AD046E5389206AAE33C8AAB5036CDD6?gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYrO69K6Np3tYeSsAouqGndUvzzsy1hStBPuHG-X3cpTIsAqq9z0cDBoC76MQAvD_BwE |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4161 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a4161?lang=en®ion=CZ |
| Disodium hydrogen phosphate dihydrate | PENTA s.r.o. | 15130-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_281.pdf |
| DL-Thioctic acid, 98% | Alfa Aesar | L04711 | https://www.alfa.com/en/catalog/L04711/ |
| Hydrochloric acid 35% | PENTA s.r.o. | 19350-11000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_512.pdf |
| Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate, ACS, 99.99% (metals basis), Au 49.0% min | Alfa Aesar | 36400 | https://www.alfa.com/en/catalog/036400/ |
| O-(2-Mercaptoethyl)-O′-methylpolyethylene glycol 2000 | Sigma-Aldrich | 743127 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/743127?lang=en®ion=CZ |
| Potassium chloride | PENTA s.r.o. | 16200-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_346.pdf |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/452882?lang=en®ion=CZ&gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYuoZKvdK_fH24F1gGugG4pamF2FFZLd36YyZmRTdGgkbm5SbyGP0jBoCoo0QAvD_BwE |
| Sodium chloride | PENTA s.r.o. | 16610-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_376.pdf |
| Sodium dihydrogenphosphate dihydrate | PENTA s.r.o. | 12330-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_124.pdf |
| Sodium hydroxide pellets | PENTA s.r.o. | 15740-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_307.pdf |
| XTT (sodium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt) | Thermo Fisher Scientific | X12223 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/X12223#/X12223 |
References
- Wang, Y., Chen, J., Irudayaraj, J. Nuclear Targeting Dynamics of Gold Nanoclusters for Enhanced Therapy of HER2+ Breast Cancer. ACS Nano. 5 (12), 9718-9725 (2011).
- Chen, L. Y., Wang, C. W., Yuan, Z., Chang, H. T. Fluorescent Gold Nanoclusters: Recent Advances in Sensing and Imaging. Analytical Chemistry. 87 (1), 216-229 (2015).
- Dongyun, C., Zhentao, L., Li, N., Lee, J. Y., Xie, J., Lu, J. Jianmei Amphiphilic Polymeric Nanocarriers with Luminescent Gold Nanoclusters for Concurrent Bioimaging and Controlled Drug Release. Advanced Functional Materials. 23 (35), 4324-4331 (2013).
- Tan, X., Jin, R. Ultrasmall metal nanoclusters for bio-related applications. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (6), 569-581 (2013).
- Yuan, X., Luo, Z., Yu, Y., Yao, Q., Xie, J. Luminescent Noble Metal Nanoclusters as an Emerging Optical Probe for Sensor Development. Chemistry - An Asian Journal. 8 (5), 858-871 (2013).
- Zheng, K., Setyawati, M. I., Leong, D. T., Xie, J.
- Li, Q., et al. Design and mechanistic study of a novel gold nanocluster-based drug delivery system. Nanoscale. 10 (21), 10166-10172 (2018).
- Zhang, X. D., et al. Ultrasmall Au10-12(SG)10-12 Nanomolecules for High Tumor Specificity and Cancer Radiotherapy. Advanced Materials. 26 (26), 4565-4568 (2014).
- Zhang, X. D., et al. Ultrasmall Glutathione-Protected Gold Nanoclusters as Next Generation Radiotherapy Sensitizers with High Tumor Uptake and High Renal Clearance. Scientific Reports. 5, 8669 (2015).
- Zhang, X. D., et al. Enhanced Tumor Accumulation of Sub-2 nm Gold Nanoclusters for Cancer Radiation Therapy. Advanced Healthcare Materials. 3 (1), 133-141 (2014).
- Zheng, J., Zhang, C., Dickson, R. M. Highly Fluorescent, Water-Soluble, Size-Tunable Gold Quantum Dots. Physical Review Letters. 93 (7), 077402 (2004).
- Wu, Z., Jin, R. On the Ligand's Role in the Fluorescence of Gold Nanoclusters. Nano Letters. 10 (7), 2568-2573 (2010).
- Lin, C. A. J., et al. Synthesis, Characterization, and Bioconjugation of Fluorescent Gold Nanoclusters toward Biological Labeling Applications. ACS Nano. 3 (2), 395-401 (2009).
- Yang, L., Shang, L., Nienhaus, G. U. Mechanistic aspects of fluorescent gold nanocluster internalization by live HeLa cells. Nanoscale. 5 (4), 1537-1543 (2013).
- Mishra, D., et al. Aqueous Growth of Gold Clusters with Tunable Fluorescence Using Photochemically Modified Lipoic Acid-Based Ligands. Langmuir. 32 (25), 6445-6458 (2016).
- Wu, Z., Gayathri, C., Gil, R. R., Jin, R. Probing the Structure and Charge State of Glutathione-Capped Au25(SG)18 Clusters by NMR and Mass Spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 131 (18), 6535-6542 (2009).
- Stamplecoskie, K. G., Kamat, P. V. Size-Dependent Excited State Behavior of Glutathione-Capped Gold Clusters and Their Light-Harvesting Capacity. Journal of the American Chemical Society. 136 (31), 11093-11099 (2014).
- Pramanik, G., et al. Gold nanoclusters with bright near-infrared photoluminescence. Nanoscale. 10 (8), 3792-3798 (2018).
- Salvati, A., et al. Quantitative measurement of nanoparticle uptake by flow cytometry illustrated by an interlaboratory comparison of the uptake of labelled polystyrene nanoparticles. NanoImpact. 9, 42-50 (2018).
- Zhang, C. J., et al. Mechanism-Guided Design and Synthesis of a Mitochondria-Targeting Artemisinin Analogue with Enhanced Anticancer Activity. Angewandte Chemie. 128 (44), 13974-13978 (2016).
- Shang, L., Dong, S., Nienhaus, G. U. Ultra-small fluorescent metal nanoclusters: Synthesis and biological applications. Nano Today. 6 (4), 401-418 (2011).
- Higaki, T., et al. Controlling the Atomic Structure of Au30 Nanoclusters by a Ligand-Based Strategy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (23), 6694-6697 (2016).
- Li, G., et al. Tailoring the Electronic and Catalytic Properties of Au25 Nanoclusters via Ligand Engineering. ACS Nano. 10 (8), 7998-8005 (2016).
- Kim, A., Zeng, C., Zhou, M., Jin, R. Surface Engineering of Au36(SR)24 Nanoclusters for Photoluminescence Enhancement. Particle & Particle Systems Characterization. 34 (8), 1600388 (2017).
- Chevrier, D. M., et al. Molecular-Scale Ligand Effects in Small Gold–Thiolate Nanoclusters. Journal of the American Chemical Society. 140 (45), 15430-15436 (2018).
- Yuan, X., Goswami, N., Chen, W., Yao, Q., Xie, J. Insights into the effect of surface ligands on the optical properties of thiolated Au25 nanoclusters. Chemical Communications. 52 (30), 5234-5237 (2016).
- Yuan, X., Goswami, N., Mathews, I., Yu, Y., Xie, J. Enhancing stability through ligand-shell engineering: A case study with Au25(SR)18 nanoclusters. Nano Research. 8 (11), 3488-3495 (2015).
- Jiang, J., et al. Oxidation at the Core-Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence. The Journal of Physical Chemistry C. 118 (35), 20680-20687 (2014).
- Padelford, J. W., Wang, T., Wang, G. Enabling Better Electrochemical Activity Studies of H2O-Soluble Au Clusters by Phase Transfer and a Case Study of Lipoic-Acid-Stabilized Au22. ChemElectroChem. 3 (8), 1201-1205 (2016).
- Wang, T., Wang, D., Padelford, J. W., Jiang, J., Wang, G. Near-Infrared Electrogenerated Chemiluminescence from Aqueous Soluble Lipoic Acid Au Nanoclusters. Journal of the American Chemical Society. 138 (20), 6380-6383 (2016).
- Aldeek, F., Muhammed, M. A. H., Palui, G., Zhan, N., Mattoussi, H. Growth of Highly Fluorescent Polyethylene Glycol- and Zwitterion-Functionalized Gold Nanoclusters. ACS Nano. 7 (3), 2509-2521 (2013).
- Oh, E., Susumu, K., Goswami, R., Mattoussi, H. One-Phase Synthesis of Water-Soluble Gold Nanoparticles with Control over Size and Surface Functionalities. Langmuir. 26 (10), 7604-7613 (2010).
- Nair, L. V., Nazeer, S. S., Jayasree, R. S., Ajayaghosh, A. Fluorescence Imaging Assisted Photodynamic Therapy Using Photosensitizer-Linked Gold Quantum Clusters. ACS Nano. 9 (6), 5825-5832 (2015).
- Porret, E., et al. Hydrophobicity of Gold Nanoclusters Influences Their Interactions with Biological Barriers. Chemistry of Materials. 29 (17), 7497-7506 (2017).
- Shang, L., et al. One-Pot Synthesis of Near-Infrared Fluorescent Gold Clusters for Cellular Fluorescence Lifetime Imaging. Small. 7 (18), 2614-2620 (2011).
- Wu, M., et al. Solution NMR Analysis of Ligand Environment in Quaternary Ammonium-Terminated Self-Assembled Monolayers on Gold Nanoparticles: The Effect of Surface Curvature and Ligand Structure. Journal of the American Chemical Society. 141 (10), 4316-4327 (2019).
- Gao, X., Cui, Y., Levenson, R. M., Chung, L. W. K., Nie, S. In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots. Nature Biotechnology. 22 (8), 969-976 (2004).
- Bartczak, D., Kanaras, A. G. Preparation of Peptide-Functionalized Gold Nanoparticles Using One Pot EDC/Sulfo-NHS Coupling. Langmuir. 27 (16), 10119-10123 (2011).
- Dutta, D., Sailapu, S. K., Chattopadhyay, A., Ghosh, S. S. Phenylboronic Acid Templated Gold Nanoclusters for Mucin Detection Using a Smartphone-Based Device and Targeted Cancer Cell Theranostics. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (4), 3210-3218 (2018).
- Retnakumari, A., et al. CD33 monoclonal antibody conjugated Au cluster nano-bioprobe for targeted flow-cytometric detection of acute myeloid leukaemia. Nanotechnology. 22 (28), 285102 (2011).
- Pyo, K., et al. Highly Luminescent Folate-Functionalized Au22 Nanoclusters for Bioimaging. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), 1700203 (2017).
- Fernández, T. D., et al. Intracellular accumulation and immunological properties of fluorescent gold nanoclusters in human dendritic cells. Biomaterials. 43, 1-12 (2015).
