En tillförlitlig och lätt reproducerbar metod för beredning av functionalizable, nära infraröd avgivande fotoluminescerande guld nanokluster och deras direkta detektion inuti HeLa celler genom flöde cytometri och confocal laser scanning mikroskopi beskrivs.
Under det senaste årtiondet har fluorescerande guld nanokluster (AuNCs) bevittnat växande popularitet i biologiska tillämpningar och enorma ansträngningar har ägnats åt deras utveckling. I detta protokoll har en nyligen utvecklad, facile metod för beredning av vattenlösliga, biokompatibla och kolloidalt stabil nära infraröd avgivande AuNCs beskrivits i detalj. Denna rumstemperatur, nedifrån och upp kemisk syntes ger lätt funktionelliserbara AuNCs täckt med tiooktsyra och tioolmodifierad polyetylenglykol i vattenlösning. Den syntetiska metoden kräver varken organiska lösningsmedel eller ytterligare ligand utbyte eller omfattande kunskap om syntetisk kemi att reproducera. De resulterande AuNCs erbjuder gratis yta karboxylsyra, som kan funktionaliseras med olika biologiska molekyler som bär en fri amin grupp utan att negativt påverka de fotoluminescerande egenskaperna hos AuNCs. Ett snabbt, tillförlitligt förfarande för flöde cytometrisk kvantifiering och confocal mikroskopisk avbildning av AuNC upptag av HeLa celler också beskrivits. På grund av den stora Stokes skift, korrekt inställning av filter i flöde cytometri och konfokalmikroskopi är nödvändigt för effektiv detektion av nära infraröd fotoluminescens av AuNCs.
Under det senaste årtiondet har ultrasmå (≤ 2 nm) fotoluminescerande nanokluster i guld (PL AuNCs) framträtt som lovande sonder för både grundforskning och praktiska tillämpningar1,,2,,3,4,,5,,6,,,7,,8,,9,10. Deras många önskvärda egenskaper inkluderar hög fotostabilitet, avstämbara utsläpp maxima, långa utsläpp livstider, stora Stokes skift, låg toxicitet, god biokompatibilitet, renal clearance och facile bioconjugation. PL AunCs kan ge fotoluminescens från det blå till nära infraröda (NIR) spektralområdet, beroende på antalet atomer i klustret11 och arten av ytan ligand12. NIR (650-900 nm) avger AuNCs är särskilt lovande för långsiktiga in vitro och in vivo imaging av celler och vävnader, eftersom de erbjuder hög signal-brus förhållande på grund av minsta överlappning med inneboende autofluorescens, svagare spridning och absorption, och hög vävnad penetration av NIR ljus13,14.
Under de senaste åren har olika metoder som utnyttjar Au-S kovalenta interaktioner utvecklats för att förbereda NIR-PL AuNCs begränsas med en mängd tiool-innehållande ligander13,,15,16,17. För biomedicinska tillämpningar måste Auncs funktionaliseras med en biologisk komponent för att underlätta bindande interaktioner. Således auncs med hög kolloidal stabilitet som är lätt functionalizable i vattenlösningsmedel är mycket önskvärt. Det övergripande målet med det nuvarande protokollet är att beskriva en tidigare rapporterade18 beredning av AuNCs med en functionalisable karboxylsyra grupp på ytan genom att använda tiooktic syra och polyetylenglykol (PEG) i en vattenmiljö i detalj och deras konjugering med molekyler som bär en primär amin efter syra-amin kopplingsmetod. På grund av enkel syntes och hög reproducerbarhet, kan detta protokoll användas och anpassas av forskare från icke-kemi bakgrunder.
En av de viktigaste förfrågeför tillämpningar av AuNCs i biomedicinsk forskning är förmågan att observera och mäta AuNCs inuti celler. Bland de metoder som finns tillgängliga för att övervaka nanopartikelupptag av celler, flödescytometri (FCM) och konfokal laserscanning mikroskopi (CLSM) erbjuder robusta, hög genomströmning metoder som möjliggör snabba mätningar av internalisering av fluorescerande nanomaterial i stort antal celler19. Här har fcm och CLSM-metod för direkt mätning och analys av PL AuNCs inuti celler, utan behov av ytterligare färgämnen, också presenterats.
NIR-avgivande AuNCs syntetiserades med hjälp av en bottom-up-strategi där guldprekursorlösningen (HAuCl4)behandlades med lämpliga tiolligander, följt av en minskning av Au3+. Minskning av metalljoner i vattenlösning tenderar att aggregera och resulterar i stora nanopartiklar snarare än ultrasmå NCs21. För att förbereda ultrasmå (≤2 nm) PL AuNCs justerades de syntetiska förhållandena för att förhindra bildandet av stora partiklar och främja bildandet av ultra…
The authors have nothing to disclose.
Författarna är tacksamma mot Alzbeta Magdolenova för hennes hjälp med flödescytometri. Författarna erkänner det ekonomiska stödet från GACR-projektet Nr. 18-12533S. Mikroskopi utfördes i laboratoriet för konfuktal- och fluorescensmikroskopi som medfinansierades av Europeiska regionala utvecklingsfonden och Tjeckiens statsbudget, projekt nr. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 och CZ.2.16/3.1.00/21515, och stöds av det tjeckisk-BioImaging stora RI-projektet LM2015062.
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride | TCI Chemicals | D1601 | https://www.tcichemicals.com/eshop/en/eu/commodity/D1601/;jsessionid=3AD046E5389206AAE33C8AAB5036CDD6?gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYrO69K6Np3tYeSsAouqGndUvzzsy1hStBPuHG-X3cpTIsAqq9z0cDBoC76MQAvD_BwE |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4161 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a4161?lang=en®ion=CZ |
Disodium hydrogen phosphate dihydrate | PENTA s.r.o. | 15130-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_281.pdf |
DL-Thioctic acid, 98% | Alfa Aesar | L04711 | https://www.alfa.com/en/catalog/L04711/ |
Hydrochloric acid 35% | PENTA s.r.o. | 19350-11000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_512.pdf |
Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate, ACS, 99.99% (metals basis), Au 49.0% min | Alfa Aesar | 36400 | https://www.alfa.com/en/catalog/036400/ |
O-(2-Mercaptoethyl)-O′-methylpolyethylene glycol 2000 | Sigma-Aldrich | 743127 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/743127?lang=en®ion=CZ |
Potassium chloride | PENTA s.r.o. | 16200-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_346.pdf |
Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/452882?lang=en®ion=CZ&gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYuoZKvdK_fH24F1gGugG4pamF2FFZLd36YyZmRTdGgkbm5SbyGP0jBoCoo0QAvD_BwE |
Sodium chloride | PENTA s.r.o. | 16610-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_376.pdf |
Sodium dihydrogenphosphate dihydrate | PENTA s.r.o. | 12330-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_124.pdf |
Sodium hydroxide pellets | PENTA s.r.o. | 15740-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_307.pdf |
XTT (sodium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt) | Thermo Fisher Scientific | X12223 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/X12223#/X12223 |