JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Bioengineering

Syntese af nær-infrarøde udsender guld nanoklynger til biologiske anvendelser

Published: March 22, 2020
doi:
10.3791/60388
, , , , , ,
1Institute of Organic Chemistry and Biochemistry of the Czech Academy of Sciences, 2Department of Chemical Physics and Optics, Faculty of Mathematics and Physics,Charles University, 3Department of Cell Biology, Faculty of Science,Charles University, 4First Faculty of Medicine,Charles University

Summary

En pålidelig og let reproducerbar metode til fremstilling af funktionaliserbare, nær-infrarøde udsender fotoluminescerende guld nanoclusters og deres direkte detektion inde HeLa celler ved flow cytometri og konfokal laser scanning mikroskopi er beskrevet.

Abstract

I løbet af det seneste årti har fluorescerende guld nanoclusters (AuNCS) været vidne til stigende popularitet i biologiske applikationer og enorme indsats har været afsat til deres udvikling. I denne protokol er en nyligt udviklet, letkøbt metode til fremstilling af vandopløselige, biokompatible og i daglige stabile nær-infrarøde udleder AuNC’er blevet beskrevet i detaljer. Denne rum-temperatur, bottom-up kemisk syntese giver let funktionsdygtige AuNC’er udjævnet med thioctisk syre og thiol-modificeret polyethylenglycol i vandig opløsning. Den syntetiske tilgang kræver hverken organiske opløsningsmidler eller yderligere ligandudveksling eller omfattende viden om syntetisk kemi for at reproducere. De resulterende AuNC’er tilbyder gratis overfladecarboxylsyrer, som kan funktionaliseres med forskellige biologiske molekyler, der bærer en gratis amingruppe uden at påvirke AuNC’ernes fotoluminescerende egenskaber negativt. En hurtig, pålidelig procedure for flow cytometrisk kvantificering og konfokal mikroskopisk billeddannelse af AuNC optagelse af HeLa celler også blevet beskrevet. På grund af den store Stokes skift, korrekt indstilling af filtre i flow cytometri og konfokal mikroskopi er nødvendig for effektiv påvisning af nær-infrarød fotoluminescens af AuNC’er.

Introduction

I det seneste årti har ultrasmå (≤ 2 nm) fotoluminescerende guldnanoklynger (PL AuNC’er) vist sig at være lovende sonder til både grundforskning og praktiske anvendelser1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Deres mange ønskelige egenskaber omfatter høj fotostabilitet, afstemmelige emissionsmaksima, lange emissionslevetider, store Stokes skift, lav toksicitet, god biokompatibilitet, nyreclearance og letkøbt biokonjugering. PL AuNC’er kan levere fotoluminescens fra det blå til det nær-infrarøde (NIR) spektrale område, afhængigt af antallet af atomer i klyngen11 og overfladens art ligand12. NIR (650-900 nm) udsender AuNC’er er særligt lovende for langsigtede in vitro og in vivo billeddannelse af celler og væv, da de tilbyder høj signal-støj-forhold på grund af minimal overlapning med iboende autofluorescens, svagere spredning og absorption, og høj væv penetration af NIR lys13,14.

I de senere år er der udviklet forskellige tilgange , der udnytter Au-S’s kovalente interaktioner til at forberede NIR-PL AuNCs udjævnet med en række thiolholdige ligander13,15,16,17. Til biomedicinske anvendelser skal AuNC’er funktionaliseres med en biologisk komponent for at lette bindende interaktioner. Således aunccs med høj kolloid stabilitet, der er let funktionsdygtige i vandigopløsningsmiddel er meget ønskeligt. Det overordnede mål med den nuværende protokol er at beskrive et tidligere rapporteret18 præparat af AuNC’er med en funktionaliserbar carboxylsyregruppe på overfladen ved at anvende thioctisk syre og polyethylenglycol (PEG) i et vandigt miljø og deres bøjning med molekyler, der bærer en primær amin efter syreaminkoblingsmetoden. På grund af den lette syntese og høje reproducerbarhed, kan denne protokol bruges og tilpasses af forskere fra ikke-kemiske baggrunde.

En af de vigtigste forudsætninger for anvendelse af AuNC’er i biomedicinsk forskning er evnen til at observere og måle AuNC’er inde i celler. Blandt de metoder til rådighed til at overvåge nanopartikel optagelse af celler, flow cytometri (FCM) og konfokal laser scanning mikroskopi (CLSM) tilbyder robuste, høj-throughput metoder, som giver mulighed for hurtige målinger af internalisering af fluorescerende nanomaterialer i stort antal celler19. Her er FCM- og CLSM-metoden til direkte måling og analyse af PL AuNC’er i celler, uden behov for yderligere farvestoffer, også blevet præsenteret.

Protocol

1. Forberedelse af nær-infrarøde udsender AuNC’er (1) Der tilsættes 7,8 mg (37,8 μmol) thioctisk syre (TA) og 60 μL på 2 M NaOH til 23,4 ml ultrarent vand (resistivitet 18,2 MΩ.cm ved 25 °C) og omrøres (mindst 1.000 omdr./min.), indtil det opløses helt (~15-20 min). For hurtigere opløsning af TA, sonikere blandingen. Til syntesen anbefales frisklavet TA-opløsning. 10,2 μL HAuCl4·3H2O (470 mg/ml) af vandig opløsning tilopløsningen. Efter 15 min tilsættes…

Representative Results

NIR PL AuNCs blev udarbejdet fra Au3+ i overværelse af TA, og derefter thiol-opsagt PEG (MW 2.000) var bundet på AuNC overfladen for at opnå 1 efter arbejdsgangen vist i figur 1. Amidisk kobling mellem 1 og 3-(aminopropyl) triphenylphosphonium (TPP) bromid forudsat 2. Som forventet viste absorptionsspektre (figur 2a), at AuNC1 1 og 2 ikke har et karakteristisk plas…

Discussion

NIR-udsender AuNC’er blev syntetiseret ved hjælp af en bottom-up-metode, hvor guldprækursoropløsningen (HAuCl4) blev behandlet med egnede thiolligands efterfulgt af en reduktion af Au3+. Reduktion af metalioner i vandig opløsning har tendens til at samle og resulterer i store nanopartikler i stedet for ultrasmå NCs21. For at forberede ultrasmå (≤2 nm) PL AuNC’er blev de syntetiske forhold justeret for at forhindre dannelse af store partikler og fremme dannelsen af ult…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne er taknemmelige for Alzbeta Magdolenova for hendes hjælp med flow cytometri. Forfatterne anerkender den finansielle støtte fra GACR-projektet Nr. 18-12533S. Mikroskopi blev udført i laboratoriet for konfokal og fluorescens mikroskopi medfinansieret af Den Europæiske Fond for Regionaludvikling og den tjekkiske statsbudget, projekter nr. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 og CZ.2.16/3.1.00/21515, og støttet af det tjekkiske BioImaging store RI-projekt LM2015062.

Materials

1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride TCI Chemicals D1601 https://www.tcichemicals.com/eshop/en/eu/commodity/D1601/;jsessionid=3AD046E5389206AAE33C8AAB5036CDD6?gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYrO69K6Np3tYeSsAouqGndUvzzsy1hStBPuHG-X3cpTIsAqq9z0cDBoC76MQAvD_BwE
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4161 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a4161?lang=en&region=CZ
Disodium hydrogen phosphate dihydrate PENTA s.r.o. 15130-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_281.pdf
DL-Thioctic acid, 98% Alfa Aesar L04711 https://www.alfa.com/en/catalog/L04711/
Hydrochloric acid 35% PENTA s.r.o. 19350-11000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_512.pdf
Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate, ACS, 99.99% (metals basis), Au 49.0% min Alfa Aesar 36400 https://www.alfa.com/en/catalog/036400/
O-(2-Mercaptoethyl)-O′-methylpolyethylene glycol 2000 Sigma-Aldrich 743127 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/743127?lang=en&region=CZ
Potassium chloride PENTA s.r.o. 16200-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_346.pdf
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/452882?lang=en&region=CZ&gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYuoZKvdK_fH24F1gGugG4pamF2FFZLd36YyZmRTdGgkbm5SbyGP0jBoCoo0QAvD_BwE
Sodium chloride PENTA s.r.o. 16610-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_376.pdf
Sodium dihydrogenphosphate dihydrate PENTA s.r.o. 12330-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_124.pdf
Sodium hydroxide pellets PENTA s.r.o. 15740-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_307.pdf
XTT (sodium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt) Thermo Fisher Scientific X12223 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/X12223#/X12223
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, Y., Chen, J., Irudayaraj, J. Nuclear Targeting Dynamics of Gold Nanoclusters for Enhanced Therapy of HER2+ Breast Cancer. ACS Nano. 5 (12), 9718-9725 (2011).
  2. Chen, L. Y., Wang, C. W., Yuan, Z., Chang, H. T. Fluorescent Gold Nanoclusters: Recent Advances in Sensing and Imaging. Analytical Chemistry. 87 (1), 216-229 (2015).
  3. Dongyun, C., Zhentao, L., Li, N., Lee, J. Y., Xie, J., Lu, J. Jianmei Amphiphilic Polymeric Nanocarriers with Luminescent Gold Nanoclusters for Concurrent Bioimaging and Controlled Drug Release. Advanced Functional Materials. 23 (35), 4324-4331 (2013).
  4. Tan, X., Jin, R. Ultrasmall metal nanoclusters for bio-related applications. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (6), 569-581 (2013).
  5. Yuan, X., Luo, Z., Yu, Y., Yao, Q., Xie, J. Luminescent Noble Metal Nanoclusters as an Emerging Optical Probe for Sensor Development. Chemistry – An Asian Journal. 8 (5), 858-871 (2013).
  6. Zheng, K., Setyawati, M. I., Leong, D. T., Xie, J. Antimicrobial Gold Nanoclusters. ACS Nano. 11 (7), 6904-6910 (2017).
  7. Li, Q., et al. Design and mechanistic study of a novel gold nanocluster-based drug delivery system. Nanoscale. 10 (21), 10166-10172 (2018).
  8. Zhang, X. D., et al. Ultrasmall Au10-12(SG)10-12 Nanomolecules for High Tumor Specificity and Cancer Radiotherapy. Advanced Materials. 26 (26), 4565-4568 (2014).
  9. Zhang, X. D., et al. Ultrasmall Glutathione-Protected Gold Nanoclusters as Next Generation Radiotherapy Sensitizers with High Tumor Uptake and High Renal Clearance. Scientific Reports. 5, 8669 (2015).
  10. Zhang, X. D., et al. Enhanced Tumor Accumulation of Sub-2 nm Gold Nanoclusters for Cancer Radiation Therapy. Advanced Healthcare Materials. 3 (1), 133-141 (2014).
  11. Zheng, J., Zhang, C., Dickson, R. M. Highly Fluorescent, Water-Soluble, Size-Tunable Gold Quantum Dots. Physical Review Letters. 93 (7), 077402 (2004).
  12. Wu, Z., Jin, R. On the Ligand’s Role in the Fluorescence of Gold Nanoclusters. Nano Letters. 10 (7), 2568-2573 (2010).
  13. Lin, C. A. J., et al. Synthesis, Characterization, and Bioconjugation of Fluorescent Gold Nanoclusters toward Biological Labeling Applications. ACS Nano. 3 (2), 395-401 (2009).
  14. Yang, L., Shang, L., Nienhaus, G. U. Mechanistic aspects of fluorescent gold nanocluster internalization by live HeLa cells. Nanoscale. 5 (4), 1537-1543 (2013).
  15. Mishra, D., et al. Aqueous Growth of Gold Clusters with Tunable Fluorescence Using Photochemically Modified Lipoic Acid-Based Ligands. Langmuir. 32 (25), 6445-6458 (2016).
  16. Wu, Z., Gayathri, C., Gil, R. R., Jin, R. Probing the Structure and Charge State of Glutathione-Capped Au25(SG)18 Clusters by NMR and Mass Spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 131 (18), 6535-6542 (2009).
  17. Stamplecoskie, K. G., Kamat, P. V. Size-Dependent Excited State Behavior of Glutathione-Capped Gold Clusters and Their Light-Harvesting Capacity. Journal of the American Chemical Society. 136 (31), 11093-11099 (2014).
  18. Pramanik, G., et al. Gold nanoclusters with bright near-infrared photoluminescence. Nanoscale. 10 (8), 3792-3798 (2018).
  19. Salvati, A., et al. Quantitative measurement of nanoparticle uptake by flow cytometry illustrated by an interlaboratory comparison of the uptake of labelled polystyrene nanoparticles. NanoImpact. 9, 42-50 (2018).
  20. Zhang, C. J., et al. Mechanism-Guided Design and Synthesis of a Mitochondria-Targeting Artemisinin Analogue with Enhanced Anticancer Activity. Angewandte Chemie. 128 (44), 13974-13978 (2016).
  21. Shang, L., Dong, S., Nienhaus, G. U. Ultra-small fluorescent metal nanoclusters: Synthesis and biological applications. Nano Today. 6 (4), 401-418 (2011).
  22. Higaki, T., et al. Controlling the Atomic Structure of Au30 Nanoclusters by a Ligand-Based Strategy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (23), 6694-6697 (2016).
  23. Li, G., et al. Tailoring the Electronic and Catalytic Properties of Au25 Nanoclusters via Ligand Engineering. ACS Nano. 10 (8), 7998-8005 (2016).
  24. Kim, A., Zeng, C., Zhou, M., Jin, R. Surface Engineering of Au36(SR)24 Nanoclusters for Photoluminescence Enhancement. Particle & Particle Systems Characterization. 34 (8), 1600388 (2017).
  25. Chevrier, D. M., et al. Molecular-Scale Ligand Effects in Small Gold–Thiolate Nanoclusters. Journal of the American Chemical Society. 140 (45), 15430-15436 (2018).
  26. Yuan, X., Goswami, N., Chen, W., Yao, Q., Xie, J. Insights into the effect of surface ligands on the optical properties of thiolated Au25 nanoclusters. Chemical Communications. 52 (30), 5234-5237 (2016).
  27. Yuan, X., Goswami, N., Mathews, I., Yu, Y., Xie, J. Enhancing stability through ligand-shell engineering: A case study with Au25(SR)18 nanoclusters. Nano Research. 8 (11), 3488-3495 (2015).
  28. Jiang, J., et al. Oxidation at the Core-Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence. The Journal of Physical Chemistry C. 118 (35), 20680-20687 (2014).
  29. Padelford, J. W., Wang, T., Wang, G. Enabling Better Electrochemical Activity Studies of H2O-Soluble Au Clusters by Phase Transfer and a Case Study of Lipoic-Acid-Stabilized Au22. ChemElectroChem. 3 (8), 1201-1205 (2016).
  30. Wang, T., Wang, D., Padelford, J. W., Jiang, J., Wang, G. Near-Infrared Electrogenerated Chemiluminescence from Aqueous Soluble Lipoic Acid Au Nanoclusters. Journal of the American Chemical Society. 138 (20), 6380-6383 (2016).
  31. Aldeek, F., Muhammed, M. A. H., Palui, G., Zhan, N., Mattoussi, H. Growth of Highly Fluorescent Polyethylene Glycol- and Zwitterion-Functionalized Gold Nanoclusters. ACS Nano. 7 (3), 2509-2521 (2013).
  32. Oh, E., Susumu, K., Goswami, R., Mattoussi, H. One-Phase Synthesis of Water-Soluble Gold Nanoparticles with Control over Size and Surface Functionalities. Langmuir. 26 (10), 7604-7613 (2010).
  33. Nair, L. V., Nazeer, S. S., Jayasree, R. S., Ajayaghosh, A. Fluorescence Imaging Assisted Photodynamic Therapy Using Photosensitizer-Linked Gold Quantum Clusters. ACS Nano. 9 (6), 5825-5832 (2015).
  34. Porret, E., et al. Hydrophobicity of Gold Nanoclusters Influences Their Interactions with Biological Barriers. Chemistry of Materials. 29 (17), 7497-7506 (2017).
  35. Shang, L., et al. One-Pot Synthesis of Near-Infrared Fluorescent Gold Clusters for Cellular Fluorescence Lifetime Imaging. Small. 7 (18), 2614-2620 (2011).
  36. Wu, M., et al. Solution NMR Analysis of Ligand Environment in Quaternary Ammonium-Terminated Self-Assembled Monolayers on Gold Nanoparticles: The Effect of Surface Curvature and Ligand Structure. Journal of the American Chemical Society. 141 (10), 4316-4327 (2019).
  37. Gao, X., Cui, Y., Levenson, R. M., Chung, L. W. K., Nie, S. In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots. Nature Biotechnology. 22 (8), 969-976 (2004).
  38. Bartczak, D., Kanaras, A. G. Preparation of Peptide-Functionalized Gold Nanoparticles Using One Pot EDC/Sulfo-NHS Coupling. Langmuir. 27 (16), 10119-10123 (2011).
  39. Dutta, D., Sailapu, S. K., Chattopadhyay, A., Ghosh, S. S. Phenylboronic Acid Templated Gold Nanoclusters for Mucin Detection Using a Smartphone-Based Device and Targeted Cancer Cell Theranostics. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (4), 3210-3218 (2018).
  40. Retnakumari, A., et al. CD33 monoclonal antibody conjugated Au cluster nano-bioprobe for targeted flow-cytometric detection of acute myeloid leukaemia. Nanotechnology. 22 (28), 285102 (2011).
  41. Pyo, K., et al. Highly Luminescent Folate-Functionalized Au22 Nanoclusters for Bioimaging. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), 1700203 (2017).
  42. Fernández, T. D., et al. Intracellular accumulation and immunological properties of fluorescent gold nanoclusters in human dendritic cells. Biomaterials. 43, 1-12 (2015).

Tags

Gold NanoclustersNear-infrared EmittingPhotoluminescentThiol-functionalized LigandAmine-functionalized LigandBiosensingBio-imagingUltrafiltrationPolyethylene GlycolEDC HCLCell Culture

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pramanik, G., Keprova, A., Valenta, J., Bocan, V., Kvaková, K., Libusova, L., Cigler, P. Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications. J. Vis. Exp. (157), e60388, doi:10.3791/60388 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image