Summary
介绍了一种可靠且易于重现的方法，用于制备可功能的近红外发光金纳米簇，并通过流细胞学和共聚焦激光扫描显微镜直接检测HeLa细胞内部。
Abstract
在过去十年中，荧光金纳米簇（AuNCs）在生物应用中越来越受欢迎，并致力于其开发。在该协议中，详细介绍了一种最近开发的制备水溶性、生物相容性和胶体稳定近红外发光AuNCs的方法。这种室温自下而上的化学合成提供了易于功能的AuNCs，在水溶液中用三氯酸和三醇改性聚乙烯乙二醇盖住。合成方法既不需要有机溶剂或附加配体交换，也不需要丰富的合成化学知识来繁殖。由此产生的AuNCs提供免费表面碳碱酸，可与具有自由胺组的各种生物分子一起进行功能化，而不会对AuNCs的光致发光特性产生不利影响。还描述了HeLa细胞对AuNC摄取的流细胞程定量和共聚焦显微成像的快速、可靠的过程。由于斯托克斯发生大移位，因此，为了有效检测AuNC的近红外光致发光，必须正确设置流式细胞学和共聚焦显微镜中的滤波器。
Introduction
在过去十年中，超小型（±2 nm）光致发光金纳米簇（PL AuNC）已成为基础研究和实际,,应用11、2、3、4、5、6、7、8、9、102的有前途的探针。10,8,9,5,6,7,34其许多理想的特性包括高光稳定性、可调发射最大值、长发射寿命、大斯托克斯移位、低毒性、良好的生物相容性、肾间隙和方便的生物结合。PL AuNCs 可以提供从蓝色到近红外 （NIR） 光谱区域的光致发光，具体取决于星团11内的原子数和表面配体12的性质。NIR（650-900 nm）发射AuNCs对于细胞和组织的长期体外和体内成像特别有希望，因为它们提供高信噪比，因为与内在自荧光的最小重叠、散射和吸收较弱以及NIR光13、14,14的组织渗透率高。
近年来，利用Au-S共价相互作用的各种方法已经开发出来，以制备含有各种含Thiol配体的NIR-PL AuNCs13、15、16、17。13,15,16,17对于生物医学应用，AuNCs 必须使用生物成分进行功能化，以促进结合相互作用。因此，高胶体稳定性且在水溶剂中易于功能的 AuN 是极可取的。本协议的总体目标是描述先前报告的18种AuNCs制备，其表面具有可功能的碳化物酸组，在水环境中详细采用三氯酸和聚乙烯乙二醇（PEG），并与遵循酸-a胺耦合法的具有原胺的分子结合。由于合成的方便性和高可重复性，这种协议可以由非化学背景的研究人员使用和调整。
AuNC 在生物医学研究中的应用的关键要求之一是能够观察和测量细胞内的 AuNC。在监测纳米粒子被细胞接受的方法中，流细胞学（FCM）和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）提供了稳健、高通量的方法，能够快速测量大量细胞中荧光纳米材料的内化。这里还介绍了FCM和CLSM直接测量和分析细胞内PL AuN的方法，无需额外的染料。
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Protocol
1. 制备近红外发射AuNC （1）
- 加入7.8毫克（37.8μmol）三基酸（TA）和60μL的2米NaOH到23.4 mL的超纯水（25°C的电阻率18.2 MΩ.cm），搅拌（至少1000 rpm），直到完全溶解（±15-20分钟）。为了更快地溶解 TA，将混合物声波。对于合成，建议使用新鲜准备的 TA 解决方案。
- 将10.2 μL的HAuCl4+3H2O（470mg/mL）的水溶液添加到溶液中。
- 15分钟后，在剧烈搅拌（至少1，0004 rpm）下加入480μL的NaBH 4（1.9mg/mL），并在相同条件下搅拌反应混合物过夜。
注：在冰冷的超纯水中新鲜制备NaBH4溶液，并在制备后立即加入反应混合物。
注：AuN 的合成很容易扩展。单个批次中合成了多达 2 L 的 AuNC，粒子的光学特性没有任何变化。 - （关键）第二天，使用分子量截止3 kDa的膜过滤装置，采用三个离心/过滤周期来净化溶液。如果没有此纯化程序，以下步骤将无法正常工作。
- 在溶液中加入三醇端端聚乙烯乙二醇（MW 2，000;15.6毫克;7.8μmol），将pH值调整到7-7.5，并搅拌混合物过夜以获得1。使用分子量截止3 kDa的膜过滤装置，采用三个离心/过滤周期，净化分散。
注：将 pH 调整为 7-7.5 非常重要。较高的 pH 值可能导致最大排放的蓝色偏移。
2. 在1表面结合3（氨基丙基）三氟磷酸（TPP）
- 混合前一步准备的1种溶液（24 mL）和3（氨基丙基）溴化三氟化磷酸（12毫克，±30μmol）。使用 1 M HCl 将 pH 调整到 4.5。
注：3-（氨基丙酮）三磷酸（TPP）溴化盐制备，如文献20所述。 - 通过添加过量的N-（3-二甲基-氨基丙基）-N+-N乙基卡博迪米德盐酸（EDC]）来开始反应。 NHCl）（60毫克，312μmol）。解决方案的 pHH 将增加，不应允许超过 6。监测反应混合物的第一小时pH。如果 pH 高于 6，则通过添加 1 M HCl 将其降低至 4.5⁄6。
- 在室温下搅拌反应混合物过夜。
- 使用分子量截止3 kDa的膜过滤装置，采用三个离心/过滤周期来净化分散体，以获得2个。稀释2在这里获得与超纯水的初始体积为24 mL。溶液中的Au浓度为200微克/mL。
3. 细胞培养
- Dulbecco改良的鹰中培养HeLa细胞（HPA培养集合），在37°C的5%CO2中补充10%的胎儿牛2血清。
- 当细胞达到+80%汇合时，它们分裂并通过它们。为了尽量减少新突变体的获取，细胞传播的数量不应超过30。
4. AuNC 内化到 HeLa 细胞中
- 以20，000个细胞/mL（1 mL/孔）的密度在12孔板中播种细胞。目标是在 48 小时后实现 ±50% 的汇合。
- 在48小时播种后，将培养介质吸气，并在400μL的完整培养介质（处理过的样品）中加入400μL的完整培养介质（用于未经处理的控制）或500μg的纳米颗粒。这些培养介质为400μL的完整培养介质（处理过的样品）。将培养物返回到 37 °C 孵化器。
注： 加入大量 AuNC 溶液会对细胞的可行性产生负面影响。AuNC 解决方案需要集中使用。因此，步骤 2.4 中获得的 2 浓缩为 100 倍。40 mL AuNC 浓缩到 400 μL。在400μL细胞培养培养培养基中加入这种浓缩溶液的25μL等位，以获得所需的AuNC浓度。 - 2h内化后，根据制造商的协议，通过标准胰蛋白酶分离细胞。
- 在聚丙烯微离心管和离心机中采集样品5分钟，在4°C下以350 x g。
- 制备以下FCM缓冲液：预冷却磷酸盐缓冲盐水（PBS;137 mM NaCl，2.7 mM KCl，4.3 mM Na2HPO 4，1.47 mM NaH2PO4，pH7.4），补充2%牛血清白蛋白在4°C。4
- 用 1 mL FCM 缓冲液清洗颗粒，在 4 °C 下以 350 x g的速度将离心机清洗 5 分钟。
- 在分析前将颗粒重新悬浮在500μL的FCM缓冲液中，并将样品储存在4°C。
5. 流动细胞学分析
- 使用带细胞滤网盖的 5 mL 聚苯乙烯圆底管过滤所有样品。
- 在使用仪器软件获取数据之前，请指定细胞仪配置。
- 格式化所有点图和直方图的"收购"。
- 绘制正向散射区域 （FSC-A） 和侧散射区域 （SSC-A） 的双参数点图，以显示单元格的分布。要排除双精度值，请创建 FSC 高度 （FSC-H） 与 FSC-A 的双参数点图。要监测样品的相对荧光强度，绘制荧光通道区域（FL-A）的单参数直方图。使用线性比例来描述 FSC 和 SSC 数据，以及所有荧光参数的对数比例。
- 以低流速采集未经处理的样品（不含纳米颗粒），以尽量减少重合事件（如果仪器允许）。在采集过程中，调整光倍增管 （PMT） 电压，使未经处理的填充在 FSC vs SSC 图上达到比例。如有必要，调整 FL 通道的 PMT 电压，将未染色的填充物放在直方图的左角。
- 选择软件中的特定"门卡舌"，并在所需填充点周围绘制适当的门。大门内的单元格将移动到下一个检查点。
- 每个样本记录 10，000 个事件。
- 在同一仪器设置下记录所有样品。
- 使用适当的程序分析流细胞测量数据。
注： 某些应用程序可能需要自定义设置筛选器。对于过滤器交换，请始终遵循用户指南中的制造商建议。
注： 可以保存和重新加载实验，以保留仪器设置和浇注策略。
注： 侧散射高度 （SSC-H） 与侧散射区域 （SSC-A） 图也可用于双散。这种类型的浇注可能更敏感，因为 FSC 探测器通常不是 PMT。
6. 将2个内化到HeLa细胞内，用于共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）
- 将细胞放在4室玻璃底部35毫米的盘子上，密度为250，000细胞/mL（0.5 mL/室）。将造型室保持在 37 °C 孵化器中，营造 5% 的 CO2气氛。目标是在 24 小时后实现 ±50% 的汇合。
- 在播种后24小时，在每个含有0.5 mL的中细胞（处理过的样品）的皿室中加入100 μg2（或10μL从10mg/mL的库存溶液中）。
- 将盘子还给孵化器。在将 AuNC 用于 CLSM 之前，让细胞内部化 24 小时。
- 内化期后，丢弃介质，用预热的新鲜介质清洗细胞5分钟。再次重复洗涤步骤。然后用800 μL的新鲜介质填充每个腔室。
7. CLSM 成像带 2 标记的活希拉细胞
- 对于显微成像，使用 63 倍油 （n = 1.518） 客观透镜 （NA = 1.4） 与平面-同色马特共聚焦显微镜。
- 将盘子安装在显微镜倒置的舞台上，室加热至37°C，并随附加湿5%CO2气氛。
- 要检测内化 AuNC，请使用功率为 2% 的 405 nm 激光器，并配备适当的分束器。将检测波长范围设置为 650 到 760 nm。
- 将图像的分辨率设置为 2048 x 2048 像素。在采集速度设置中，瞄准4 μs左右的像素驻留在时间。 以2倍平均（线模式，平均法均值）获取图像。将针孔设置为 1 气单元（对于 405 nm 光）。要获得更高的灵敏度，请使用光子计数模式。
- 要在带差分干扰对比度 （DIC） 的传输光中进行正确的照明，请使用克勒设置冷凝器和现场停止。对于采集传输的光，在未分配任何荧光探测器的情况下，使用功率为 0.7% 的 488 nm 激光器。为激光波长设置适当的光束分割器。
- 为每个轨道获取两个图像（红色荧光和 DIC）。跟踪AuN公司的红色荧光;细胞边界很容易在传输的光与DIC图片确定。
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Representative Results
NIR PL AuNC 是在 TA 存在的情况下从 Au3+准备的，然后在 AuNC 表面上绑定了三醇端接的 PEG （MW 2，000），以按照图 1所示的工作流获得1。在1和3（氨基丙基）三磷酸（TPP）溴化物之间的阿米里质耦合提供2。正如预期的那样，吸收光谱（图2a）表明，AuNCs 1和2没有特征的表面质粒带，并且显示从550nm到850nm的广泛辐射（图2b）。在将TPP附着到1表面后，PL强劲增长。在紫外线下（365 nm，图2binset），也Figure 2b可以看到来自AuNCs的发射。AuNC 的发射稳定，发射波长独立于激发波长（图 2c）。但是，当紫外线激发时，发射强度最大。
通过在流式细胞仪上监测PL，在HeLa细胞内检测到2。HeLa细胞孵育2小时，在0.5mg/mL和2mg/mL之间的介质浓度下孵育2小时。FCM数据证实HeLa细胞被2个。NIR荧光（>720 nm）取决于时间（图3a）和浓度2（图3b）。使用 780/60 带通滤波器观察到最大强度。
使用标准共聚焦激光扫描显微镜对细胞中的AuNCs进行非侵入性成像。图 4显示了沾满2 （200 μg/mL） 的 HeLa 细胞的共聚焦图像。在24小时后孵育后，观察到细胞内2个红光发光。
图1：金纳米簇的合成。编制1和2的工作流。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：金纳米簇的光学特性。标准化 （a） 吸收光谱 （Inset： 白光下1和2的水溶液照片） 和 （b） 光致光光谱的 200 μg/mL 水溶液为 1和2 （Inset： UV 光下 AuNC 溶液的照片 （365 nm）。（c） 激励发射 PL 地图2.激发被移动10纳米步。750 nm 左右的发射峰值非常稳定（不随激发而移动），并显示出从激发到的巨大斯托克斯变化。最有效的激发发生在340nm左右。请点击此处查看此图形的较大版本。
图3：通过流细胞测定检测HeLa细胞内的金纳米簇。使用FCM研究了2个进入HeLa细胞的内化。直方图显示 （a） 时间和 （b） HeLa 细胞对 AuNCs 的集中依赖性。在时间相关实验中，HeLa细胞未经治疗（控制;0 h），或用1.28mg/mL 2进行治疗，并在37°C下孵育，指定时间。然后用PBS清洗细胞，并通过FCM进行分析。在浓度依赖性实验中，HeLa细胞未经治疗（控制;0mg/mL）或以指示浓度2进行治疗，并以同样的方式进行处理。请点击此处查看此图形的较大版本。
图4：用金纳米簇标记的HeLa细胞的CLSM成像。HeLa细胞用2（200微克/米）孵育24小时，用CLSM2成像。（a）代表红色荧光a通道（650-760nm）;（b） 传输光道 （DIC） 和 （c） 的叠加（a） 和 （b）。比例尺，50 μm。请点击这里查看此图形的较大版本。
补充图 1：稳定性测试 1。光致发光光谱在0小时和72小时后1分之1米NaCl。强度被归一化为最大值。请点击此处下载此图。
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Discussion
使用自下而上的方法合成了排放近红外的AuNCs，其中黄金前体溶液（HAuCl4）用合适的三醇配体处理，然后减少Au3+。水溶液中的金属离子的减少往往聚集并产生大纳米粒子，而不是超小的NCs21。为了制备超小（±2 nm）的PL AuN，对合成条件进行了调整，以防止形成大颗粒，促进超小簇的形成。用来盖住AuNC表面的配体的性质在影响粒子12、22、23、24、25、26、27、28、29、30的结构、电子和光学特性方面也起着重要作用。12,22,23,24,25,26,27,28,29,30因此，选择能够稳定超小簇的合适配体是获得高荧光AuNNNN的关键。含Thiol的配体是AuNCs合成中最常用的稳定剂，因为二醇和黄金之间的强共价结合。先前的31份报告表明，在稳定PL AuNCs方面，基于多二醇的配体远远优于单核配体。多二醇配体为 AuNC 提供了增强的胶体稳定性，因为配体和 AuNC 表面之间的结合位点数量较多。与单核糖体32相比，它用于合成NIR PL AuNCs，因为它在广泛的不利条件下为AuNCs提供了更高的胶体稳定性。TA还提供具有离散尺寸控制的纳米粒子的水相生长，最重要的是，它在纳米粒子表面提供一个碳水化合物酸组，可用于生物相关分子33、34,34的结合。
TA通过静电排斥来稳定表面35号上脱质子的气动组引起的静电排斥。然而，在酸性溶液中，TA保护的AuNCs由于碳酸盐组的成形而变得胶体不稳定。纳米粒子可以静电稳定，而不是完全静电。这种方法即使在盐浓度高和pH变化的情况下也能提供胶体稳定，这对生物医学应用非常重要。为了赋予TA-AuNCs电质稳定，这些聚类随后以TA：PEG的5：1摩尔比（图1）与铁醇端接PEG（MW 2，000）进行功能化。 1要成功连接铁醇端接的 PEG，必须纯化 TA-AuN。使用PEG实现AuNC的功能化提高了酸性pH的水溶性，提高了高离子强度介质的胶体稳定性。在 pH 7.0-7.5 处执行铁醇端接 PEG 的附件非常重要。pH值越高，排放最大值会导致蓝色偏移。使用分子量截止3 kDa的膜过滤装置，通过离心/过滤去除未结合的配体。与自由配体相比，与纳米粒子相关的配体在1HNMR中经历显著线宽，从而掩盖峰值分配和集成36。显著宽的1H NMR峰值与硅酸和硅醇改性聚乙烯乙二醇相关表明，配体与AuNC表面结合，并去除游离的配体18。将发光AuNCs成功集成到生物环境中需要稳定性，例如高离子强度，因为生物介质富含离子。通过监测1米NaCl在72小时期间的光致发光，验证了1的稳定性。1 M NaCl 中光发光特性没有显著变化，表明 AuNC 的稳定性很高（补充图 1）。AuNCs 在缓冲溶液中稳定了一年多，没有任何降水证据（未显示数据）。
1表面提供碳水化合物酸。基于Carbodiimide的耦合试剂被广泛用于通过形成中间体键37将碳水化合物与胺体等物质共同联系起来。水溶液中最常用的基于卡博迪米德的耦合试剂是1-ethyl-3-（二甲基氨基丙酸）碳酸酯（EDC+HCl）。EDC_HCl 已用于 TPP 溴化物的共价耦合，1 获得2。该协议的主要优点之一是通过内层键形成将分子与原胺组结合，而不影响荧光和胶体稳定性。高分辨率传输电子显微镜（HRTEM）特性表明，AuNCs 1和2的平均直径均为1.15± 0.2nm，这表明功能耦合不会改变AuNCs18的核心尺寸。或者，可以使用 EDC 和 Sulfo-NHS38激活免费的卡博基组。1和2的解决方案在紫外线灯 （365 nm） 荧光亮红色（图 1b，inset）中激发，而它们在环境照明下呈浅黄色（图 1a，inset）。, insetTPP结合增加AuNC PL到期金属到配体电荷传输（MLCT）18 。18
纳米粒子可以引起不良的生物效应，从而限制其在生物学中的应用。为了评估HeLa细胞上的2个细胞毒性，进行了XTT（钠2，3-bis（2-甲基氧-4-硝基-5-硫芬尼）-5-（苯基米诺）-碳基-2H-四氮内盐）细胞可行性测定。与对照细胞相比，用2（200微克/米L）治疗48小时的HeLa细胞没有细胞生存能力损失。这一观察表明，AuNCs具有生物相容性，这使得它们成为生物研究中应用的荧光探针。
当使用 405 nm 激光激发时，2 可提供广泛的发射，最大约为 ±750 nm。超大的斯托克斯偏移（±350 nm）使发射光能够可靠地与令人兴奋的光源分离;但是，需要适当配置 FCM 筛选器设置。对于 2，780/60 nm 带通滤波器是理想的，因为过滤器很宽，而且 AuN 的发射最大值位于同一区域。在排放最大值区域使用宽带通滤波器，以有效检测 PL 39、40、41、42，是非常重要的。39,40,41,42使用2治疗的细胞的时间和剂量相关荧光信号表明，FCM 可用于使用 AuNC 方便地监测细胞研究。当孵育时间增加到24小时时，40微克/mL浓度为2足以通过FCM中的荧光检测AuNCs（未显示的数据）。然而，对于较短的孵育时间（1-2小时），需要更高的AUNCs浓度。这种通过NIR荧光信号检测AuNCs的方法与标准流式细胞计将有助于进一步拓宽AuNCs在生物医学科学中的潜在应用。这里描述的方法可用于评估细胞获取率和机制14，纳米粒子浓度和细胞毒性之间的关系，或表面化学对纳米团获取的影响，使用FCM快速和定量的方式。
通过CLSM对HeLa细胞的细胞获取2进行成像。在用405nm激光激发时检测到24小时孵育的鲜红色发射2。然而，405 nm 激光也会激发细胞内的内在荧光球。为了区分AuNC的信号和自荧光，从AuNC的发射被收集在650nm以上。其吸引人特性，如明亮的近红外发光、高胶体稳定性、良好的生物相容性等结果表明，AuNC是生物医学和细胞成像应用的有前途的成像剂。
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Disclosures
Pramanik等人曾在本文中介绍了这些方法和结果的某些部分。作者声明没有相互竞争的财务利益。
Acknowledgments
作者感谢阿尔兹贝塔·马格多列诺娃在流细胞学方面的帮助。作者承认GACR项目Nr.18-12533S的财政支持。显微镜由欧洲区域发展基金和捷克共和国国家预算共同资助的共聚焦和荧光显微镜实验室进行，项目没有。CZ.1.05/4.1.00/16.0347 和 CZ.2.16/3.1.00/21515，并得到捷克-生物成像大型 RI 项目 LM2015062 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride | TCI Chemicals | D1601 | https://www.tcichemicals.com/eshop/en/eu/commodity/D1601/;jsessionid=3AD046E5389206AAE33C8AAB5036CDD6?gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYrO69K6Np3tYeSsAouqGndUvzzsy1hStBPuHG-X3cpTIsAqq9z0cDBoC76MQAvD_BwE |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4161 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a4161?lang=en®ion=CZ |
| Disodium hydrogen phosphate dihydrate | PENTA s.r.o. | 15130-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_281.pdf |
| DL-Thioctic acid, 98% | Alfa Aesar | L04711 | https://www.alfa.com/en/catalog/L04711/ |
| Hydrochloric acid 35% | PENTA s.r.o. | 19350-11000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_512.pdf |
| Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate, ACS, 99.99% (metals basis), Au 49.0% min | Alfa Aesar | 36400 | https://www.alfa.com/en/catalog/036400/ |
| O-(2-Mercaptoethyl)-O′-methylpolyethylene glycol 2000 | Sigma-Aldrich | 743127 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/743127?lang=en®ion=CZ |
| Potassium chloride | PENTA s.r.o. | 16200-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_346.pdf |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/452882?lang=en®ion=CZ&gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYuoZKvdK_fH24F1gGugG4pamF2FFZLd36YyZmRTdGgkbm5SbyGP0jBoCoo0QAvD_BwE |
| Sodium chloride | PENTA s.r.o. | 16610-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_376.pdf |
| Sodium dihydrogenphosphate dihydrate | PENTA s.r.o. | 12330-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_124.pdf |
| Sodium hydroxide pellets | PENTA s.r.o. | 15740-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_307.pdf |
| XTT (sodium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt) | Thermo Fisher Scientific | X12223 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/X12223#/X12223 |
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