可動性の高い、近赤外線発光光発光金ナノクラスターの調製法と、フローサイトメトリーおよび共焦点レーザー走査顕微鏡によるHeLa細胞内での直接検出の信頼性と再現性の高い方法について説明する。
過去10年間、蛍光金ナノクラスター(AuNC)は生物学的用途で人気が高まっており、その開発に多大な努力が注がれてきました。本プロトコルでは、水溶性、生体適合性、およびコロイド的に安定な近赤外線発光AuNCの調製のための、最近開発されたファシリティ法が詳細に説明されている。この室温、ボトムアップ化学合成は水溶液のチオクチン酸およびチオール修飾ポリエチレングリコールで覆われた容易に機能可能なAuNCを提供する。合成アプローチでは、有機溶剤や追加のリガンド交換も、合成化学の広範な知識も必要ありません。結果として得られたAuNCは、フリー表面カルボン酸を提供し、AuNCの光発光特性に悪影響を及ぼすことなく、遊離アミン基を有する様々な生体分子で機能化することができる。HeLa細胞によるAuNC取り込みのフロー細胞量定量および共焦点顕微鏡イメージングのための迅速で信頼性の高い手順についても説明した。ストークスシフトが大きいため、AuNCの近赤外光発光を効率的に検出するには、フローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡におけるフィルタの適切な設定が必要です。
過去10年間で、超小型(≤2 nm)光発光金ナノクラスター(PL AuNC)は、基礎研究と実用的な,,アプリケーション1、2、3、4、5、6、7、8、9、102,の両方の有望なプローブとして登場9,10しました3,4,5。6,78,1彼らの多くの望ましい特徴は高い写真安定性、調整可能な放出の極大さ、長い放出の寿命、大きいストークスのシフト、低い毒性、良い生物適合性、腎クリアランスおよびファシリティバイオコンジュゲーションを含んでいる。PLのAuNCは、青色から近赤外(NIR)スペクトル領域までの光発光を提供することができ、クラスター11内の原子の数および表面リガンド12の性質に応じて異なる。NIR(650-900 nm)を発するAUNCは、細胞および組織の長期的なインビトロおよびインビボイメージングにおいて特に有望であり、内在自家蛍光との重なりが最小、散乱と吸収の弱さ、およびNIR光13、14,14の高い組織浸透による高いシグナル対雑音比を提供する。
近年、種々のチオール含有リガンド13、15、16、17を用いたNIR-PL AuNCを調製するために15,16,17、Au-S共有結合相互作用を利用する様々なアプローチが開発されている。生物医学の応用のために、AuNCは結合相互作用を促進するために生物学的なコンポーネントによって機能化されなければならない。従って、水性溶媒中で容易に機能可能な高いコロイド安定性を有するオーNCが非常に望ましい。現在のプロトコルの全体的な目標は、水性環境下でチオクチン酸およびポリエチレングリコール(PEG)を詳細に採用し、酸アミンカップリング法に従って一次アミンを持つ分子との結合を使用して、表面に機能可能なカルボン酸基を有するAuNCの以前に報告された18の調製を記述することです。合成が容易で再現性が高いため、このプロトコルは非化学の背景を持つ研究者が使用し、適応することができます。
生物医学研究におけるAuNCの応用に必要な重要な条件の1つは、細胞内のAuNCを観察し測定する能力です。細胞によるナノ粒子の取り込み監視に利用できる方法のうち、フローサイトメトリー(FCM)および共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)は、多数の細胞19における蛍光ナノ材料の内在化を迅速に測定できる、堅牢で高スループットな方法を提供する。ここで、細胞内のPL AuNCを直接測定および分析するためのFCMおよびCLSM法は、追加の染料を必要とせず、また提示されている。
NIR発光AuNCは、金前駆体溶液(HAuCl4)を適切なチオールリガンドで処理し4、続いてAu3+の還元を行うボトムアップアプローチを用いて合成した。水溶液中の金属イオンの還元は凝集する傾向があり、超小型NC21ではなく、大きなナノ粒子をもたらす。超小型(≤2 nm)PL AuNCを調製するために、合成条件を調整して大きな粒子の形成を防止し、超小クラスターの形成を?…
The authors have nothing to disclose.
著者らは、アルツベタ・マグドルレノワのフローサイトメトリーの助けに感謝している。著者らは、GACRプロジェクトNr.18-12533Sからの財政的支援を認めている。顕微鏡検査は、欧州地域開発基金とチェコ共和国の国家予算が共同出資した共焦点・蛍光顕微鏡研究所で行われました。CZ.1.05/4.1.00/16.0347およびCZ.2.16/3.1.00/21515、およびチェコバイオイメージング大RIプロジェクトLM2015062によってサポートされています。
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