介绍了一种可靠且易于重现的方法,用于制备可功能的近红外发光金纳米簇,并通过流细胞学和共聚焦激光扫描显微镜直接检测HeLa细胞内部。
在过去十年中,荧光金纳米簇(AuNCs)在生物应用中越来越受欢迎,并致力于其开发。在该协议中,详细介绍了一种最近开发的制备水溶性、生物相容性和胶体稳定近红外发光AuNCs的方法。这种室温自下而上的化学合成提供了易于功能的AuNCs,在水溶液中用三氯酸和三醇改性聚乙烯乙二醇盖住。合成方法既不需要有机溶剂或附加配体交换,也不需要丰富的合成化学知识来繁殖。由此产生的AuNCs提供免费表面碳碱酸,可与具有自由胺组的各种生物分子一起进行功能化,而不会对AuNCs的光致发光特性产生不利影响。还描述了HeLa细胞对AuNC摄取的流细胞程定量和共聚焦显微成像的快速、可靠的过程。由于斯托克斯发生大移位,因此,为了有效检测AuNC的近红外光致发光,必须正确设置流式细胞学和共聚焦显微镜中的滤波器。
在过去十年中,超小型(±2 nm)光致发光金纳米簇(PL AuNC)已成为基础研究和实际,,应用11、2、3、4、5、6、7、8、9、102的有前途的探针。10,8,9,5,6,7,34其许多理想的特性包括高光稳定性、可调发射最大值、长发射寿命、大斯托克斯移位、低毒性、良好的生物相容性、肾间隙和方便的生物结合。PL AuNCs 可以提供从蓝色到近红外 (NIR) 光谱区域的光致发光,具体取决于星团11内的原子数和表面配体12的性质。NIR(650-900 nm)发射AuNCs对于细胞和组织的长期体外和体内成像特别有希望,因为它们提供高信噪比,因为与内在自荧光的最小重叠、散射和吸收较弱以及NIR光13、14,14的组织渗透率高。
近年来,利用Au-S共价相互作用的各种方法已经开发出来,以制备含有各种含Thiol配体的NIR-PL AuNCs13、15、16、17。13,15,16,17对于生物医学应用,AuNCs 必须使用生物成分进行功能化,以促进结合相互作用。因此,高胶体稳定性且在水溶剂中易于功能的 AuN 是极可取的。本协议的总体目标是描述先前报告的18种AuNCs制备,其表面具有可功能的碳化物酸组,在水环境中详细采用三氯酸和聚乙烯乙二醇(PEG),并与遵循酸-a胺耦合法的具有原胺的分子结合。由于合成的方便性和高可重复性,这种协议可以由非化学背景的研究人员使用和调整。
AuNC 在生物医学研究中的应用的关键要求之一是能够观察和测量细胞内的 AuNC。在监测纳米粒子被细胞接受的方法中,流细胞学(FCM)和共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)提供了稳健、高通量的方法,能够快速测量大量细胞中荧光纳米材料的内化。这里还介绍了FCM和CLSM直接测量和分析细胞内PL AuN的方法,无需额外的染料。
使用自下而上的方法合成了排放近红外的AuNCs,其中黄金前体溶液(HAuCl4)用合适的三醇配体处理,然后减少Au3+。水溶液中的金属离子的减少往往聚集并产生大纳米粒子,而不是超小的NCs21。为了制备超小(±2 nm)的PL AuN,对合成条件进行了调整,以防止形成大颗粒,促进超小簇的形成。用来盖住AuNC表面的配体的性质在影响粒子12、22、23、24、25、26、27、28、29、…
The authors have nothing to disclose.
作者感谢阿尔兹贝塔·马格多列诺娃在流细胞学方面的帮助。作者承认GACR项目Nr.18-12533S的财政支持。显微镜由欧洲区域发展基金和捷克共和国国家预算共同资助的共聚焦和荧光显微镜实验室进行,项目没有。CZ.1.05/4.1.00/16.0347 和 CZ.2.16/3.1.00/21515,并得到捷克-生物成像大型 RI 项目 LM2015062 的支持。
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