萌芽酵母 SNX-BAR 异体体的表达、纯化和脂质结合
Summary
在这里，我们介绍了酵母中SNX-BAR异体物的表达、纯化和脂质结合的工作流程。
Abstract
SNX-BAR 蛋白是一种进化保存的膜重塑蛋白，在内分泌期间蛋白质和脂质的分拣和贩运、内皮系统内的分泌和自噬中起着关键作用。SNX-BAR 蛋白质功能的核心是能够形成同质体或异构体，使用高度保守的磷同源学 （PX） 和 BAR（宾/假体素/Rvs）域结合膜。此外，在膜上对SNX-BAR二聚体进行寡聚可以引起膜小管和囊泡的形成，这种活性被认为反映了其作为内生物源运输载体的涂层蛋白的功能。长期以来，研究人员利用重组SNX-BAR蛋白在合成脂质体或巨型单片菌囊泡（GUVs）上进行体外结合研究，揭示驱动膜重塑所需的脂质的精确组成，从而揭示其作用机制。然而，由于双表达系统的技术挑战、细菌中SNX-BAR蛋白表达的毒性以及单个SNX-BAR蛋白的溶解性差，迄今为止的大多数研究都检查了SNX-BAR同质体，包括细菌表达过程中形成的非生理二分体。最近，我们优化了一种方案，克服了典型细菌表达系统的主要缺陷。使用此工作流，我们演示如何成功表达和纯化大量 SNX-BAR 异体，以及如何在合成脂体上重新构成它们，以便进行结合和管状测定。
Introduction
膜结合的细胞器，如血浆膜、内质视网膜、Golgi装置、溶血菌（酵母乳酸）和内膜体构成真核细胞的内膜系统。大多数细胞器能够通过囊泡运输载体与其他细胞器进行通信和交换材料。细胞如何协调内膜系统内囊泡运输载体的包装和形成，目前还没有得到很好的理解。然而，构成大部分内膜系统的蛋白质和脂质已知源自血浆膜（PM）内切内切内切囊泡。内体是这些囊泡的主要接受器，由多组相互关联的管状细胞器组成。内源体的主要功能是促进营养获取，调节蛋白质和脂质流动，防止病原体感染，并作为血浆膜脂质的主要补充来源。当内欧体从血浆膜中接收大量货物蛋白质和脂质时，通过将货物分离到管状内皮运输载体（ETCs）中，充当分拣室。任何未被隔离到ETCs的蛋白质都会通过内裂体系统降解。货物分类到ETC的调节不良可能导致营养摄入、蛋白质周转或脂质平衡的丧失，导致大量代谢、发育和神经系统疾病1、2。然而，尽管ETC在内源体中起着核心作用，但内源体如何有选择地协调大量异质货物包装成管状载波的基本机制尚不清楚。
分拣nexin（SNX）系列是一种进化保存的蛋白质类别，已发现对细胞3、4、5中的许多囊泡运输反应至关重要。分拣内膜，通过其特有的磷异体（PX）域帮助货物捕获，该域结合磷脂酰胆醇-3-单磷酸（PtdIns（3）P，一种富含内膜的脂质。哺乳动物编码33个SNX蛋白质，根据其他域1的存在，这些蛋白质可以进一步分为多个子家族。最值得注意的是，SNX-BAR亚家族是最大的亚家族，由12个人类组成，而在萌芽的酵母中，糖母糖，亚家族减少到只有7个SNX-BARs。SNX-BAR 蛋白同时具有 PX 域和 Bin-Amphisin-Rvs （BAR） 域，可触发脂质储液罐结合正曲率膜。因此，SNX-BAR系列对内膜体具有天然的亲和力，可以通过膜重塑能力来介导ETC的形成。在体外，通过在合成脂质体中加入纯化的SNX-BARs，可以诱导SNX-BARs的重塑特性，随后形成狭窄的涂层小管可以通过电子显微镜进行可视化。利用这些方法，研究人员已经确定，在SNX-BAR家族中，寡头集中和收缩强度似乎各不相同，这表明它们可以帮助ETC的形成和分裂。
SNX-BARs 可以按其独有的二聚特性进一步分类。体外结合测定和结构研究表明，SNX-BAR蛋白只能形成特定的同构体或异构体。因此，原则上，每个潜在的 SNX-BAR 二聚体可为特定货物的贩运途径提供小管涂层，同样，其他 SNX-BAR 原物体的受限寡头化也可以定义不同的出口途径。但是，由于 SNX 系列中 SNX-BARs 数量众多且多样性，因此不太可能出现一个排序的 nexin-one 货运假说。相反，使用 SNX-BARs、货物、脂质特异性和其他依赖关系等多种因素进行协调工作的可能性更大。同样，最近对酵母SNX4家族的研究表明，除了PtdIns（3）P，还有增效内质性运输载体6的脂质特异性。在这项研究中，SNX-BAR homodimer Mvp1-Mvp1从细菌和原生异体物Snx4-Atg20和Vps5-Vpss17中表达和纯化，从酵母高产中表达和纯化，而只有Snx4-Atg20被发现优先结合磷脂酰丝氨酸（PS），并在脂质体结合研究中形成狭窄的管状结构。虽然该领域的其他人已经揭示了SNX-BARs使用重组纯化的SNX-BAR同质体从细菌的重要属性，与表达SNX-BAR异构体在类似系统中的毒性阻碍了其原生特性7，8，9，10。因此，如果没有一个可靠的系统来获得纯重组表达的本地异质体，研究人员必须放弃这些调查路线。在图 1中，我们提出了一个四部分工作流，以 1） 构建一个酵母菌株过度表达 SNX-BAR 异构体用于串联亲和纯化， 2） 表达和纯化原生 SNX-BAR 异构体， 3） 制备单层合成脂质体， 4） 建立脂质管或沉淀测定，为研究人员研究在自然界中发现的分拣内辛的不断增长的目录提供了重要工具。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，我们演示了优化的工作流程，以纯化酵母中的SNX-BAR二聚体和两种检测，以评估其在合成脂质体上的生物物理特性。与大肠杆菌或其他系统中典型的重组蛋白表达相反，其主要优势是能够在原生宿主中均匀地表达 SNX-BAR 蛋白质，从而避免在其它系统中净化 SNX-BARs 时发现的毒性和溶解性问题。值得注意的是，我们的系统不需要分子克隆或窝藏多个表达载体17。我们的…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本出版物中报告的研究得到了国家卫生研究院国家普通医学研究所的支持，奖励号为GM060221，部分得到国家研究所国家普通医学研究所的支持。在奖励编号T32GM007223下的健康。R.C.部分得到了UNC-夏洛特学院研究资助计划的支持。
Materials
| 0.2 micrometer PC Membranes | Avanti | 610006 | |
| 10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad) | Bio-Rad | 731-1550 | |
| 27 Gauge needle | BD Biosciences | 301629 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff | Amicon | UFC501024 | |
| Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer | Avestin | EF-C3 | |
| BCA assay | Pierce | 23225 | |
| Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
| DOPC | Avanti | 850375 | |
| DOPS | Avanti | 840035 | |
| ergosterol (Sigma) | Sigma | 47130-U | |
| Extruder Set with Block 0.2 microlter/1mL | Avanti | 610000 | |
| FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV) | |||
| Glass culture tubes | VWR | 47729-570 | |
| IgG sepharose beads (GE Healthcare) | GE Healthcare | 17-0969-01 | |
| Microlter glass syringes | Hamilton | 7637-01 | |
| New Brunswick Excella E25 | Eppendorf | M1353-0000 | or equivalent shaking 30 C |
| Ni-NTA Magnetic Agarose Beads | Pierce | 78605 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-076 | |
| PI3P | Echelon | P-3016 | or Echelon equivalent |
| Polycarbonate bottle assembly | Beckman Coulter | 355622 | |
| TLA-100 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
| Type 45 Ti Rotor | Beckman Coulter | ||
| Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve | VWR | 75871-436 | |
| Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1) | A&J Vacuum | PN07050 | |
| Vortex with foam holder | VWR | 10153-838 | |
| VWR KIT MICROTUBE | VWR | 12620-880 | |
References
- Teasdale, R. D., Collins, B. M. Insights into the PX (phox-homology) domain and SNX (sorting nexin) protein families: structures, functions and roles in disease. The Biochemical Journal. 441 (1), 39-59 (2012).
- Zhang, H., et al. The Retromer Complex and Sorting Nexins in Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 79 (2018).
- Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harbor perspectives in Biology. 6 (2), (2014).
- Chi, R. J., Harrison, M. S., Burd, C. G. Biogenesis of endosome-derived transport carriers. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (18), 3441-3455 (2015).
- Wang, J., et al. Endosomal receptor trafficking: Retromer and beyond. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (8), 578-590 (2018).
- Ma, M., et al. Lipid trafficking by yeast Snx4 family SNX-BAR proteins promotes autophagy and vacuole membrane fusion. Molecular Biology of the Cell. , (2018).
- van Weering, J. R., et al. Molecular basis for SNX-BAR-mediated assembly of distinct endosomal sorting tubules. The EMBO Journal. 31 (23), 4466-4480 (2012).
- Chi, R. J., et al. Fission of SNX-BAR-coated endosomal retrograde transport carriers is promoted by the dynamin-related protein Vps1. The Journal of Cell Biology. 204 (5), 793-806 (2014).
- Purushothaman, L. K., Arlt, H., Kuhlee, A., Raunser, S., Ungermann, C. Retromer-driven membrane tubulation separates endosomal recycling from Rab7/Ypt7-dependent fusion. Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 783-791 (2017).
- Purushothaman, L. K., Ungermann, C. Cargo induces retromer-mediated membrane remodeling on membranes. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2709-2719 (2018).
- Wurmser, A. E., Emr, S. D. Phosphoinositide signaling and turnover: PtdIns(3)P, a regulator of membrane traffic, is transported to the vacuole and degraded by a process that requires lumenal vacuolar hydrolase activities. The EMBO journal. 17 (17), 4930-4942 (1998).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
- Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
- Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods in Molecular Biology. 498, 297-307 (2009).
- Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. Journal of Lipid Research. 52 (1), 175-184 (2011).
- Yong, X., et al. Expression and purification of the SNX1/SNX6 complex. Protein Expression and Purification. 151, 93-98 (2018).
