유세포 분석 및 공초점 레이저 스캐닝 현미경검사법에 의한 기능적, 근적외선 발광 광발광 금 나노클러스터 및 HeLa 세포 내부의 직접 검출을 위한 신뢰할 수 있고 쉽게 재현 가능한 방법이 설명되어 있습니다.
지난 10년 동안 형광금 나노클러스터(AuNCs)는 생물학적 응용 분야에서 인기가 높아지고 있으며 개발에 많은 노력을 기울였습니다. 이 프로토콜에서는 수용성, 생체 적합성 및 콜로이드적으로 안정된 근적외선 방출 AuNCs의 제조를 위한 최근에 개발된, 허구 적인 방법이 상세히 기술되었다. 이 실온, 상향식 화학 합성은 수성 용액에 티옥산 및 티올 변형 폴리에틸렌 글리콜로 덮인 쉽게 기능성 AuNCs를 제공합니다. 합성 접근법은 유기 용매 나 추가 리간드 교환이나 합성 화학에 대한 광범위한 지식을 필요로하지 않습니다. 생성된 AuNCs는 무료 표면 카르복실산을 제공하며, 이는 AuNCs의 광발광 특성에 악영향을 미치지 않으면서 자유 아민 그룹을 베어링하는 다양한 생물학적 분자로 기능화될 수 있습니다. HeLa 세포에 의한 AuNC 섭취량의 유세포측정 정량화 및 공초점 현미경 이미징을 위한 빠르고 신뢰할 수 있는 절차도 기술되었다. 큰 스토크스 시프트로 인해 AuNCs의 근적외선 광발광을 효율적으로 검출하려면 유세포 분석 및 공초점 현미경 검사법에서 필터를 적절히 설정해야 합니다.
지난 10 년 동안, 초소형 (≤ 2 nm) 광 발광 금 나노 클러스터 (PL AuNCs)는 기초 연구 및 실용적인 응용 프로그램 모두 유망한 프로브로 등장했다1,,2,,3,,4,,5,,6,,7,,8,99,10.8 그들의 많은 바람직한 특성은 높은 광 안정성, 조정 가능한 방출 최대, 긴 방출 수명, 큰 스토크스 교대, 낮은 독성, 좋은 생체 적합성, 신장 클리어런스 및 허구 생체 융합을 포함한다. PL AuNCs는클러스터(11) 내의 원자수 및 표면리간드(12)의성질에 따라 청색에서 근적외선(NIR) 스펙트럼 영역으로 광발광을 제공할 수 있다. NIR (650-900 nm) 방출 AuNCs는 특히 내재 자가 형광, 약한 산란 및 흡수 및 NIR 빛의 높은 조직 침투와 최소 중첩으로 인해 높은 신호 대 잡음 비를 제공하기 때문에 세포 및 조직의 장기 생체 외 및 생체 내 이미징에 특히 유망하다13,,14.
최근에는, Au-S 공유 상호작용을 활용하는 다양한 접근법이 개발되어 NIR-PL AuNCs가 다양한 티올 함유 리간드13,,15,,16,,17로덮여 있다. 생체 의학 응용의 경우, AuNCs는 결합 상호 작용을 용이하게하기 위해 생물학적 구성 요소로 기능화되어야합니다. 따라서, 수성 용매에서 쉽게 기능화할 수 있는 높은 콜로이드 안정성을 가진 AuNCs는 매우 바람직하다. 현재 프로토콜의 전반적인 목표는 수성 환경에서 티옥산 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 구체적으로 적용하고 산-아민 커플링 방법에 따른 1차 아민을 가진 분자와의 활용을 통해 표면에 기능성 카르복실산 그룹을 가진 AuNCs의18가지 제제를 상세히 설명하는 것이다. 합성의 용이성과 높은 재현성 때문에, 이 프로토콜은 비화학 배경의 연구자들이 사용하고 적응할 수 있습니다.
생물 의학 연구에서 AuNCs의 응용을 위한 주요 필수 조건 중 하나는 세포 내부의 AuNCs를 관찰하고 측정하는 능력입니다. 세포에 의한 나노입자 섭취를 모니터링할 수 있는 방법 중, 유세포 분석법(FCM) 및 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)은 많은 수의세포에서형광 나노물질의 내재화를 빠르게 측정할 수 있는 강력하고 높은 처리량 방법을 제공한다. 여기서, 추가염료없이 세포 내부의 PL AuNCs의 직접 측정 및 분석을 위한 FCM 및 CLSM 방법도 제시되었다.
NIR 방출 AuNCs는 금 전구체 용액(HAuCl4)을적합한 티올 리간드로 처리한 후Au3+의감소를 초래하는 상향식 접근법을 사용하여 합성하였다. 수성 용액에서 금속 이온의 감소는 응집되는 경향이 있으며 초소형 NCs21보다는큰 나노 입자를 초래합니다. 초소형(≤2 nm) PL AuNCs를 준비하기 위해 합성 조건을 조정하여 큰 입자의 형성을 방지하고 초소형 클러스터의 형성을 촉진?…
The authors have nothing to disclose.
저자는 유세포측정에 대한 그녀의 도움에 대한 알츠베타 마돌레노바에 감사드립니다. 저자는 GACR 프로젝트 Nr. 18-12533S의 재정 지원을 인정합니다. 현미경 검사법은 유럽 지역 개발 기금과 체코 공화국의 국가 예산에 의해 공동 으로 자금을 조달공초점 및 형광 현미경 검사법의 실험실에서 수행되었다, 프로젝트 없음. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 및 CZ.2.16/3.1.00/21515, 체코-바이오이미징 대형 RI 프로젝트 LM2015062에 의해 지원됩니다.
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride | TCI Chemicals | D1601 | https://www.tcichemicals.com/eshop/en/eu/commodity/D1601/;jsessionid=3AD046E5389206AAE33C8AAB5036CDD6?gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYrO69K6Np3tYeSsAouqGndUvzzsy1hStBPuHG-X3cpTIsAqq9z0cDBoC76MQAvD_BwE |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4161 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a4161?lang=en®ion=CZ |
Disodium hydrogen phosphate dihydrate | PENTA s.r.o. | 15130-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_281.pdf |
DL-Thioctic acid, 98% | Alfa Aesar | L04711 | https://www.alfa.com/en/catalog/L04711/ |
Hydrochloric acid 35% | PENTA s.r.o. | 19350-11000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_512.pdf |
Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate, ACS, 99.99% (metals basis), Au 49.0% min | Alfa Aesar | 36400 | https://www.alfa.com/en/catalog/036400/ |
O-(2-Mercaptoethyl)-O′-methylpolyethylene glycol 2000 | Sigma-Aldrich | 743127 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/743127?lang=en®ion=CZ |
Potassium chloride | PENTA s.r.o. | 16200-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_346.pdf |
Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/452882?lang=en®ion=CZ&gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYuoZKvdK_fH24F1gGugG4pamF2FFZLd36YyZmRTdGgkbm5SbyGP0jBoCoo0QAvD_BwE |
Sodium chloride | PENTA s.r.o. | 16610-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_376.pdf |
Sodium dihydrogenphosphate dihydrate | PENTA s.r.o. | 12330-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_124.pdf |
Sodium hydroxide pellets | PENTA s.r.o. | 15740-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_307.pdf |
XTT (sodium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt) | Thermo Fisher Scientific | X12223 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/X12223#/X12223 |