Summary
Burada, mayada SNX-BAR heterodimerlerinin ifade, saflaştırma ve lipozom bağlanması için bir iş akışı salıyoruz.
Abstract
SNX-BAR proteinleri, endositon sırasında protein ve lipidlerin ayıklanmasında, endozomal sistem içinde ayrıştırma ve otofajide önemli rol oynayan, evrimsel olarak korunmuş membran remodeling proteinleri sınıfıdır. SNX-BAR protein fonksiyonunun merkezinde, yüksek oranda korunmuş foks-homoloji (PX) ve BAR (Bin/Amphiphysin/Rvs) etki alanlarını kullanarak membranları bağlayan homodimer veya heterodimer ler oluşturabilme yeteneği dir. Buna ek olarak, membranlar üzerinde SNX-BAR dimerlerin oliomerizasyonu membran tübülve veziküloluşumunu ortaya çıkarır ve bu aktivitenin endozom kaynaklı taşıyıcılar için kat proteinleri olarak işlevlerini yansıttığı düşünülmektedir. Araştırmacılar uzun sentetik lipozomlar veya dev unilamellar veziküller üzerinde rekombinant SNX-BAR proteinleri kullanarak in vitro bağlama çalışmaları yararlanarak (GUVs) membran remodeling sürücü için gerekli lipidlerin hassas makyaj ortaya çıkarmak için, böylece eylem mekanizması ortaya. Ancak, çift ifade sistemleri ile teknik zorluklar nedeniyle, bakterilerde SNX-BAR protein ekspresyonu toksisitesi, ve bireysel SNX-BAR proteinlerin kötü çözünürlük, bugüne kadar çoğu çalışma snx-BAR homodimers inceledik, bakterilerde ifade sırasında form fizyolojik olmayan dimers dahil. Son zamanlarda, tipik bir bakteriyel ekspresyon sisteminin büyük eksikliklerini aşmak için bir protokol optimize ettik. Bu iş akışını kullanarak, büyük miktarda SNX-BAR heterodimerinin nasıl başarılı bir şekilde ifade edilip arındırılacağı ve bağlama ve tükentme tahlilleri için sentetik lipozomlarda nasıl yeniden oluşturulabileceğimizi gösteriyoruz.
Introduction
Plazma zarı, endoplazmik retikulum, Golgi aparatı, lizom (maya vakuol) ve endoskopi gibi membrana bağlı organeller ökaryotik hücrenin endomembran sistemini oluşturur. Çoğu organel vezikül taşıyıcıları aracılığıyla diğer organeller ile iletişim ve malzeme alışverişi yeteneğine sahiptir. Hücrenin endoskopi sistemi içinde vezikül taşıyıcılarının ambalajını ve oluşumunu nasıl koordine ettiginin tam olarak anlaşılamamıştır. Ancak, endoskopi sisteminin büyük bir kısmını oluşturan protein ve lipidlerin plazma zarından (PM) endositik veziküllerin içselleştirilmesinden kaynaklandığı bilinmektedir. Endozos bu veziküller için birincil kabul organıdır ve birden fazla birbiriyle bağlantılı tübüler organel kümesinden oluşur. Endozobonun temel işlevi besin alımını kolaylaştırmak, protein ve lipid cirosunu düzenlemek, patojen enfeksiyonundan korunmak ve plazma zarı için birincil yağ ikmal kaynağı olarak hizmet vermektir. Endozos, plazma zarından kargo proteinlerinin ve lipidlerin büyük bir kısmını aldığından, kargoları borulu endozomal taşıma taşıyıcılarına (ETC) izole ederek bir ayırma bölmesi görevi görür. ETC'lere ayrılmayan proteinler endo-lysozomal sistem ile bozulmaya bırakılır. ETCs içine kargo sıralama disregülasyonu besin alımı, protein ciro veya lipid homeostaz kaybına yol açabilir, çok sayıda metabolik sonuçlanan, gelişimsel, ve nörolojik bozukluklar1,2. Ancak, endozomda ETC'lerin merkezi rolüne rağmen, endozosun borutaşıyıcılarına çok sayıda heterojen kargonun ambalajını seçici olarak nasıl koordine edebileceği ne kadar temel mekanizma bilinmemektedir.
Sıralama nexin (SNX) ailesi hücre de birçok vezikül taşıma reaksiyonları için kritik olduğu tespit edilmiştir proteinlerin evrimsel olarak korunmuşsınıftır 3,4,5. Sıralama neksinler endozom membran ve endozom membran üzerinde zenginleştirilmiş bir lipid fosfatidillinositol-3-monofosfat (PtdIns(3)P) bağlar karakteristik phox homoloji (PX) etki alanı ile kargo yakalama yardım işe alınır. Memeliler otuz üç SNX proteini kodlarlar, diğer etki alanlarının varlığına göre daha fazla alt familyaya ayrılabilir1. En önemlisi, SNX-BAR alt familyası insan on iki oluşan en büyük alt familye, tomurcuklanan maya ise, Saccharomyces cerevisiae, alt familya sadece yedi SNX-BAR azalır. SNX-BAR proteinleri hem PX etki alanına hem de pozitif eğrilik zarlarını bağlamak için lipid rezervuarlarını tetikleyen Bin-Amphiphysin-Rvs (BAR) etki alanına sahiptir. Sonuç olarak, SNX-BAR ailesi endoskopiye doğal bir yakınlık sağlar ve membran remodeling yetenekleri aracılığıyla ETC oluşumuna aracılık edebilir. In vitro, SNX-BAR'ların yeniden şekillendirme özellikleri sentetik lipozomlara saflaştırılmış SNX-BAR eklenmesi yle indüklenebilir ve daha sonra dar, kaplanmış tübüllerin oluşumu elektron mikroskobu ile görselleştirilebilir. Bu yöntemleri kullanarak, araştırmacılar hem oligomerizasyon konsantrasyonu ve daralma gücü SNX-BAR ailesi arasında etcs oluşumu ve makası hem de yardımcı olabileceğini düşündüren arasında farklılık gösterdiğini belirledik.
SNX-BAR'lar özel dimerizasyon özelliklerine göre sınıflandırılabilir. İn vitro bağlayıcı tahliller ve yapısal çalışmalar SNX-BAR proteinlerinin sadece spesifik homodimer veya heterodimer ler oluşturabilenleri göstermiştir. Bu nedenle, prensip te, her potansiyel SNX-BAR dimer-oligomer bir kargo özgü kaçakçılık yolu için bir tübül kat sağlayabilir ve aynı şekilde, diğer SNX-BAR protomerlerin sınırlı oligomerizasyon, aynı zamanda farklı ihracat yolları tanımlayabilirsiniz. Ancak, SNX ailesi içinde SNX-R'lerin ve çeşitliliğin çok sayıda olması nedeniyle, bir sıralama nexin-one kargo hipotezi son derece düşüktür. Bunun yerine SNX-R'ler, kargo, lipid özgüllüğü ve diğer bağımlılıklar gibi çok sayıda faktör kullanılarak koordineli bir çaba daha olasıdır. Aynı şekilde, maya SNX4 ailesinin son çalışmalar ek lipid özgüllüğü için kanıt ortaya, PtdIns ötesinde(3)P, endozom taşıma taşıyıcıları güçlendirmek için6. Bu çalışmada, SNX-BAR homodimer Mvp1-Mvp1 bakteri ve yerli heterodimers Snx4-Atg20 ve Vps5-Vps17 ifade edildi ve maya yüksek verim saflaştırılmış, sadece Snx4-Atg20 tercihen fosfatidilserine bağlamak bulundu (PS) ve lipozom ciltleme çalışmalarında dar tüp benzeri yapılar formu6. Alanında diğerleri bakterilerden rekombinantlı Saflaştırılmış SNX-BAR homodimers kullanarak SNX-BAR önemli özelliklerini ortaya çıkarmış olsa da, benzer sistemlerde SNX-BAR heterodimers ifade ile ilişkili toksisite kendi yerli karakterizasyonuengelvar7 ,8,9,10. Bu nedenle, saf rekombinantly ifade yerli heterodimers elde etmek için güvenilir bir sistem olmadan, araştırmacılar araştırma bu satırları telafi etmelidir. Şekil1'de, dört parçalı bir iş akışı satıyoruz 1) tandem afinite arınması için SNX-BAR heterodimerlerini aşırı ifade eden bir maya zorlanması oluşturmak, 2) ekspres ve yerli SNX-BAR heterodimers arındırmak, 3) unilamellar sentetik lipozomlar hazırlamak, ve 4) doğada bulunan sıralama nexins büyüyen katalog araştırmak için araştırmacılar için hayati bir araç sağlayan, bir lipozom tubulation veya sedimantasyon lar teşbik kurmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Maya Zorlanma İnşaat
- TVY614 ile başlayın (pep4Δ::LEU2 prb1Δ::hisG prc1Δ::HIS3)11 ebeveyn zorlanma olarak. Bu suş, hücre lisisi sonrası protein yıkımının çoğunluğuna katkıda bulunan ve bu nedenle daha temiz ve daha verimli bir arınma sağlayan vakuolar proteazlar için eksiktir.
- Homolog rekombinasyon kullanarak Atg20 'nin (SNX-BAR ORF 1) C terminusuna tandem afinite saflaştırma (TAP) etiketini tasarlave entegre edin. Entegrasyonları onaylamak için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanın(Şekil 2).
- Uygun tümleştirmeyi onaylamak için TAP etiketine karşı batıda bir hücre llot'u gerçekleştirin13.
NOT: SDS-PAGE ve batı leke doğrulaması için 3 OD (1 OD - 1 x 107 hücre) hücre toplamanızı öneririz. TAP etiketinin entegrasyonunun, endojen organizatörleri GAL1 organizatörüyle değiştirmeden önce gerçekleşmesi gerektiğini ve batı lekesi üzerinden daha kolay TAP etiketi doğrulaması sağlaması gerektiğini unutmayın. - Her bir ORF14'ünsıralı homolog rekombinasyon ve dönüşüm adımlarını kullanarak etiketsiz GAL1 organizatörü ile endojen Snx4 (SNX-BAR ORF1) ve Atg20 (SNX-BAR ORF 2) organizatörleri değiştirin.
- ENTEGRE sitelerin in dışındaki yan astarları PCR'ye kullanarak başarılı entegrasyonları onaylayın(Şekil 2). Bu büyüme ortamda galaktoz yokluğunda hedeflenen SNX-BA'ların null fenotip neden olur.
2. Maya İndüksiyonve SNX-BAR Dimer Arıtma
NOT: Maya hücreleri standart YPD (maya ekstresi, pepton ve% 2 glikoz) agar plakaları üzerinde değişiklikler kromozomal entegre olarak yayılabilir.
- Büyük bir hücre örneğini 50 mL standart YP (maya özü ve pepton) ortamına % 2 rafinose ve %0,1 glikoz ile bir şişedeki karbon kaynağı olarak en az 4 kat kültür hacmine dönüştürün ve uygun havalandırmayı sağlamak için 30 °C'lik çalkalayıcıda bir gecede büyüyün. Bu ortamda büyüme standart YPD göre daha yavaş olacağını bekleyin.
- Ertesi sabah, %2 raffinose ve %0,1 glikoz ile standart YP ortamının 1 L'sine inoküle etmek için 50 mL prekültür kullanın ve 30 °C shaker'da 4-5 saat büyüyün.
NOT: 1 L kültürünü aşılamak için kullanılan prekültür hacmi, prekültürün OD600'üne bağlı olarak ayarlanabilir. Aşılama sonrası 1 L kültürünün OD600 4-5 h büyüme sırasında en az iki katlama sağlamak için 0.2 civarında olmalıdır.- Uygun havalandırma sağlamak için büyüme için şaşkın Bir Fernbach şişesi kullanın, bir 2.8 L hacimli şişe yeterlidir. Daha az havalandırma hasat üzerine yavaş büyüme ve daha küçük hücre pelet neden olabilir.
- Kültürün 4-5 saat büyümeden sonra günlük aşamasında (0,5-1) olduğundan emin olmak için OD600'ü kontrol edin. Zorlanmanın büyümesine bağlı olarak, en az iki katına izin vermek için büyüme süresine ayarlamalar yapın. % 2 galaktoz ekleyin ve 30 ° C shaker gecede büyümek.
NOT: OD600 bir gecede büyüme sonra değişebilir ama kültür doymuş olmalıdır. Bu büyüme protokolü için %2 galaktoz eklenmeden önce hücrelerin %0,1 glikozdan çıkarılmasıgerekmediğini unutmayın. SDS-PAGE ve batı lekelerinin doğrulanması için bu adımda 3 OD indüklenmemiş ve indüklenen hücre toplamanızı öneririz(Şekil 3A,B,Lane 1-2). - 15 dk için 4500 x g santrifüj ile hasat hücreleri. Burada 1 L hacim kültürünü barındıran sallanan bir kova rotoru kullanılabilir.
- Maya peletini 50 mL konik bir tüpe aktarın; gerektiğinde ikinci bir santrifüj adımı yapılabilir. Hücre peleti genellikle mezuniyet işaretleri ile ölçüldüğü şekilde hacmi 10-15 mL civarında olacaktır ve hemen kullanılabilir veya -80 °C'de saklanabilir.
- 15 mL arıtma tamponunda resuspend pelet (50 mM Tris pH 7.4, 300 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM Dithiothreitol (DTT), proteaz inhibitörü kokteyli) 30 mL civarında son hacmi yapmak için.
- Kullanmadan önce bir homogenizer 4 °C chill ve arıtma tampon ile dengeleyin. Mekanik hücre bozucu veya homogenizer kullanarak lyse hücreleri. 2-3 mermi için 20.000-25.000 psi homogenizer ve lize içine örnek yük; hücreler lysed hale geldikçe, daha fazla giriş basıncı 20.000-25.000 psi korumak için gerekli olduğunu unutmayın. Hücre lisatını buz üzerinde 50 mL konik bir tüpte toplayın.
NOT: Ek numunelerin lizatedilmesi gerekiyorsa, homogenizer bir sonraki numuneyi yüklemeden önce iyice temizlenmeli ve dengelenmelidir. Tüm hücre lisatlarını buzda tut. - Hücre lisatını 35.000 x g'de 4 °C'de 1 saat için hemen temizleyin. Supernatant'ı dikkatlice yeni tüpe aktarın. Santrifüj sırasında hücre lisisindeki lipidlerin üst lere doğru süzüleceğini ve arınmayı etkilemeyeceğini unutmayın.
NOT: SDS-PAGE örnekleri için lysate ve peletin %0,5-1'inin tasarruf edilmesinizi öneririz. Tipik olarak, önemli bir fark gözlenmez ve TAP protein çözünürlüğünü doğrulamak için ek bir batı lekesi yapılabilir(Şekil 4, Lanes 1 ve 2, sırasıyla). - 300 μL'lik IgG sepharose boncuklarını saflaştırma tamponu ile dengeleyin. Temizlenmiş hücre lysate ekleyin ve 4 °C dönen, 2 saat için kuluçka.
- 10 mL'lik kromatografi sütununda boncukları toplayın ve bağlı olmayan bir lysate'nin akmasını bekleyin.
- 10 mL yıkama tamponu (50 mM Tris pH 7.4, 300 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM DTT) kullanarak boncukları yıkayın, bir seferde 1 mL ekleyerek ve tamamen akmasını sağlar.
NOT: Bağlı IgG boncuklarının %2'sini SDS-PAGE örneği için saklamanızı öneririz. Tipik olarak, dört ana grup gözlemlemek; iki SNX-BAR proteini ve IgG Ağır ve Hafif Zincirler(Şekil 4, Lane 3). TEV bölünme verimliliğini karşılaştırmak için TEV'den sonra eşdeğer miktarda 'eluate' ve 'IgG boncukları' kaydetmenizi öneririz. - Boncuk toplamak ve bir mikrosantrifüj tüp aktarın. Taze yıkama tamponu ile toplam hacmin 500 μL'ine ve 2 μL'lik 10 mg/mL TEV proteaz ve inkübüne bir gecede 4 °C'de dönerek ekleyin.
- Ertesi sabah, 27 G iğne kullanarak süpernatantı tamamen çıkarın ve protein saflığını %10 poliakrilamid SDS-PAGE ile değerlendirin(Şekil 4, Lane 4).
NOT: Biz genellikle elde 500 μL 0.5-1 mg/mL 95% saf heterodimer(Şekil 4, Lane 4). Calmodulin reşin kullanılarak ek arıtma da yapılabilir, ancak biz genellikle verim önemli bir azalma görmek ve saflık >90%ise burada durdurma öneririz. TEV lipozom bağlayıcı tahlilleri ile müdahale etmez, Ancak TEV ayrıca Ni-NTA agarose boncuklar kullanılarak kaldırılabilir15. - Konsantre olmak için, numuneyi üreticinin talimatlarına göre 10 KDa kesme ve santrifüjlü 0,5 mL'lik santrifüj filtreye 50 μL veya daha az aktarın. Bradford protein testi kullanarak konsantre proteinleri ölçün. 4 °C'de saklayın ve bir hafta içinde kullanın.
3. Lipozom Hazırlığı
- Satın alım ticari lipidler: fosfatidilserin (PS), PI3P, ergosterol, ve fosfatidilkolin (PC). Gerekirse, stok lipidler yapmak için önerilen çözücü resuspend.
NOT: Lipidler üreticinin önerileri başına bir metanol / kloroform karışımı resuspended vardır. Kullanmadan önce yağ stoklarının açık ve oda sıcaklığına Kadar ısıtılmış olduğundan emin olun. Resuspended lipidler argon gazı altında saklanabilir ve -20 °C'de 6-12 ay veya aktivite kaybı gözlemlenene kadar balmumu filmi (veya eşdeğeri) kullanılarak kapatılabilir. - İstenilen lipid bileşimi ile bir karışım oluşturmak için her lipid stoğunun gerekli hacmini hesaplayın (Bkz. Tablo 1). Lipid karışımı lipidlerin toplam 1 mol varsayalım.
- Kimyasal bir duman başlık bu adımı gerçekleştirin. Temiz cam şırıngakloroform tam bir şırınga hacmi çizim ve bir atık kabına atarak. İki kez daha tekrarlayın. Kloroform aktarırken, sadece cam şırınga veya pipet kullanın. Kloroform oluştururken, şırınga içine gaz kabarcıkları girişini önlemek için yavaş yavaş stoper çekin.
- %1 PI3P, %20 ergosterol, %30 PS, PC(Tablo 1)son lipid karışımını yapmak için temiz bir cam kültür tüpüne hesaplanan stok lipitlerini aktarmak için cam şırıngaları kullanın. Çözücülere bağlı olarak her bir lipid yeniden askıda kalır, karışım her bir lipid in eklenmesi üzerine bulutlu açabilirsiniz.
NOT: PS konsantrasyonlarını (%0-30) değiştirmek için, hacimleri buna göre ayarlayın ve değişen PC ile telafi edin(Tablo 1). - Lipitleri tek tip olarak kurutmak için dairesel bir hareketle lipid karışımına yönlendirilen azot gazını kullanarak lipid karışımını dikkatlice kurutun. Kurutma işlemi sırasında cam tüpün altındaki lipidleri tutmak için düşük gaz akışını kullanın. Cam kültür tüpünü folyoile sarın, açık tanının ve 1 saat boyunca vakumda daha fazla susuz kalın.
- 2,5 mM'lik son lipozom konsantrasyonu yapmak için lipidleri tamamen susuzlaştırmak için 400 μL bağlayıcı tampon (50 mM Tris pH 7.4, 300 mM NaCl, 1 mM MgCl2)ekleyin.
NOT: Son lipozom konsantrasyonu daha fazla veya daha az bağlayıcı tampon ekleyerek ayarlanabilir. Örneğin, gerekirse 5 mM lik bir lipozom konsantrasyonu üretmek için 200 μL bağlayıcı tampon eklenebilir (aşağıya bakın).- 30 dk. Oda sıcaklığında bir girdap üzerinde orta hızda sallayarak lipidleri yeniden askıya alın.
- Yeniden askıya alınmış lipozomları mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bu noktadan itibaren, plastik pipet uçları lipidler artık kloroform resuspended olarak kullanılabilir. Lipozom çözeltisi bulutlu görünmesi gerektiğini unutmayın.
- Mikrosantrifüj tüpünü önce sıvı nitrojene, sonra 37 °C'lik su banyosuna batırarak dondurulan lipozomlar yedi ila sekiz kez çözülür. Lipozom karışımı tamamen donmuş ve katı gözle çözülmeden önce görünmelidir.
- Kimyasal duman kaputunda kloroform içeren adımları gerçekleştirin. Herhangi bir kalıntı lipidleri çıkarmak için, her biri üç kez kloroformun tam şırınga hacimlerini çizerek ve atarak iki adet 1 mL cam şırınga temizleyin. Her cam şırıngasını iki şırınga hacmi oluşturarak ultra saf suyla dengeleyin, ardından iki şırınga hacmi oluşturarak bağlama tamponu yla dengeleyin.
- Mini ekstrüderi üreticinin tavsiyelerine göre monte edin. Her birini bağlayıcı arabellekte batırarak bir adet 200 nm membran ve iki adet filtre desteksini (Bkz. Malzeme Tablosunabakınız) dengeleyin.
- Filtre destekleri arasındaki membranı sandviçleyin ve mini ekstrüzyonun içine yerleştirin. Monte edilmiş mini ekstrüzyondaki ölü hacmi azaltmak ve montajın hava geçirmez olduğundan emin olmak için, 1 mL cam şırıngaları kullanarak mini ekstrüzyon ile lipozom karışımının hacmine benzer bir bağlama tampon hacmini geçirin.
- 1 mL cam şırıngalardan birini kullanın ve lipozom karışımını çizin. Cam şırınga içine çizim için tüp kapağı nda lipozom karışımı son toplamak için mikrosantrifüj tüp ters.
- 200 nm membrandan 19-21 kez geçerek lipozomları dışarı layın. Yeni bir mikrosantrifüj tüp ekstrüzyon lipozomlar toplamak.
NOT: Ekstrüzyon öncesi ekstrüzyon lipozomlar daha az bulutlu görünmelidir. Lipozomlar aynı gün kullanılmalı ve buzüzerinde depolanmalıdır. Son ekstrüzyon, başladığı şırınganın tam tersi lipozomlar yerleştirmelidir.
4. SNX-BAR Lipozom Bağlama ve Tübülasyon
- Lipozom bağlama ve sedimantasyon deneyleri öncesinde 4 °C'de 20 dakika ultracentrifuge'da 100.000 x g'de önceden saflaştırılmış protein. Supernatant çıkarın ve yeni bir mikrosantrifüj tüp aktarın; varsa peletrahatsız etmeyin.
- Lipozom bağlama ve tubülasyon tahlilleri gerçekleştirmek için, inkübat 4 μM saflaştırılmış Snx4-Atg20 ve 2.5 mM lipozomlar toplam reaksiyon hacmi 20 μL, lipozomların hacmi değişen ekledi.
NOT: Aynı deneyde, aynı miktarda lipozom kullanılmalıdır. - Reaksiyonu 30 dakika boyunca 30 °C'de kuluçkaya yatırın.
NOT: Sedimantasyon sırasında görselleştirmeye olanak sağlamak için en az 10 μL lipozom kullanarak her reaksiyona eklenen 2,5 mM lipozom miktarını en üst düzeye çıkarmayı öneriyoruz. 20 μL'lik bir reaksiyonda 2,5 mM lipozomun 10 μL'si kullanılırsa, lipozomların son konsantrasyonu 1.25 mM olacaktır. Saflaştırılmış proteinler seyreltilmiş sayılsa ve 4 μM protein için daha fazla hacim gerekiyorsa, lipozom konsantrasyonu iki katına çıkarmak için rehidrasyon adımı sırasında lipidler 200 μL'de yeniden askıya alınabilir (Bkz. Adım 3.6); ancak, bu lipozomlar yapmadan önce protein konsantrasyonu bilmek gerektirecektir. -
Lipozom tubulation'u görselleştirin ve ölçün.
- Elektron mikroskobu analizi için lipozom bağlama reaksiyonlarını hemen işleyin. %1 uranyl asetat kullanarak karbon kaplı bakır örgü ızgarave negatif leke üzerine spot numuneler (Şekil 5B)16.
- İletim elektron mikroskobundaki (200 kV) numuneleri analiz edin.
- Tübül çapını ölçmek ve ölçmek için görüntü analizi yazılımLarını kullanın. Tek bir tübülün tübül çapını doğru bir şekilde ölçmek için, bir tübül uzunluğu ve ortalama boyunca üç çap ölçümü alın (Şekil 5B).
NOT: İstatistiksel anlamlılığı belirlemek için varyansın iki yönlü analizi kullanılmıştır (Şekil 5E). Uranyal asetat hem radyoaktif hem de toksiktir. Bu adımı gerçekleştirmek için uygun laboratuvar güvenliği sertifikası gereklidir.
-
Lipozom bağlanması ve sedimantasyon.
- Reaksiyonu (20 μL, adım 4.3'ten) polikarbonat santrifüj tüpüne aktarın ve 4 °C'de 20 dakika boyunca ultracentrifuge'da 100.000 x g'da dönmek için uyumlu bir rotor kullanın. Dikkatle supernatant çıkarın ve yeni microcentrifuge tüp aktarın. Peletin sağlam kalması gerektiğini unutmayın.
- SDS-PAGE 40 μL numune tamponundaki peleti yeniden askıya alın ve yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Supernatant'a 20 μL örnek arabellek ekleyin. %10 poliakrilamid SDS-PAGE jeline eşdeğer miktarda pelet ve supernatant yükleyin ve lipozomlara bağlı SNX-BA'ları görselleştirmek için Coomassie boyama yapın(Şekil 5A).
- Pelet fraksiyonundaki SNX-BAR kompleksinin miktarını ölçmek için, bant yoğunluklarını yoğunsitometri kullanarak ölçün ve pelet fraksiyonundaki SNX-BAR proteinlerinin oranını ölçün.
NOT: İstatistiksel anlamlılığı belirlemek için varyansın iki yönlü analizi kullanılmıştır (Şekil 5C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, alt akım membran remodeling tahlilleri için kullanılabilecek endojen maya SNX-BAR komplekslerinin tekrarlanabilir ve sağlam üretimi için bir yöntem tanımlamaktadır (Şekil 1). Arınma için kullanılan maya suşunun yapımı, tomurcuklanan mayada homolog rekombinasyon verimliliğinden yararlanarak hedeflenen SNX-BAR'ların genomik locisinde değişiklikleryapılmasını sağlar(Şekil 2). Bu tasarımın iki avantajı vardır, (i) değişiklikleri korumak için seçim gerekli değildir, standart YP orta kullanılabilir, daha yüksek bir hücre yoğunluğu büyüme için izin ve böylece protein daha yüksek üretim ve (ii) hedeflenen SNX-BAR ifade düzeyleri eşit olacak, heterodimer kompleksinin üretimini optimize. Galaktoz ilavesinden önce, hedeflenen SNX-BA'lar null fenotip sergiler ve böylece hedeflenen SNX-BAR'lara özgü bir büyüme kusuru na veya bilinen diğer kusurlara neden olabilir. Ayrıca% 2 raffinose ve% 0.1 glikoz büyüme% 2 glikoz büyüme daha yavaştır. Bu nedenle, galaktoz indüksiyonundan önceki büyüme dönemi her bir gerginlik için optimizasyon gerektirebilir. SNX-BAR ekspresyonunun doğru indüksiyonuna bakılması için, SNX-BAR'ların protein düzeyleri Coomassie lekesi ile tespit edilemeyebileceğinden TAP etiketine karşı batıda bir leke olması muhtemeldir(Şekil 3). Ancak, SNX-BAR kompleksinin sadece bir üyesinin etiketi olduğundan, saflaştırmanın tüm adımları tamamlanmadıkça etiketlenmemiş protein(ler) ifadesi doğrulanamaz. SNX-BAR heterodimer arındırılmasından sonra, iki SNX-BA'nın bantları 1:1 stokiyometrik oranda görünmelidir ve kirletici bantlar çok az olmalıdır(Şekil 4, şerit 4). İlave kirletici bantlar varsa ve başlangıç maya sıyrık zaten proteaz-eksik ise, hücre lisisi sırasında daha proteaz inhibitörü eklenebilir. Ayrıca calmodulin reşin kullanılarak ikinci bir arıtma adımı yapılabilir.
Membran remodeling tahlilleri(Şekil 5)ilerirken, aynı deneyde lipozomların ve saflaştırılmış proteinlerin aynı hazırlanması kullanılmalıdır. İstenilen konsantrasyona ulaşmak için proteinin birden fazla saflaştırma preparatları gerekiyorsa, deney den önce saflaştırılmış tüm proteini birleştirin. Lipozomlar aynı gün içinde yapılmalı ve kullanılmalıdır (Tablo 1). Lipozom sedimantasyon tahlilleri yapılırken, saflaştırılmış proteinin, çökelmiş protein inkümlemeden hemen önce 20 dk için 100.000 x g'lık aynı sedimantasyon koşulları kullanılarak önceden temizlenmesi önemlidir. Ayrıca, lipozom pelet sedimantasyon sonra bozulmadan kalmalıdır.
Şekil 1: SNX-BAR bağlayıcı istinat akış şeması. Kısaca, adım 1-2, biz iki SNX-BAR genomik loci içine GAL organizatörleri mühendisi, endojen organizatörlerin her yerine ve iki SNX-BAR loci biri içine bir C-terminal TAP etiketi mühendis. Daha sonra, 3-7 adımda, hücreleri galaktoz ile indükler ve SNX-BAR heterodimerlerini homojenliğe arındırır. 8-12. adımda unilamellar lipozomları hesaplayıp hazırlıyoruz. Son olarak, biz unilamellar lipozomlar ile SNX-BAR heterodimers birleştirmek ve iki tahliller gerçekleştirebilirsiniz; Adım 14a-16a membran tubulation ve 14b-16a sedimantasyon tsay içerir. Daha fazla ayrıntı için metne bakın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: SNX-BAR entegrasyon stratejisi. Homolog rekombinasyon kullanılarak GAL ekspresyonu için iki SNX-BAR lokusu hedeflendi. SNX-BAR ORF1 (Atg20) ayrıca bir C-terminal TAP etiketini ifade etmek için hedeflenmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Galaktoz indüksiyon doğrulaması. (A-B) Atg20-TAP'ın GAL indüksiyonuna doğruluğunu doğrulamak için % 2 galaktoz (A, B, şerit 2) ile indüklenen ve indüklenmemiş (A, B, şerit 1) ile indüklenen hücre ekstrelerinin SDS-PAGE ve batı leke analizini öneriyoruz. (C) Batı leke membranı da sökülür ve yükleme kontrolü için anti-pgk1 ile incelenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Atg20-Snx4 heterodimerlerinin örnek arınması. Galaktoz organizatörleri tarafından yönlendirilen Atg20-TAP ve Snx4'ü ifade etmek için tasarlanmış maya hücreleri %2 galaktoz, lysed ve IgG sepharose kullanılarak bağlanmış ve TEV protetazı ile eluted ile indüklenmiştir. Arınmanın her adımından örnekler %10 SDS-PAGE'de gösterilmiştir. Lane 1: lysate indüklenen supernatant. Lane 2: lysate indüklenen pelet. Lane 3: IgG sepharose bağlı protein örneği. Şerit 4: IgG sepharose saf Atg20-Snx4 heterodimers TEV eluate. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Temsili lipozom bağlama ve tubulation tsay. (A) SNX-BAR heterodimerleri, Mayadan Atg20-Snx4 ve Vps5-Vps17, metinde açıklandığı gibi ifade edilmiş, saflaştırılmış ve sentetik lipozomlara bağlanmıştır. Mvp1'in homodimerler oluşturduğuna ve bakterilerle ifade edildiğini unutmayın. (B) Snx4-Atg20 lipozom tubulation tsay ve tübül ölçümlerinin EM mikrografları (inset). (C) SNX-BAR değişen lipozom bileşimlerine bağlanmaden densitometri ile ölçüldü. Grafik, ortalamanın ortalama ve standart hatasını gösterir. **p < 0.002. (D) Tübül çapları metinde açıklandığı şekilde ölçülür ve grafiklenmiştir. Ölçek çubuğu = 200 nm. Hata çubukları varyans iki yönlü çözümleme temsil. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Tipik Lipozom Kompozisyonu | DOPC | DOPS | Ergosterol | PI3P-C16 |
| Mw | 786.1 | 810.0 | 396.7 | 957.0 |
| mol fraksiyonu | 49% | 30% | 20% | 1% |
| Stok mM | 32.0 | 12.0 | 25.0 | 1.0 |
| Kütle (mg) | 385.2 | 243.0 | 79.3 | 9.6 |
| Konsantrasyon (mg/mL) | 25.2 | 9.7 | 9.9 | 1.0 |
| RXN(mL) için hacim | 15.3 | 25.0 | 8.0 | 10.0 |
Tablo 1: Lipozom tarifi. Sentetik lipozomlar DOPC, DOPS, ergosterol ve PI3P kombinasyonu kullanılarak hazırlanmıştır. Son konsantrasyonu 1 mol lipid olarak hesaplıyoruz. Standart kompozisyonumuz %20 ergosterol, %1 PI3P, DOPS (%30'a kadar) ve değişen miktarlarda DOPC'yi içermektedir. Tablo% 30 DOPS 400 μL için tipik bir formülasyon içerir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, mayada SNX-BAR dimerlerini arındırmak için optimize edilmiş bir iş akışı ve sentetik lipozomlar üzerindeki biyofiziksel özelliklerini değerlendirmek için iki deneme gösteriyoruz. Escherichia coli veya diğer sistemlerde tipik rekombinant protein ekspresyonuna göre en büyük avantaj, SNX-BAR proteinlerini yerli bir konakta eşit olarak ifade edebilme, böylece diğer sistemlerde SNX-BAR'ların arındırılmasında bulunan toksisite ve çözünmezlik sorunlarından kaçınabilme yeteneğidir. Ayrıca sistemimizin moleküler klonlama veya birden fazla ifade vektörü17barındırma gerektirmez dikkat çekicidir. Çift SNX-BAR maya suşlarımız kromozomel olarak tasarlanmış galaktoz organizatörleri tarafından yönlendirilir ve böylece indüksiyon üzerine eşit ifade sağlar. Önemli bir husus, galaktoz yokluğunda, hedeflenen SNX-BA'ların çok az ifade, böylece null fenotip sonuçlanan olacaktır. Ayrıca, SNX-BAR'ların C-terminal etiketlerini iyi tolere etme eğiliminde olduğunu ve C-terminus'a TAP etiketini eklememizi sağladığını görüyoruz. Ancak, etiketlenen proteine bağlı olarak, N-terminal TAP etiketi de12kullanılabilir. Ayrıca, SNX-BAR'lar sadece 1:1 dimers formu beri, sadece bir protein arıtma amaçlı etiketlenmiş olması gereklidir. Ancak, normalde hücrede heterodimer oluşturan bazı SNX-BA'lar fizyolojik olmayan konsantrasyonlar altında homodimers oluşturmak için gösterilmiştir7. Bu nedenle, heterodimer saflaştırma üzerine, iki SNX-BAR stokiyometrik oranı 1:1 olması gerektiğini önemlidir, hangi bir SDS-PAGE jel üzerinde saflaştırılmış karmaşık bir aliquot çalıştırarak ve Coomassie boyama gerçekleştirerek doğrulanabilir. Bir kez tasarlanmış, bu maya suşları ebediyen olarak kaydedilebilir 15% (v / v) gliserol stok -80 °C ve / veya ek bağlama ortakları sorgulamak için ek olarak değiştirilmiştir. İş akışımız genellikle gerinim yapımı için 2-3 hafta, ifade ve arınma için 3-4 gün ve lipozom bağlayıcı tahliller için 1 gün sürer. Bu iş akışının araştırmacıların sentetik lipozomlar veya dev unilamellar veziküller (GUVs) üzerinde yerli BAR proteinleri kullanarak SNX-BAR proteinlerinin lipid özgüllüğünü daha iyi anlamalarına yardımcı olabileceğine ve membran remodeling'i sürmek için gereken lipidlerin hassas yapısını ortaya çıkararak etki mekanizmalarını ortaya çıkarabileceğine inanıyoruz.
Kritik adımlar
SNX-BAR heterodimerlerini proteaz olmayan yetersiz hücrelerden arındırmaya yönelik ilk denemelerimizde, genellikle verimde ve bozulmadan azalan ürünler bulduk. Bu nedenle, gerinim konstrüksiyonunun ilk adımlarını atalım sırasında, bir veya daha fazla büyük vakuoler proteinaziçin eksik olan bir ebeveyn mayası ile başlamanın çok önemli olduğuna inanıyoruz. Özellikle, biz maya zorlanma TVY614 bulundu, hangi pep4için tükenmiş , prb1, ve prc1, en optimal olmak. TVY614 türünü kullanarak rutin olarak >%90 saf Snx4-Atg20 heterodimers(Şekil 4 ve Şekil 5A)elde ediyoruz. Ancak, her üç proteinazın da ablated olması gerekliliği SNX-BAR kombinasyonuna özgü olabilir. Örneğin, Vps5-Vps17 heterodimerler proteaz olmayan eksik suşları10 başarıyla arındırılmış ve bir PEP4 ablasyon eklenmesi dahil edildiğinde, biz verim ve saflık mütevazı artışlar gözlemlemek(Şekil 5A). Bu nedenle, kullanıcının downstream uygulamalarına ve saflık veya seçilebilir işaretçilere olan gereksinime bağlı olarak, ifade suşları tasarlarken esneklik olabilir.
Gen yapılaştırma sırası da önemlidir. Galaktoz indüksiyonuna gerek kalmadan batı lekesinin ekspresyonunu doğrulamak için önce C-terminaltap etiketlemeSNX-BAR ORF 1'i öneriyoruz (Şekil 1). Galaktoz indüksiyonu sırasında hücrelerin bir gecede %2 raffinose ve %0.1 glikozda ön koşullandırması önemlidir. Hücrelerin ön koşula uymaması son derece yavaş büyüme veya hücre ölümüyle sonuçlanır. Ancak, aynı zamanda hücrelerin gece büyüme sırasında kalan glikoz tüketmek için önemlidir, aksi takdirde galaktoz indüksiyon olumsuz etkilenebilir. Ayrıca TAP etiketli SNX-BAR proteinlerinin ekspresyon homojenliğini değerlendirmek için batı lekelerine göre birden fazla izolasyon un kontrol etmesi önerilir. Biz genellikle ekran 2-3 izole ve en sağlam ifade adayı seçin.
Modifikasyon, alternatif yaklaşımlar ve gelecekteki uygulamalar
Adım 2.8, tandem afinite saflaştırma (TAP) genellikle TEV dekolte sonra IgG ve calmodulin boncuklar kullanarak iki adımlı arınma gerektirir12. Ancak bu protokolde, SNX-BAR dimerlerini TEV proteaz ile çok yüksek verim ve saflıkla sediyoruz. Calmodulin boncuklar kullanılarak sonraki yakınlık arınma tutarsız ve azaltılmış verim üretir bulmak, bu nedenle TEV bölünme sonra durdurma öneririz. SNX-BAR proteinleri ve Onun(6)etiketli TEV proteaz içeren TEV eluat daha Ni-NTA agarose boncuklar tarafından saflaştırılmış olabilir. Ancak, bu adımın genel SNX-BAR protein verimini azalttığını ve gereksiz olduğunu görüyoruz, çünkü TEV proteazı lipozom bağlanmasıveya tubulation tahlillerine engel değildir. Bu nedenle, saflaştırılmış SNX-BAR'lar başka bir uygulama için kullanılacaksa, kullanıcının tahlillerinde TEV proteazının etkisini değerlendirmesini öneririz.
Şimdiye kadar, bu protokolü ve mayadaki Snx4-Atg20 ve Vps5-Vps17 heterodimerlerini arındırmak için yapılan değişiklikleri kullanarak başarılı olduk ve sentetik lipozomlardaki lipid özgüllüklerini başarıyla değerlendirdik. Ancak, protokolün mayadaki SNX-BA'lardan herhangi biri için başarıyla uyarlanabileceğine inanıyoruz. Sistemi diğer organizmalardan rekombinant SNX-BAR proteinleri üretmek için de kullanmak mümkündür. Ancak, bu maya genomu içine bir eksojen gen lokusu entegre etmek için gerinim inşaat ek bir adım gerektirir. Ayrıca sistemin kargo proteinleri de dahil olmak üzere çok meric kompleksleri arındırmak için genişletilebilir inanıyoruz. Bu nedenle, ifade sistemimizin SNX-BAR'ların lipid belirteçlerini anlamanın ötesine geçebileceğine inanıyoruz. Gelecekteki uygulamalar, araştırmacıların tam montajların membran remodeling'i nasıl etkileyebileceğini anlamak için lipozomlar üzerindeki tüm kargo yakalama komplekslerini yeniden oluşturmalarına olanak sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu yayında bildirilen araştırma, GM060221 ödül numarası altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü ve kısmen Ulusal Enstitüler Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. t32GM007223 ödül numarası altında Sağlık. R.C. kısmen UNC-Charlotte Fakültesi Araştırma Hibe Programı tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm PC Membranes | Avanti | 610006 | |
| 10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad) | Bio-Rad | 731-1550 | |
| 27 G needle | BD Biosciences | 301629 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff | Amicon | UFC501024 | |
| Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer | Avestin | EF-C3 | |
| BCA assay | Pierce | 23225 | |
| Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
| DOPC | Avanti | 850375 | |
| DOPS | Avanti | 840035 | |
| Ergosterol (Sigma) | Sigma | 47130-U | |
| Extruder Set with Block 0.2 μL/1 mL | Avanti | 610000 | |
| FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV) | |||
| Glass culture tubes | VWR | 47729-570 | |
| IgG sepharose beads (GE Healthcare) | GE Healthcare | 17-0969-01 | |
| Microlter glass syringes | Hamilton | 7637-01 | |
| New Brunswick Excella E25 | Eppendorf | M1353-0000 | or equivalent shaking 30 °C |
| Ni-NTA Magnetic Agarose Beads | Pierce | 78605 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-076 | |
| PI3P | Echelon | P-3016 | or Echelon equivalent |
| Polycarbonate bottle assembly | Beckman Coulter | 355622 | |
| TLA-100 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
| Type 45 Ti Rotor | Beckman Coulter | ||
| Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve | VWR | 75871-436 | |
| Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1) | A&J Vacuum | PN07050 | |
| Vortex with foam holder | VWR | 10153-838 | |
| VWR KIT MICROTUBE | VWR | 12620-880 |
References
- Teasdale, R. D., Collins, B. M. Insights into the PX (phox-homology) domain and SNX (sorting nexin) protein families: structures, functions and roles in disease. The Biochemical Journal. 441 (1), 39-59 (2012).
- Zhang, H., et al. The Retromer Complex and Sorting Nexins in Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 79 (2018).
- Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harbor perspectives in Biology. 6 (2), (2014).
- Chi, R. J., Harrison, M. S., Burd, C. G. Biogenesis of endosome-derived transport carriers. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (18), 3441-3455 (2015).
- Wang, J., et al. Endosomal receptor trafficking: Retromer and beyond. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (8), 578-590 (2018).
- Ma, M., et al. Lipid trafficking by yeast Snx4 family SNX-BAR proteins promotes autophagy and vacuole membrane fusion. Molecular Biology of the Cell. , (2018).
- van Weering, J. R., et al. Molecular basis for SNX-BAR-mediated assembly of distinct endosomal sorting tubules. The EMBO Journal. 31 (23), 4466-4480 (2012).
- Chi, R. J., et al. Fission of SNX-BAR-coated endosomal retrograde transport carriers is promoted by the dynamin-related protein Vps1. The Journal of Cell Biology. 204 (5), 793-806 (2014).
- Purushothaman, L. K., Arlt, H., Kuhlee, A., Raunser, S., Ungermann, C. Retromer-driven membrane tubulation separates endosomal recycling from Rab7/Ypt7-dependent fusion. Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 783-791 (2017).
- Purushothaman, L. K., Ungermann, C. Cargo induces retromer-mediated membrane remodeling on membranes. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2709-2719 (2018).
- Wurmser, A. E., Emr, S. D. Phosphoinositide signaling and turnover: PtdIns(3)P, a regulator of membrane traffic, is transported to the vacuole and degraded by a process that requires lumenal vacuolar hydrolase activities. The EMBO journal. 17 (17), 4930-4942 (1998).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
- Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
- Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods in Molecular Biology. 498, 297-307 (2009).
- Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. Journal of Lipid Research. 52 (1), 175-184 (2011).
- Yong, X., et al. Expression and purification of the SNX1/SNX6 complex. Protein Expression and Purification. 151, 93-98 (2018).
