Expression, Reinigung und Liposomenbindung von angehenden Hefe-SNX-BAR-Heterodimeren
Summary
Hier stellen wir einen Workflow für die Expression, Reinigung und Liposomenbindung von SNX-BAR Heterodimeren in Hefe vor.
Abstract
SNX-BAR-Proteine sind eine evolutionär konservierte Klasse von Membran-Remodeling-Proteinen, die eine Schlüsselrolle bei der Sortierung und dem Handel mit Proteinen und Lipiden während der Endozytose, der Sortierung innerhalb des endosomalen Systems und der Autophagie spielen. Zentral für die SNX-BAR-Proteinfunktion ist die Fähigkeit, Homodimere oder Heterodimere zu bilden, die Membranen mit hochkonservierten Phox-Homologie-Domänen (PX) und BAR (Bin/Amphiphysin/Rvs) binden. Darüber hinaus kann die Oligomerisierung von SNX-BAR-Dimern auf Membranen die Bildung von Membrantubuli und Vesikeln auslösen, und diese Aktivität wird angenommen, dass sie ihre Funktionen als Mantelproteine für Endosomen-abgeleitete Transportträger widerspiegelt. Forscher haben lange In-vitro-Bindungsstudien mit rekombinanten SNX-BAR-Proteinen an synthetischen Liposomen oder riesigen Unilamellar-Vesikeln (GUVs) verwendet, um die genaue Zusammensetzung von Lipiden zu enthüllen, die für die Remodellierung der Membran erforderlich sind, und so ihren Wirkmechanismus zu offenbaren. Aufgrund technischer Herausforderungen mit dualen Expressionssystemen, der Toxizität der SNX-BAR-Proteinexpression in Bakterien und der schlechten Löslichkeit einzelner SNX-BAR-Proteine haben die meisten Bisherigen Studien SNX-BAR-Homodimere untersucht, einschließlich nicht-physiologischer Dicher, die sich während der Expression in Bakterien bilden. Kürzlich haben wir ein Protokoll optimiert, um die großen Mängel eines typischen bakteriellen Expressionssystems zu überwinden. Anhand dieses Workflows zeigen wir, wie man große Mengen von SNX-BAR Heterodimeren erfolgreich ausdrückt und reinigt und wie man sie auf synthetischen Liposomen für Bindungs- und Tubulationstests rekonstituiert.
Introduction
Membrangebundene Organellen wie die Plasmamembran, das endoplasmatische Retikulum, das Golgi-Gerät, Dassosom (Hefe-Vakuole) und endosom bilden das Endomembransystem der eukaryotischen Zelle. Die meisten Organellen haben die Fähigkeit, Material mit anderen Organellen durch Vesikeltransportträger zu kommunizieren und auszutauschen. Wie die Zelle die Verpackung und Bildung von Vesikeltransportträgern innerhalb des Endomembransystems koordiniert, ist nicht genau bekannt. Es ist jedoch bekannt, dass die Proteine und Lipide, die einen Großteil des Endomembransystems ausmachen, aus der Internalisierung endozytärer Vesikel aus der Plasmamembran (PM) stammen. Das Endosom ist die primäre Akzeptor-Organelle für diese Vesikel und besteht aus mehreren miteinander verbundenen Sätzen von röhrenförmigen Organellen. Die Hauptfunktion des Endosomes besteht darin, die Nährstofferfassung zu erleichtern, den Protein- und Lipidumsatz zu regulieren, vor Krankheitserregerinfektionen zu schützen und als primäre Wiederauffüllungsquelle für Lipide für die Plasmamembran zu dienen. Da das Endosom den Großteil der Ladungsproteine und Lipide aus der Plasmamembran erhält, fungiert es als Sortierraum, indem es Ladungen in röhrenförmige endosomale Transportträger (ETCs) isoliert. Alle Proteine, die nicht in ETCs sequestriert werden, müssen über das endolysosomale System abgebaut werden. Die Dysregulation der Ladungsortierung in ETCs kann zum Verlust der Nährstoffaufnahme, des Proteinumsatzes oder der Lipidhomöostase führen, was zu zahlreichen stoffwechsel-, Entwicklungs- und neurologischenStörungen1,2führt. Trotz der zentralen Rolle der ETCs beim Endosome ist jedoch der zugrunde liegende Mechanismus, wie das Endosom selektiv die Verpackung einer Vielzahl heterogener Ladungen in Röhrenträger koordinieren kann, nicht bekannt.
Die Sertiernexin-Familie (SNX) ist eine evolutionär konservierte Klasse von Proteinen, die für viele Vesikeltransportreaktionen in der Zelle3,4,5kritisch sind. Sortiernvonnexine werden an die Endosome-Membran rekrutiert und helfen bei der Ladungsaufnahme über ihre charakteristische Phox-Homologie(PX)-Domäne, die Phosphatidylinositol-3-Monophosphat (PtdIns(3)P bindet, ein Lipid, das an der Endosome-Membran angereichert ist. Säugetiere kodieren 33 SNX-Proteine, die je nach Vorhandensein andererDomänenweiter in mehrere Unterfamilien unterteilt werden können. Vor allem die SNX-BAR-Unterfamilie ist die größte Unterfamilie, die aus zwölf menschlichen Unterfamilien besteht, während in der aufkeimenden Hefe Saccharomyces cerevisiaedie Unterfamilie auf nur sieben SNX-BARs reduziert wird. SNX-BAR-Proteine haben sowohl eine PX-Domäne als auch eine Bin-Amphiphysin-Rvs (BAR)-Domäne, die Lipidreservoirs auslöst, um positive Krümmungsmembranen zu binden. Folglich hat die SNX-BAR-Familie eine natürliche Affinität zum Endosom und kann die ETC-Bildung über ihre Membran-Remodellierungsfähigkeiten vermitteln. In vitro können die Remodellierungseigenschaften von SNX-BARs durch Zugabe von gereinigten SNX-BARs zu synthetischen Liposomen induziert werden und die anschließende Bildung schmaler, beschichteter Tubuli kann durch Elektronenmikroskopie visualisiert werden. Mit diesen Methoden haben die Forscher festgestellt, dass sowohl die Oligomerisierungskonzentration als auch die Verengungsfestigkeit in der SNX-BAR-Familie zu variieren scheinen, was darauf hindeutet, dass sie sowohl bei der Bildung als auch bei der Sission von ETCs helfen könnten.
Die SNX-BARs können weiter nach ihren exklusiven Dimerisierungseigenschaften klassifiziert werden. In-vitro-Bindungstests und Strukturstudien haben gezeigt, dass SNX-BAR-Proteine nur spezifische Homodimere oder Heterodimere bilden können. Daher könnte grundsätzlich jedes potentielle SNX-BAR Dimer-Oligomer einen Tubulenmantel für einen ladungsspezifischen Handelsweg liefern und ebenso kann die eingeschränkte Oligomerisierung der anderen SNX-BAR-Protomere auch unterschiedliche Exportwege definieren. Aufgrund der großen Anzahl von SNX-BARs und der Vielfalt innerhalb der SNX-Familie ist eine Einzige-Sortierung nexin-one-Frachthypothese jedoch höchst unwahrscheinlich. Stattdessen ist eine koordinierte Anstrengung mit einer Vielzahl von Faktoren wie SNX-BARs, Fracht, Lipidspezifität und anderen Abhängigkeiten wahrscheinlicher. Ebenso ergaben neuere Studien der Hefe-SNX4-Familie Hinweise auf zusätzliche Lipidspezifität, über PtdIns(3)P hinaus, um Endosome-Transportträger zu potenzieren6. In dieser Studie wurde SNX-BAR Homodimer Mvp1-Mvp1 von Bakterien gereinigt und native Heterodimere Snx4-Atg20 und Vps5-Vps17 wurden in hoher Ausbeute aus Hefe exprimiert und gereinigt, während nur Snx4-Atg20 gefunden wurde, um phosphatidylserin (PS) bevorzugt zu binden und in Liposomenbindungsstudien schmale röhrenartige Strukturen zu bilden6. Während andere auf diesem Gebiet wichtige Eigenschaften der SNX-BARs mit rekombinant gereinigten SNX-BAR-Homodimeren von Bakterien aufgedeckt haben, hat die Toxizität, die mit der Exzessierung von SNX-BAR-Heterodimeren in ähnlichen Systemen verbunden ist, ihre native Charakterisierung7,8,9,10behindert. Daher müssen Forscher ohne ein zuverlässiges System, um rekombinant eduzierte native Heterodimere zu erhalten, auf diese Untersuchungslinien verzichten. In Abbildung 1präsentieren wir einen vierteiligen Workflow zu 1) konstruieren einen Hefestamm, der SNX-BAR-Heterodimere zur Tandemaffinitätsreinigung überexprimiert, 2) native SNX-BAR-Heterodimere ausdrücken und reinigen, 3) unilamellare synthetische Liposomen vorbereiten und 4) einen Liposomentubulations- oder Sedimentations-Assay einrichten, der ein wichtiges Werkzeug für Forscher darstellt, um den wachsenden Katalog von Nexinen zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier zeigen wir einen optimierten Workflow zur Reinigung von SNX-BAR-Dimeren in Hefe und zwei Assays zur Bewertung ihrer biophysikalischen Eigenschaften auf synthetischen Liposomen. Der Hauptvorteil gegenüber der typischen rekombinanten Proteinexpression in Escherichia coli oder anderen Systemen ist die Fähigkeit, SNX-BAR-Proteine in einem nativen Wirt gleichmäßig auszudrücken und so die Toxizitäts- und Unlöslichkeitsprobleme zu vermeiden, die bei der Reinigung von SNX-BARs in anderen Systemen auftreten. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde vom National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health unter der Vergabenummer GM060221 und teilweise vom National Institute of General Medical Sciences der National Institutes unterstützt. gesundheitsamt t32GM007223. R.C. wurde teilweise vom UNC-Charlotte Faculty Research Grants Program unterstützt.
Materials
| 0.2 micrometer PC Membranes | Avanti | 610006 | |
| 10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad) | Bio-Rad | 731-1550 | |
| 27 Gauge needle | BD Biosciences | 301629 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff | Amicon | UFC501024 | |
| Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer | Avestin | EF-C3 | |
| BCA assay | Pierce | 23225 | |
| Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
| DOPC | Avanti | 850375 | |
| DOPS | Avanti | 840035 | |
| ergosterol (Sigma) | Sigma | 47130-U | |
| Extruder Set with Block 0.2 microlter/1mL | Avanti | 610000 | |
| FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV) | |||
| Glass culture tubes | VWR | 47729-570 | |
| IgG sepharose beads (GE Healthcare) | GE Healthcare | 17-0969-01 | |
| Microlter glass syringes | Hamilton | 7637-01 | |
| New Brunswick Excella E25 | Eppendorf | M1353-0000 | or equivalent shaking 30 C |
| Ni-NTA Magnetic Agarose Beads | Pierce | 78605 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-076 | |
| PI3P | Echelon | P-3016 | or Echelon equivalent |
| Polycarbonate bottle assembly | Beckman Coulter | 355622 | |
| TLA-100 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
| Type 45 Ti Rotor | Beckman Coulter | ||
| Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve | VWR | 75871-436 | |
| Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1) | A&J Vacuum | PN07050 | |
| Vortex with foam holder | VWR | 10153-838 | |
| VWR KIT MICROTUBE | VWR | 12620-880 | |
References
- Teasdale, R. D., Collins, B. M. Insights into the PX (phox-homology) domain and SNX (sorting nexin) protein families: structures, functions and roles in disease. The Biochemical Journal. 441 (1), 39-59 (2012).
- Zhang, H., et al. The Retromer Complex and Sorting Nexins in Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 79 (2018).
- Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harbor perspectives in Biology. 6 (2), (2014).
- Chi, R. J., Harrison, M. S., Burd, C. G. Biogenesis of endosome-derived transport carriers. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (18), 3441-3455 (2015).
- Wang, J., et al. Endosomal receptor trafficking: Retromer and beyond. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (8), 578-590 (2018).
- Ma, M., et al. Lipid trafficking by yeast Snx4 family SNX-BAR proteins promotes autophagy and vacuole membrane fusion. Molecular Biology of the Cell. , (2018).
- van Weering, J. R., et al. Molecular basis for SNX-BAR-mediated assembly of distinct endosomal sorting tubules. The EMBO Journal. 31 (23), 4466-4480 (2012).
- Chi, R. J., et al. Fission of SNX-BAR-coated endosomal retrograde transport carriers is promoted by the dynamin-related protein Vps1. The Journal of Cell Biology. 204 (5), 793-806 (2014).
- Purushothaman, L. K., Arlt, H., Kuhlee, A., Raunser, S., Ungermann, C. Retromer-driven membrane tubulation separates endosomal recycling from Rab7/Ypt7-dependent fusion. Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 783-791 (2017).
- Purushothaman, L. K., Ungermann, C. Cargo induces retromer-mediated membrane remodeling on membranes. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2709-2719 (2018).
- Wurmser, A. E., Emr, S. D. Phosphoinositide signaling and turnover: PtdIns(3)P, a regulator of membrane traffic, is transported to the vacuole and degraded by a process that requires lumenal vacuolar hydrolase activities. The EMBO journal. 17 (17), 4930-4942 (1998).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
- Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
- Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods in Molecular Biology. 498, 297-307 (2009).
- Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. Journal of Lipid Research. 52 (1), 175-184 (2011).
- Yong, X., et al. Expression and purification of the SNX1/SNX6 complex. Protein Expression and Purification. 151, 93-98 (2018).
