Summary
Здесь мы представляем рабочий процесс для выражения, очищения и липосомы связывания гетеродимеров SNX-BAR в дрожжах.
Abstract
Белки SNX-BAR являются эволюционно сохраненным классом мембранных белков, которые играют ключевую роль в сортировке и обороте белков и липидов во время эндоцитоза, сортировки внутри эндосомальной системы и аутофагии. Центральное место в функции белка SNX-BAR является способность формировать гомодимеры или гетеродимеры, которые связывают мембраны с использованием высоко консивенных фокс-гомологии (PX) и BAR (Bin/Amphiphysin/Rvs) доменов. Кроме того, олигомеризация димеров SNX-BAR на мембранах может вызвать образование мембранных трубок и пузырьков, и эта деятельность, как полагают, отражает их функции в качестве белков пальто для эндосомного происхождения транспортных носителей. Исследователи уже давно используют in vitro связывающие исследования с использованием рекомбинантных белков SNX-BAR на синтетических липосомы хипоссомы или гигантские unilamellar пузырьки (GUVs), чтобы выявить точный состав липидов, необходимых для привода мембраны ремоделирования, тем самым раскрывая их механизм действия. Однако, из-за технических проблем с системами двойного выражения, токсичности экспрессии белка SNX-BAR в бактериях, и плохой растворимости отдельных белков SNX-BAR, большинство исследований на сегодняшний день изучили Гомодидеры SNX-BAR, в том числе нефизиологические димы, которые образуются во время выражения в бактериях. Недавно мы оптимизировали протокол для преодоления основных недостатков типичной бактериальной системы экспрессии. Используя этот рабочий процесс, мы демонстрируем, как успешно выражать и очищать большое количество гетеродимеров SNX-BAR и как восстановить их на синтетических липосомах для связывания и трубообразного анализов.
Introduction
Мембранные органеллы, такие как плазменная мембрана, эндоплазмический ретикулум, аппарат Голги, лизосомы (дрожжи вакуола) и эндосомы, составляют эндомембранную систему эукариотической клетки. Большинств органеллы имеют способность связывать и обменивать материал с другими organelles через переносится везикулы. Как ячейка координирует упаковку и формирование везикуловых транспортных носителей в рамках эндомембранной системы, не очень понятно. Тем не менее, белки и липиды, которые составляют большую часть эндомембранной системы, как известно, происходят из интернализации эндоцитарных пузырьков из плазменной мембраны (PM). Эндосомя является основной органелью приема для этих пузырьков и состоит из нескольких взаимосвязанных наборов трубчатых органелл. Основная функция эндосомы заключается в содействии приобретению питательных веществ, регулировать оборот белка и липидов, защищать от патогенной инфекции, а также служить основным источником пополнения липидов для плазменной мембраны. Поскольку эндосома получает основную часть грузовых белков и липидов из плазменной мембраны, она действует как сортировочный отсек, изолируя грузы в трубчатые эндосомальные транспортные носители (ETC). Любые белки, не секвестрированные в ETCs, остаются деградированными через эндо-лисосомную систему. Дисрегуляция сортировки грузов в ETCs может привести к потере поглощения питательных веществ, текучесть белка или липидного гомеостаза, что приводит к многочисленным метаболическим, развития и неврологическим расстройствам1,2. Однако, несмотря на центральную роль ETCs в эндосоме, основной механизм того, как эндосома может выборочно координировать упаковку множества неоднородных грузов в трубчатые носители, неизвестен.
Сортировка nexin (SNX) семейство эволюционно сохраненный класс белков, которые были найдены, чтобы иметь решающее значение для многих реакций везикул транспорта в клетке3,4,5. Сортировка нэксинов набираются в эндосомную мембрану и помогают в захвате груза через характерный фаркс-гомологический (PX) домен, который связывает фосфатидинозиноситол-3-монофосфат (PtdIns(3)P), липид, обогащенный на эндосомной мембране. Млекопитающие кодируют тридцать три белка SNX, которые могут быть дополнительно разделены на несколько подсемейств, в зависимости от наличия других доменов1. Наиболее примечательно, что подсемейство SNX-BAR является крупнейшим подсемейством, состоящим из двенадцати человек, в то время как в подающих надежды дрожжах, Saccharomyces cerevisiae, подсемейство сводится всего до семи SNX-BARs. Белки SNX-BAR имеют как домен PX, так и домен Bin-Amphiphysin-Rvs (BAR), который вызывает липидные резервуары для связывания положительных мембран кривизны. Следовательно, семья SNX-BAR имеет естественное сродство к эндосому и может посредничать образование ETC через их мембранные способности ремоделирования. В пробирке, ремоделирование свойства SNX-BARs может быть вызвано добавлением очищенных SNX-BARs к синтетическим липосомам и последующее образование узких, покрытых трубами могут быть визуализированы с помощью электронной микроскопии. Используя эти методы, исследователи определили, что как концентрация олигомеризации и прочность сужения, как представляется, различаются среди семьи SNX-BAR предполагая, что они могли бы помочь как в формировании и ножницы ETCs.
SNX-BARs могут быть дополнительно классифицированы по их эксклюзивным свойствам димеризации. В пробирке связывания анализы и структурные исследования показали, что SNX-BAR белки могут образовывать только конкретные homodimers или гетеродимы. Таким образом, в принципе, каждый потенциальный SNX-BAR димер-олигомер может обеспечить трубчатый слой для грузоперевозок, а также, ограниченная олигомеризация других протомеров SNX-BAR, может также определять различные пути экспорта. Однако, из-за большого количества SNX-BARs и разнообразия в семейство SNX, одна сортировка nexin-один грузовой гипотеза весьма маловероятно. Вместо этого более вероятно скоординированное усилие с использованием множества факторов, таких как SNX-BARs, груз, липидная специфичность и другие зависимости. Аналогичным образом, недавние исследования дрожжей семьи SNX4 показали доказательства для дополнительной липидной специфичности, за PtdIns (3)P, чтобы потенцировать эндосомы транспортных перевозчиков6. В этом исследовании, SNX-BAR гомодимер MVP1-MVP1 был очищен от бактерий и родной heterodimers Snx4-Atg20 и Vps5-Vps17 были выражены и очищены в высокой урожайности от дрожжей, в то время как только Snx4-Atg20 было установлено, что предпочтительно связывать фосфатидилсериин (PS) и узкая форма. В то время как другие в этой области выявили важные свойства SNX-BARs с использованием рекомбинантно очищенных SNX-BAR homodimers от бактерий, токсичность, связанная с выражением SNX-BAR гетеродимеров в аналогичных системах, препятствовала их родной характеристике7,8,9,10. Поэтому, без надежной системы получения чисто рекомбинантно выраженных местных гетеродимеров, исследователи должны отойти от этих направлений исследования. На рисунке 1, мы представляем четыре части рабочего процесса до 1) построить штамм дрожжей overexpressing SNX-BAR гетеродимеров для тандема сродство очистки, 2) выразить и очистить родной SNX-BAR гетеродимеров, 3) подготовить unilamellar синтетические липосомы, и 4) создать липосомы трубуляции или осадок исследует, обеспечивая жизненно важный инструмент для исследователей, чтобы исследовать растущий каталог сортировки nexins найти в природе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Дрожжи Штамм Строительство
- Начните с TVY614 (pep4'::LEU2 prb1::hisG prc1':HIS3)11 в качестве родительского штамма. Этот штамм является недостаточным для вакуолярных протеаз, которые способствуют большинству деградации белка после клеточного лиза, и, следовательно, позволяет более чистой и эффективной очистки.
- Дизайн праймеров12 и интегрировать тандем сродство очистки (TAP) тег на C-термина Atg20 (SNX-BAR ORF 1) с использованием гомологичных рекомбинации. Используйте полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для подтверждения интеграции(рисунок 2).
- Выполните западный пятно клеточного lysate против тега TAP, чтобы подтвердить правильную интеграцию13.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем собирать 3 OD (1 OD - 1 х 107 ячеек) ячеек для проверки SDS-PAGE и западной помок. Обратите внимание, что интеграция тега TAP должна произойти до замены эндогенных промоутеров с промоутером GAL1, чтобы облегчить проверку тегов TAP через западный помарк. - Замените эндогенных Промоутеров Snx4 (SNX-BAR ORF1) и Atg20 (SNX-BAR ORF 2) с немаркированным промоутером GAL1 с помощью последовательной гомологичной рекомбинации и трансформации каждого отдельного ORF14.
- Использование фланговых грунтовок за пределами интеграционных сайтов для PCR подтверждают успешную интеграцию(рисунок 2). Это приведет к нулю фенотип целевых SNX-BARs при отсутствии галактоза в среде роста.
2. Дрожжи индукции и SNX-BAR Димер очистки
ПРИМЕЧАНИЕ: Дрожжевые клетки могут распространяться на стандартных YPD (дрожжевой экстракт, пептон, и 2% глюкозы) агар пластины, как изменения хромосомно интегрированы.
- Прививать большой мазок клеток в 50 мл стандартного YP (дрожжевого экстракта и пептона) среды с 2% рафинозы и 0,1% глюкозы в качестве источника углерода в колбе по крайней мере 4x объем культуры и расти в одночасье в 30 C шейкер, чтобы обеспечить надлежащее аэрации. Ожидать, что рост в этой среде будет медленнее по сравнению со стандартным YPD.
- На следующее утро используйте прекультуру 50 мл, чтобы привить в 1 л стандартной среды YP с 2% рафиноза и 0,1% глюкозы и расти в течение 4-5 ч в 30 кс шейкер.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем прекультуры, используемой для прививок 1 L культуры могут быть скорректированы в зависимости от OD600 из прекультуры. OD600 из 1 L культуры после прививки должно быть около 0,2, чтобы по крайней мере два удвоения во время 4-5 ч роста.- Используйте озадачиваемую колбу Fernbach для роста, чтобы обеспечить надлежащее аэрации, 2,8 л объем колбы достаточно. Меньше аэрации может привести к более медленному росту и меньше клеточных гранул при сборе урожая.
- Проверьте OD600, чтобы убедиться, что культура находится в фазе журнала (0,5-1) после 4-5 ч роста. В зависимости от роста штамма, внести коррективы в время роста, чтобы по крайней мере два удвоения. Добавьте к 2% галактозы и расти на ночь в 30 кс шейкер.
ПРИМЕЧАНИЕ: OD600 после ночного роста может варьироваться, но культура должна быть насыщена. Обратите внимание, что клетки не должны быть удалены из 0,1% глюкозы до добавления 2% галактоза для этого протокола роста. Мы рекомендуем собирать 3 OD неиндуцированных и индуцированных клеток на этом этапе для SDS-PAGE и западной подись для проверки(рисунок 3A,B, переулок 1-2). - Урожайные клетки центрифугированием при 4500 х г в течение 15 мин. Размахивая ротор ведро, который вмещает 1 L объем культуры могут быть использованы здесь.
- Перенесите дрожжевые гранулы в коническую трубку мощностью 50 мл; второй шаг центрифугации может быть выполнен по мере необходимости. Клетка гранулы, как правило, около 10-15 мл в объеме, как измеряется градации маркировки и могут быть использованы немедленно или храниться при -80 градусов по Цельсию.
- Resuspend гранулы в 15 мл очистки буфера (50 мм Tris pH 7,4, 300 мМ NaCl, 1,5 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотрейтол (DTT), протеазы ингибитор коктейль), чтобы сделать окончательный объем около 30 мл.
- Охладите гомогенизатор 4 градусов по Цельсию перед использованием и уравновесите его с буфером очистки. Лисы клетки с помощью механических клеток разрушитель или гомогенизатор. Загрузите образец в гомогенизатор и лису на уровне 20 000-25 000 пси на 2-3 раунда; обратите внимание, что, как клетки становятся лизинировать, больше вхоза давления требуется для поддержания 20000-25000 пси. Соберите клеточный лисат в конической трубке 50 мл на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если дополнительные образцы должны быть лисицированы, гомогенизатор должен быть тщательно очищен и уравновешжен перед загрузкой следующего образца. Храните все клеточные лисаты на льду. - Немедленно очистить лизат клетки на 35000 х г на 1 ч при 4 c. Аккуратно перенесите супернатант в новую трубку. Обратите внимание, что липиды от клеточного лиза будут плавать к вершине во время центрифугации и не повлияет на очищение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем экономить 0,5-1% лизата и гранул для образцов SDS-PAGE. Как правило, никаких серьезных различий не наблюдается, и дополнительная западная подавливость может быть сделано для подтверждения растворимости белка TAP(рисунок 4, переулки 1 и 2, соответственно). - Равновесие 300 зл и сефарозных бусин IgG с буфером очищения. Добавить в очищенный лизат клетки и инкубировать в течение 2 ч, вращаясь при 4 градусах Цельсия.
- Соберите бисер в 10 мл хроматографии колонки и позволяют несвязанных lysate течь через.
- Вымойте бусины с использованием 10 мл буфера для мытья (50 мм Tris pH 7.4, 300 mM NaCl, 1,5 мМ MgCl2, 1 мМ DTT), добавив 1 мл в то время, и позволяет ему течь через полностью.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем экономить 2% от шариков bound-IgG для образца SDS-PAGE. Как правило, мы наблюдаем четыре основные полосы; два белка SNX-BAR и IgG Тяжелые и Легкие Цепи(Рисунок 4, переулок 3). Мы рекомендуем экономить эквивалентные количества "eluate" и "IgG бусы после TEV", чтобы сравнить для эффективности расщепления TEV. - Собирайте бисер и перенесите их в микроцентрифугную трубку. Добавьте к 500 л общего объема со свежим буфером стирки и 2 qL 10 мг/мЛ TEV протеазы и инкубировать на ночь, вращаясь при 4 градусах Цельсия.
- На следующее утро, удалить супернатант полностью с помощью 27 G иглы и оценить чистоту белка на 10% полиакриламид SDS-PAGE(Рисунок 4 , переулок4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно мы получаем 500 л 0,5-1 мг/мл 95% чистого неосмысленности(рисунок 4, переулок 4). Дополнительная очистка с использованием calmodulin ресины также может быть сделано, однако мы обычно видим значительное снижение урожайности и рекомендуем остановиться здесь, если чистота составляет 90%. TEV не мешает липосомы связывания анализы, хотя TEV может быть дополнительно удаленс с помощью Ni-NTA агарозные бусы15. - Чтобы сконцентрироваться, перенесите образец на центробежный фильтр 0,5 мл с 10 KDa отсечения и центрифуги в соответствии с инструкциями производителя до 50 л или меньше. Количественно концентрированных белков с помощью брэдфордпрова анализ. Храните при 4 градусах Цельсия и используйте в течение одной недели.
3. Липосомпрепарат
- Приобретите коммерчески доступные липиды: фосфатидилсерин (PS), PI3P, эргостерол и фосфатидилхолин (ПК). При необходимости, resuspend в рекомендуемых растворителя, чтобы сделать акции липидов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Липиды переплетаются в метанол/хлороформную смесь в рекомендациях производителя. Убедитесь, что липидные запасы ясны и нагреваются до комнатной температуры перед использованием. Переплетные липиды могут храниться под аргоновым газом и герметиться с помощью восковой пленки (или эквивалента) при -20 градусов по Цельсию в течение 6-12 месяцев или до потери активности. - Рассчитайте объем, необходимый для каждого липидного бульона, чтобы создать смесь с желаемым липидным составом (см. таблицу 1). Предположим, в общей сложности 1 моль липидов в липидной смеси.
- Выполните этот шаг в химическом капоте дыма. Очистите стеклянные шприцы, составив полный объем шприца хлороформа и выбросив его в мусорный контейнер. Повторите еще два раза. При передаче хлороформа используйте только стеклянные шприцы или пипетки. При составлении хлороформа, потяните на пробку медленно, чтобы предотвратить введение пузырьков газа в шприц.
- Используйте стеклянные шприцы для передачи запасов липидов, как рассчитывается в чистой стеклянной культуры трубки, чтобы сделать окончательный липидной смеси 1% PI3P, 20% эргостерол, 30% PS, PC (Таблица 1). В зависимости от растворителей каждый липид вновь, смесь может стать облачно при добавлении каждого липида.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для изменения концентраций PS (0-30%), регулировать объемы соответственно и компенсировать с различной PC (таблица 1). - Тщательно высушите липидную смесь с помощью азотного газа, направленного на липидную смесь круговыми движениями, чтобы равномерно высушить липиды. Используйте низкий поток газа, чтобы держать липиды в нижней части стеклянной трубки во время процесса сушки. Оберните стеклянную трубку культуры с фольгой, оставляя отверстие нераскрытым, и дальнейшее обезвоживание в вакууме в течение 1 ч.
- Добавьте 400 qL связывающего буфера (50 мм Tris pH 7.4, 300 mM NaCl, 1 мМ MgCl2),чтобы полностью обезвоживать липиды, чтобы сделать окончательную концентрацию липосом 2,5 мм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная концентрация липосом может быть скорректирована путем добавления более или менее связывающего буфера. Например, при необходимости может быть добавлен 200 связывающий буфер мл для получения липосомного концентрации 5 мМ (см. ниже).- Resuspend липидов, встряхивая на средней скорости на вихре при комнатной температуре в течение 30 мин. Буфер должен появиться облачно, как липиды resuspended.
- Передача перепрословых липосом в микроцентрифугную трубку. С этого момента, пластиковые пипетки советы могут быть использованы в качестве липидов больше не resuspended в хлороформ. Обратите внимание, что липосома решение должно выглядеть облачно.
- Заморозить-оттепель липосомы семь-восемь раз, погружая микроцентрифугтрубки сначала в жидкий азот, а затем в 37 градусов по Цельсию водяной бане. Липосомософная смесь должна казаться полностью замороженной и твердой на глаз перед оттаиванием.
- Выполните шаги с участием хлороформа в химическом капоте дыма. Очистите два 1 мл стеклянных шприцев, составление и отбрасывание полных объемов шприца хлороформа, в три раза каждый, чтобы удалить любые остаточные липиды. Уравновешивать каждый стеклянный шприц с ультрачистой водой, сооруя два объема шприца, затем уравновешивают с связывающим буфером, составив два объема шприца.
- Соберите мини-экструдер в соответствии с рекомендациями производителя. Уравновесите одну мембрану 200 нм и две части фильтра поддерживает (см. Таблица материалов), погрузив каждый в связывающий буфер.
- Сэндвич мембраны между фильтром поддерживает и место в мини-экструдер. Чтобы уменьшить мертвый объем в собранном мини-экструдере и убедиться, что сборка герметичная, пройдите объем связывающего буфера, сопоставимый с объемом липосомной смеси через мини-экструдер с помощью стеклянных шприцев 1 мл.
- Используйте один из 1 мл стеклянных шприцев и составить липосому смесь. Инвертировать микроцентрифуг трубки для сбора последнего из липосомного смеси в трубке крышка для составления в стеклянный шприц.
- Экструдировать липосомы, проходя через мембрану 200 нм 19-21 раз. Соберите экструдированные липосомы в новой микроцентрифуговой трубке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Экструдированные липосомы должны выглядеть менее мутными, чем липосомы перед экструзией. Липосомы следует использовать в тот же день и хранить на льду. Последняя экструзия должна поместить липосомы в шприц, противоположный той, в которой она начиналась.
4. Липосомная связывание и трубация SNX-BAR
- Преклир очищенный белок при 100 000 х г в ультрацентрифуге в течение 20 мин при 4 градусах Цельсия до проведения экспериментов по переплету липосом и осадок. Удалить супернатант и перенести его в новую микроцентрифугую трубку; не беспокоить гранулы, если есть один.
- Для выполнения липосомного связывания и трубоизоляции инкубировать 4 ММ очищенных Snx4-Atg20 и 2,5 мМ липосом в общем объеме реакции 20 Л, изменяя объем добавленных липосом.
ПРИМЕЧАНИЕ: В том же эксперименте следует использовать тот же объем липосом. - Инкубировать реакцию при 30 градусах по Цельсию в течение 30 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы предлагаем максимально увеличить количество липосом 2,5 мм, добавленных к каждой реакции, используя не менее 10 липосом, чтобы обеспечить визуализацию во время осадка. Если при реакции 20 мл используется 10 мл липосом 2,5 мМ, то конечная концентрация липосом составит 1,25 мМ. Если очищенные белки разбавляются и требуется больший объем для белка 4 ММ, липиды могут быть повторно в 200 л во время шага регидратации, чтобы удвоить концентрацию липосом (см. Шаг 3.6); однако, это потребует знать концентрацию протеина до делать липосомы. -
Визуализируйте и количественно липосомного трубоуляции.
- Обработайте реакции связывания липосом немедленно для анализа электронной микроскопии. Пятно образцов на углеродное покрытие медной сетки сетки и отрицательное пятно с использованием 1% уранила ацетата(рисунок 5B)16.
- Анализ образцов на трансмиссионном электронном микроскопе (200 кВ).
- Используйте программное обеспечение для анализа изображений для измерения и количественной оценки диаметра тубулы. Для точной количественной оценки диаметра тубулы одной трубки, возьмите три измерения диаметра по длине трубки и среднего(рисунок 5B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для определения статистической значимости(рисунок 5E)использовался двусторонний анализ дисперсии. Уранил ацетат является как радиоактивным, так и токсичным. Для выполнения этого шага требуется надлежащая сертификация безопасности лаборатории.
-
Липосома связывания и осадка.
- Перенесите реакцию (20 кл., со ступени 4,3) в поликарбонатную центрифугу и используйте совместимый ротор, чтобы вращаться при 100 000 х г в ультрацентрифуге в течение 20 мин при 4 градусах Цельсия. Аккуратно удалите супернатант и перенесите на новую микроцентрифуговую трубку. Обратите внимание, что гранулы должны оставаться нетронутыми.
- Повторное удаление гранул в SDS-PAGE 40 зл и перенос на новую микроцентрифуговую трубку. Добавьте 20 зл буфера образца к супернатану. Нагрузка эквивалентное количество гранул и супернатант в 10% полиакриламид SDS-PAGE гель и выполнять Coomassie окрашивания визуализировать SNX-BARs связаны с липосомами (Рисунок 5A).
- Чтобы количественно определить количество комплекса SNX-BAR в фракции гранул, количественно увеличить интенсивность полосы с помощью денситометрии и количественно определить долю белков SNX-BAR в фракции гранул.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для определения статистической значимости(рисунок 5С)был использован двусторонний анализ дисперсии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол описывает метод для воспроизводимого и надежного производства эндогенных дрожжей SNX-BAR комплексов, которые могут быть использованы для вниз по течению мембраны ремоделирования анализы(рисунок 1). Конструкция дрожжевого штамма, используемого для очистки, использует эффективность гомологической рекомбинации в подающих надежды дрожжах, допуская модификации на геномных локусах целевых SNX-BARs (Рисунок 2). Эта конструкция имеет два преимущества, (i), так как выбор не требуется для поддержания модификаций, стандартный YP-среда может быть использована, что позволяет для роста к более высокой плотности клеток и, следовательно, более высокий уровень экспрессии целевых SNX-BARs будет ровным, оптимизируя производство гетеодимера комплекса. До добавления галактоза, целевые SNX-BARs будут проявлять нулевую фенотип и, таким образом, может привести к дефекту роста или другим известным дефектам, характерным для целевых SNX-BARs. Кроме того, рост на 2% рафиноза и 0,1% глюкозы медленнее, чем рост в 2% глюкозы. Таким образом, период роста до индукции галактоза может потребовать оптимизации для каждого конкретного штамма. Чтобы проверить правильное индукции экспрессии SNX-BAR, западный пятно против тега TAP, вероятно, требуется, поскольку уровень белка SNX-BARs не может быть обнаружен через Coomassie пятно (Рисунок 3). Однако, поскольку только один член комплекса SNX-BAR имеет тег, выражение немаркированного белка (ы) не может быть подтверждено, если все шаги очистки не будут завершены. После очистки SNX-BAR неортодокции, полосы двух SNX-BARs должны казаться в 1:1 стохиометрическое соотношение и не должно быть практически никаких загрязняющих полос(Рисунок 4, полоса 4). Если есть дополнительные загрязняющие полосы, и начиная штамм дрожжей уже протеазы дефицита, больше ингибитора протеазы могут быть добавлены во время лиза клетки. Кроме того, может быть выполнен второй шаг очистки с использованием сутодулина.
При проведении мембранной ремоделирования анализов(рисунок 5),такой же препарат липосомы и очищенных белков должен быть использован в том же эксперименте. Если для достижения желаемой концентрации требуется несколько очистных препаратов белка, объедините весь очищенный до проведения эксперимента белок. Липосомы должны быть сделаны и использованы в течение одного дня(таблица 1). При проведении анализов липосом осадок, очень важно, чтобы очищенный белок предварительно очищен с использованием тех же условий осаждения 100000 х г в течение 20 минут непосредственно перед инкубации с липосомы, как осажденный белок может skew результаты. Кроме того, липосомовые гранулы должны оставаться нетронутыми после осадка.
Рисунок 1: SNX-BAR связывание диаграммы потока. Короче говоря, в шагах 1-2, мы инженер GAL промоутеров в два SNX-BAR геномных локусов, заменив каждый из эндогенных промоутеров и инженер C-терминал TAP тег в один из двух SNX-BAR локусов. Далее, в шагах 3-7, мы индуцируем клетки с галактозой и очищаем гетеродоваров SNX-BAR к однородности. В шагах 8-12, мы вычисляем и готовим нибеллярные липосомы. Наконец, мы можем объединить гетеродимеров SNX-BAR с униламеллярными липосомы и выполнить два анализа; Шаг 14a-16a включает мембранную трубу и 14b-16a включать осадочных проверки. Более подробная информация просмотрите текст. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Стратегия интеграции SNX-BAR. Два локусов SNX-BAR были предназначены для выражения GAL с использованием гомологийской рекомбинации. SNX-BAR ORF1 (Atg20) был дополнительно ориентирован на выражение тега C-терминала TAP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Проверка индукции галактоза. (A-B) Для того, чтобы проверить GAL индукции Atg20-TAP, мы рекомендуем SDS-PAGE и западной подевой анализ клеточных экстрактов, индуцированных с 2% галактоза (A, B, переулок 2) и неиндуцированных (A, B, переулок 1). (C) Западная мембрана пятно также раздели и исследовали с анти-pgk1 для контроля нагрузки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Пример очищения гетеродолистов Atg20-Snx4. Дрожжевые клетки, разработанные для выражения Atg20-TAP и Snx4, управляемые промоутерами галактоза, были индуцированы с 2% галактозой, лисица и связаны с помощью сефарозы IgG, и eluted с tEV protease. Образцы с каждого шага очистки отображается в 10% SDS-PAGE. Переулок 1: индуцированный супернатант из лисата. Переулок 2: индуцированные гранулы из лисата. Лейн 3: образец связанных белков в сефароз IgG. Лейн 4: TEV eluate чистого Atg20-Snx4 гетеродимеров от IgG сефароз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Представитель липосомного связывания и трубоизоляции. (A) SNX-BAR гетеродимы, Atg20-Snx4 и Vps5-Vps17 из дрожжей, были выражены, очищены, и связаны с синтетическими липосомы, как описано в тексте. Обратите внимание, что MVP1 формирует омонимы и выражается в бактериях. (B) EM микрографы Snx4-Atg20 липософа труба анализ и трубки измерений (всет). (C) SNX-BAR связывания с различными липосомонными композициями была количественно денситометрии. График указывает на среднее и стандартное погрешность среднего значения. Злт; 0,002. (D) диаметры тубулов были количественно оценены и на графике, как описано в тексте. Шкала бар 200 нм. Бары ошибок представляют собой двусторонний анализ дисперсии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Типичная липосомная композиция | DOPC | ДОПЫ | Эргостерол | PI3P-C16 |
| Мвт | 786.1 | 810.0 | 396.7 | 957.0 |
| мол фракции | 49% | 30% | 20% | 1% |
| Фондовый mM | 32.0 | 12.0 | 25.0 | 1.0 |
| Масса (мг) | 385.2 | 243.0 | 79.3 | 9.6 |
| Концентрация (мг/мл) | 25.2 | 9.7 | 9.9 | 1.0 |
| Объем до RXN (мл) | 15.3 | 25.0 | 8.0 | 10.0 |
Таблица 1: Липосом рецепт. Синтетические липосомы были подготовлены с использованием комбинации DOPC, DOPS, эргостерола и PI3P. Мы вычисляем конечную концентрацию до 1 моль липидов. Наш стандартный состав включает 20% эргостерола, 1% PI3P, DOPS (до 30%), а также различные количества DOPC. Таблица включает в себя типичную формулировку для 400 qL 30% DOPS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы демонстрируем оптимизированный рабочий процесс для очистки димеров SNX-BAR в дрожжах и два анализа для оценки их биофизических свойств на синтетических липосомах. Основным преимуществом перед типичным рекомбинантным выражением белка в Escherichia coli или других системах является способность равномерно выражать белки SNX-BAR у местного хозяина, избегая тем самым проблем с токсичностью и неразрешимости при очистке SNX-BARs в других системах. Примечательно также, что наша система не требует молекулярного клонирования или укрытия нескольких векторов экспрессии17. Наши двойные штаммы дрожжей SNX-BAR управляются хромосомными промоутерами галактозы, обеспечивая тем самым даже экспрессию при индукции. Важным соображением является то, что в отсутствие галактоза, не будет практически никакого выражения целевых SNX-BARs, что приводит к нулю фенотипа. Кроме того, мы находим, что SNX-BARs, как правило, терпеть C-терминал метки хорошо, что позволяет нам добавить тег TAP на C-конечный. Однако, в зависимости от пометки белка, тег N-терминала TAP также может быть использован12. Кроме того, поскольку SNX-BARs образуют только димеры 1:1, для целей очистки требуется только один белок. Тем не менее, некоторые SNX-BARs, которые обычно образуют гетеродимеры в клетке было показано, образуют homodimers под нефизиологические концентрации7. Поэтому крайне важно, чтобы при очищении гетеродимера, стойхиометрическое соотношение двух SNX-BARs должно быть 1:1, что может быть проверено путем запуска аликот очищенного комплекса на гель SDS-PAGE и выполнения Coomassie окрашивания. После разработки, эти штаммы дрожжей могут быть сохранены в бессрочном виде как 15% (v/v) глицерол запасов при -80 градусов по Цельсию и / или дополнительно изменены для запроса дополнительных связывающих партнеров. Наш рабочий процесс обычно занимает 2-3 недели для деформации строительства и 3-4 дня для выражения и очистки и 1 день для липосомсвязных анализов. Мы считаем, что этот рабочий процесс может помочь исследователям в дальнейшем понять липидную специфичность белков SNX-BAR с использованием местных белков BAR на синтетических липосомах или гигантских неламеллярных пузырьках (ГУВ) и выявить точный состав липидов, необходимых для ремоделирования мембраны, тем самым раскрывая их механизм действия.
Критические шаги
Во время наших первых попыток очистки гетеродимеров SNX-BAR от непротежей ных клеток, мы часто находили снижение урожайности и продукты деградации. Таким образом, во время первоначальных шагов строительства деформации, мы считаем, что очень важно начать с родительского штамма дрожжей, который является недостаточным для одного или нескольких основных vacuolar proteinases. В частности, мы обнаружили дрожжевой штамм TVY614, который истощается для pep4, prb1и prc1,чтобы быть наиболее оптимальным. Используя штамм TVY614, мы регулярно получаем йgt;90% чистый Snx4-Atg20 гетеродимеры(Рисунок 4 и Рисунок 5A). Тем не менее, необходимость для всех трех протеиназах, которые будут абляции может быть SNX-BAR комбинации конкретных. Например, гетеродники Vps5-Vps17 были успешно очищены в не-протеаза дефицит штаммов10, и когда мы включили добавление PEP4 абляции, мы наблюдаем скромное увеличение урожайности и чистоты (Рисунок 5A). Таким образом, в зависимости от приложений пользователя вниз по течению и необходимости в чистоте или выбираемых маркеров, может быть гибкость при проектировании выражения штаммов.
Также важен порядок построения генов. Мы рекомендуем C-terminally TAP пометки SNX-BAR ORF 1 во-первых, для того, чтобы подтвердить выражение западной помок без необходимости галактоза индукции (Рисунок 1). Во время индукции галактозы, очень важно, чтобы предварительно состояние клеток на ночь в 2% рафинозы и 0,1% глюкозы. Неспособность предварительно госкондиционерки приводит к чрезвычайно медленному росту или гибели клеток. Тем не менее, также важно для клеток, чтобы истощать оставшуюся глюкозу во время ночного роста, в противном случае галактоза индукции может быть негативное влияние. Также рекомендуется проверить несколько изолятов западным пятном, чтобы оценить однородность экспрессии белков SNX-BAR с тегами TAP. Обычно мы просеиваем 2-3 изоляты и выбираем наиболее надежно выражающего кандидата.
Модификация, альтернативные подходы и будущие приложения
В шаге 2.8, тандем сродство очистки (TAP), как правило, требует двухступенчатой очистки сродства с использованием IgG и calmodulin бусы после TEV декольте12. Тем не менее, в этом протоколе, мы elute SNX-BAR димы tEV протеазы с очень высокой урожайностью и чистотой. Мы находим последующее очищение сродства с использованием бусин сумодулина производит непоследовательные и пониженные урожаи, поэтому мы рекомендуем остановиться после расщепления TEV. EEV eluate, содержащий белки SNX-BAR и его (6)-тегами TEV протеазы могут быть дополнительно очищены Ni-NTA агарозные бусы. Тем не менее, мы также находим этот шаг может уменьшить общую урожайность белка SNX-BAR и является ненужным, так как протеазы TEV не вмешивается в переплет липосом или трубуляции анализов. Поэтому, если очищенные SNX-BAБудут будут использоваться для любого другого приложения, мы рекомендуем пользователю оценить влияние протеease TEV в их анализах.
До сих пор мы успешно использовали этот протокол и описанные модификации для очищения гетеросом Snx4-Atg20 и Vps5-Vps17 в дрожжах и успешно оценили их липидную специфичность на синтетических липосомах. Тем не менее, мы считаем, что протокол может быть успешно адаптирован к любому из SNX-BARs в дрожжах. Также можно использовать систему для производства рекомбинантных белков SNX-BAR из любых других организмов. Тем не менее, это потребует дополнительного шага деформации строительства для интеграции экзогенного гена локуса в геном дрожжей. Мы также считаем, что система может быть расширена для очистки многомерных комплексов, включая грузовые белки. Таким образом, мы считаем, что наша система выражения может выйти за рамки понимания липидов указывает на SNX-BARs. Будущие приложения позволят исследователям воссоздать целые комплексы захвата грузов на липосомах, чтобы понять, как полные сборки могут влиять на ремоделирование мембран.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Исследования, о которых сообщается в этой публикации, были поддержаны Национальным институтом общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения под номером премии GM060221 и частично Национальным институтом общих медицинских наук Национальных институтов здоровья под номером премии T32GM007223. Р.К. была частично поддержана Программой грантов на научные гранты факультета КООН и Шарлотта.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm PC Membranes | Avanti | 610006 | |
| 10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad) | Bio-Rad | 731-1550 | |
| 27 G needle | BD Biosciences | 301629 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff | Amicon | UFC501024 | |
| Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer | Avestin | EF-C3 | |
| BCA assay | Pierce | 23225 | |
| Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
| DOPC | Avanti | 850375 | |
| DOPS | Avanti | 840035 | |
| Ergosterol (Sigma) | Sigma | 47130-U | |
| Extruder Set with Block 0.2 μL/1 mL | Avanti | 610000 | |
| FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV) | |||
| Glass culture tubes | VWR | 47729-570 | |
| IgG sepharose beads (GE Healthcare) | GE Healthcare | 17-0969-01 | |
| Microlter glass syringes | Hamilton | 7637-01 | |
| New Brunswick Excella E25 | Eppendorf | M1353-0000 | or equivalent shaking 30 °C |
| Ni-NTA Magnetic Agarose Beads | Pierce | 78605 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-076 | |
| PI3P | Echelon | P-3016 | or Echelon equivalent |
| Polycarbonate bottle assembly | Beckman Coulter | 355622 | |
| TLA-100 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
| Type 45 Ti Rotor | Beckman Coulter | ||
| Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve | VWR | 75871-436 | |
| Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1) | A&J Vacuum | PN07050 | |
| Vortex with foam holder | VWR | 10153-838 | |
| VWR KIT MICROTUBE | VWR | 12620-880 |
References
- Teasdale, R. D., Collins, B. M. Insights into the PX (phox-homology) domain and SNX (sorting nexin) protein families: structures, functions and roles in disease. The Biochemical Journal. 441 (1), 39-59 (2012).
- Zhang, H., et al. The Retromer Complex and Sorting Nexins in Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 79 (2018).
- Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harbor perspectives in Biology. 6 (2), (2014).
- Chi, R. J., Harrison, M. S., Burd, C. G. Biogenesis of endosome-derived transport carriers. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (18), 3441-3455 (2015).
- Wang, J., et al. Endosomal receptor trafficking: Retromer and beyond. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (8), 578-590 (2018).
- Ma, M., et al. Lipid trafficking by yeast Snx4 family SNX-BAR proteins promotes autophagy and vacuole membrane fusion. Molecular Biology of the Cell. , (2018).
- van Weering, J. R., et al. Molecular basis for SNX-BAR-mediated assembly of distinct endosomal sorting tubules. The EMBO Journal. 31 (23), 4466-4480 (2012).
- Chi, R. J., et al. Fission of SNX-BAR-coated endosomal retrograde transport carriers is promoted by the dynamin-related protein Vps1. The Journal of Cell Biology. 204 (5), 793-806 (2014).
- Purushothaman, L. K., Arlt, H., Kuhlee, A., Raunser, S., Ungermann, C. Retromer-driven membrane tubulation separates endosomal recycling from Rab7/Ypt7-dependent fusion. Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 783-791 (2017).
- Purushothaman, L. K., Ungermann, C. Cargo induces retromer-mediated membrane remodeling on membranes. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2709-2719 (2018).
- Wurmser, A. E., Emr, S. D. Phosphoinositide signaling and turnover: PtdIns(3)P, a regulator of membrane traffic, is transported to the vacuole and degraded by a process that requires lumenal vacuolar hydrolase activities. The EMBO journal. 17 (17), 4930-4942 (1998).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
- Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
- Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods in Molecular Biology. 498, 297-307 (2009).
- Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. Journal of Lipid Research. 52 (1), 175-184 (2011).
- Yong, X., et al. Expression and purification of the SNX1/SNX6 complex. Protein Expression and Purification. 151, 93-98 (2018).
