Описан надежный и легко воспроизводимый метод подготовки функционируемых, ближнеинжегруппирующих фотолюминесцентных золотых нанокластеров и их непосредственного обнаружения внутри клеток HeLa с помощью цитометрии потока и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.
За последнее десятилетие флуоресцентные золотые нанокластеры (AuNCs) стали свидетелями растущей популярности в биологических приложениях, и огромные усилия были направлены на их развитие. В этом протоколе подробно описан недавно разработанный легковой метод приготовления водорастворимых, биосовместимых и коллоидно стабильных ближнеинжекрасных испускающих АУНК. Этот комнатной температуры, снизу вверх химический синтез обеспечивает легко функциональные AuNCs ограничен тиоктической кислоты и тиол-модифицированный полиэтиленгликоль в водной растворе. Синтетический подход не требует ни органических растворителей, ни дополнительного обмена лигандами, ни обширных знаний о синтетической химии для воспроизведения. Полученные AuNCs предлагают свободные поверхностные карбоксиловые кислоты, которые могут быть функционализированы с различными биологическими молекулами, несущими свободную группу амина без негативного влияния на фотолюминесцентные свойства AuNCs. Была также описана быстрая, надежная процедура цитометрической количественной оценки потока и конфокальной микроскопической визуализации поглощения AuNC клетками HeLa. В связи с большим сдвигом Стокса, надлежащая установка фильтров в цитометрии потока и конфокальной микроскопии необходима для эффективного обнаружения ближнего инфракрасного фотолюминесценции AuNCs.
В последнее десятилетие, ультрамалые (2 нм) фотолюминесцентных золотых нанокластеров (PL AuNCs) стали перспективными зондами для фундаментальных исследований и практических применений1,22,33,4,5,6,7,8,9,10. Их многочисленные желательные характеристики включают высокую фотостабильность, tunable максима выбросов, длительные сроки выбросов, большие сдвиги Стокса, низкая токсичность, хорошая биосовместимость, почечная очистка и поверхностное биоконъюгация. PL AuNCs может обеспечить фотолюминесценцию от синего до ближнего инфракрасного (NIR) спектральной области, в зависимости от количества атомов в кластере11 и характера поверхностного лиганда12. NIR (650-900 нм) испуская AuNCs особенно перспективны для долгосрочного in vitro и in vivo изображений клеток и тканей, так как они предлагают высокое соотношение сигнала к шуму из-за минимального перекрытия с внутренней аутофлуоресценции, слабое рассеяние и поглощение, и высокое проникновение тканей NIR света13,14.
В последние годы, различные подходы, которые используют преимущества Au-S ковалентных взаимодействий были разработаны для подготовки NIR-PL AuNCs ограничен с различными тиол-содержащих лигандов13,15,16,17. Для биомедицинских применений AuNCs должны быть функционализированы с биологическим компонентом для облегчения связывающих взаимодействий. Таким образом, AuNCs с высокой коллоидной стабильностью, которые легко функционально функционируют в вавном растворителе, очень желательны. Общая цель текущего протокола заключается в описании ранее сообщалось18 подготовки AuNCs с functionalizable группы карбоксиловой кислоты на поверхности, используя тиоциловую кислоту и полиэтиленгликоль (PEG) в водной среде в подробно и их спряжения с молекулами, несущими первичный амин после кислотно-аминального метода. Из-за простоты синтеза и высокой воспроизводимости, этот протокол может быть использован и адаптирован исследователями из нехимических фонов.
Одним из ключевых необходимых для применения AuNCs в биомедицинских исследованиях является способность наблюдать и измерять AuNCs внутри клеток. Среди методов, доступных для мониторинга поглощения наночастиц клетками, цитометрии потока (FCM) и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) предлагают надежные, высокопроизводительные методы, которые позволяют быстро измерять интернализацию флуоресцентных наноматериалов в большом количестве клеток19. Здесь также были представлены методFC и CLSM для прямого измерения и анализа PL AuNCs внутри клеток без необходимости в дополнительных красителей.
NIR-излучающих AuNCs были синтезированы с использованием подхода снизу вверх, в котором раствор прекурсора золота (HAuCl4) был обработан с подходящими лигандой тиола, а затем уменьшение au3 “ Сокращение ионов металла в ваквомом растворе, как правило, агрегируется и приводит к крупны?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарны Алзбете Магдоленовой за помощь в цитометрии потока. Авторы признают финансовую поддержку проекта GACR Nr. 18-12533S. Микроскопия была проведена в лаборатории конфокальной и флуоресценции микроскопии совместно финансируемых Европейским фондом регионального развития и государственного бюджета Чешской Республики, проекты нет. К.1.05/4.1.00/16.0347 и КЗ.2.16/3.1.00/21515, при поддержке чешско-BioImaging большой проект RI LM2015062.
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride | TCI Chemicals | D1601 | https://www.tcichemicals.com/eshop/en/eu/commodity/D1601/;jsessionid=3AD046E5389206AAE33C8AAB5036CDD6?gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYrO69K6Np3tYeSsAouqGndUvzzsy1hStBPuHG-X3cpTIsAqq9z0cDBoC76MQAvD_BwE |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4161 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a4161?lang=en®ion=CZ |
Disodium hydrogen phosphate dihydrate | PENTA s.r.o. | 15130-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_281.pdf |
DL-Thioctic acid, 98% | Alfa Aesar | L04711 | https://www.alfa.com/en/catalog/L04711/ |
Hydrochloric acid 35% | PENTA s.r.o. | 19350-11000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_512.pdf |
Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate, ACS, 99.99% (metals basis), Au 49.0% min | Alfa Aesar | 36400 | https://www.alfa.com/en/catalog/036400/ |
O-(2-Mercaptoethyl)-O′-methylpolyethylene glycol 2000 | Sigma-Aldrich | 743127 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/743127?lang=en®ion=CZ |
Potassium chloride | PENTA s.r.o. | 16200-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_346.pdf |
Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/452882?lang=en®ion=CZ&gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYuoZKvdK_fH24F1gGugG4pamF2FFZLd36YyZmRTdGgkbm5SbyGP0jBoCoo0QAvD_BwE |
Sodium chloride | PENTA s.r.o. | 16610-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_376.pdf |
Sodium dihydrogenphosphate dihydrate | PENTA s.r.o. | 12330-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_124.pdf |
Sodium hydroxide pellets | PENTA s.r.o. | 15740-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_307.pdf |
XTT (sodium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt) | Thermo Fisher Scientific | X12223 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/X12223#/X12223 |