Expresión, purificación y encuadernación liposoma de los heterodímeros SNX-BAR de levadura en ciernes
Summary
Aquí, presentamos un flujo de trabajo para la expresión, purificación y unión liposoma de heterodímeros SNX-BAR en levadura.
Abstract
Las proteínas SNX-BAR son una clase evolutivamente conservada de proteínas de remodelación de membranas que desempeñan un papel clave en la clasificación y el tráfico de proteínas y lípidos durante la endotosis, la clasificación dentro del sistema endosomal y la autofagia. La función proteica central de SNX-BAR es la capacidad de formar homodímeros o heterodímeros que unen membranas utilizando dominios altamente conservados de phox-homología (PX) y BAR (Bin/Amphiphysin/Rvs). Además, el oligomerización de los dimers SNX-BAR en las membranas puede resultar en la formación de túbulos de membrana y vesículas y se cree que esta actividad refleja sus funciones como proteínas de capa para los portadores de transporte derivados del endosoma. Los investigadores han utilizado durante mucho tiempo estudios de unión in vitro utilizando proteínas SNX-BAR recombinantes en liposomas sintéticos o vesículas unilameláres gigantes (GUVs) para revelar la composición precisa de los lípidos necesarios para impulsar la remodelación de la membrana, revelando así su mecanismo de acción. Sin embargo, debido a los desafíos técnicos con los sistemas de doble expresión, la toxicidad de la expresión de proteínaSNX-BAR en bacterias y la baja solubilidad de las proteínas SNX-BAR individuales, la mayoría de los estudios realizados hasta la fecha han examinado los homodímeros SNX-BAR, incluidos los dimers no fisiológicos que se forman durante la expresión en bacterias. Recientemente, hemos optimizado un protocolo para superar las principales deficiencias de un sistema de expresión bacteriana típica. Usando este flujo de trabajo, demostramos cómo expresar y purificar con éxito grandes cantidades de heterodímeros SNX-BAR y cómo reconstituirlos en liposomas sintéticos para ensayos de unión y tublación.
Introduction
Los orgánulos ligados a la membrana como la membrana plasmática, el retículo endoplasmático, el aparato Golgi, el lisosoma (vacuole de levadura) y el endosoma comprenden el sistema endomembrana de la célula eucariota. La mayoría de los orgánulos tienen la capacidad de comunicarse e intercambiar material con otros orgánulos a través de portadores de transporte vesícula. No se entiende bien cómo la célula coordina el envasado y la formación de portadores de transporte de vesículas dentro del sistema de endomembrana. Sin embargo, se sabe que las proteínas y lípidos que constituyen gran parte del sistema de endomembrana se originan a partir de vesículas endoccíticas internalizadoras de la membrana plasmática (PM). El endosoma es el principal orgánulo aceptador para estas vesículas y se compone de múltiples conjuntos interconectados de orgánulos tubulares. La función principal del endosoma es facilitar la adquisición de nutrientes, regular la rotación de proteínas y lípidos, proteger de la infección de patógenos y servir como la principal fuente de reposición de lípidos para la membrana plasmática. Como el endosoma recibe la mayor parte de proteínas de carga y lípidos de la membrana plasmática, actúa como un compartimento de clasificación mediante el aíslamiento de cargas en los transportadores endosómicos tubulares (ETC). Cualquier proteína que no se secuestre en los ETCs se deja degradar a través del sistema endo-lisosomal. La desregulación de la clasificación de carga en ETCs puede conducir a la pérdida de la sutoma de nutrientes, rotación de proteínas o homeostasis lipídica, lo que resulta en numerosos trastornos metabólicos, de desarrollo y neurológicos1,2. Sin embargo, a pesar del papel central de los CTE en el endosoma, no se conoce el mecanismo subyacente de cómo el endosoma puede coordinar selectivamente el empaquetado de una multitud de cargas heterogéneas en portadores tubulares.
La familia de nexina de clasificación (SNX) es una clase evolutivamente conservada de proteínas que se han encontrado críticas para muchas reacciones de transporte vesícula en la celda3,4,5. Los nexinos de clasificación se reclutan para la membrana endosoma y ayudan en la captura de carga a través de su característico dominio de la homología phox (PX), que une el fosfatidilinositol-3-monofosfato (PtdIns(3)P), un lípido enriquecido en la membrana endosoma. Los mamíferos codifican treinta y tres proteínas SNX, que se pueden dividir en múltiples subfamilias, según la presencia de otros dominios1. Más notablemente, la subfamilia SNX-BAR es la subfamilia más grande que consta de doce en humanos, mientras que en levadura en ciernes, Saccharomyces cerevisiae, la subfamilia se reduce a sólo siete SNX-BARs. Las proteínas SNX-BAR tienen un dominio PX y un dominio Bin-Amphiphysin-Rvs (BAR) que activa los reservorios lipídis para unir curvaturas positivas. En consecuencia, la familia SNX-BAR tiene una afinidad natural por el endosoma y puede mediar la formación de ETC a través de sus capacidades de remodelación de membrana. In vitro, las propiedades de remodelación de sNX-BARs pueden ser inducidas por la adición de SNX-BARpurificados a liposomas sintéticos y la posterior formación de túbulos estrechos y recubiertos se puede visualizar mediante microscopía electrónica. Utilizando estos métodos, los investigadores han determinado que tanto la concentración de oligomerización como la fuerza de constricción parecen variar entre la familia SNX-BAR, lo que sugiere que podrían ayudar tanto en la formación como en la cissión de los CTE.
Los SNX-BARs se pueden clasificar aún más por sus propiedades exclusivas de dimerización. Los ensayos de unión in vitro y los estudios estructurales han demostrado que las proteínas SNX-BAR sólo pueden formar homodímeros o heterodímeros específicos. Por lo tanto, en principio, cada potencial dimer-oligomero SNX-BAR podría proporcionar una capa de túbulo para una vía de tráfico específica de carga y, del mismo modo, la oligomerización restringida de los otros protomeros SNX-BAR, también puede definir distintas vías de exportación. Sin embargo, debido al gran número de SNX-BARs y diversidad dentro de la familia SNX, una hipótesis de carga nexin-one de clasificación es altamente improbable. En su lugar, es más probable un esfuerzo coordinado utilizando una multitud de factores como SNX-BARs, carga, especificidad lipídica y otras dependencias. Asimismo, estudios recientes de la familia de levaduras SNX4 revelaron evidencia de especificidad lipídica adicional, más allá de PtdIns(3)P, para potenciar losportadoresde transporte endosoma6. En este estudio, el homodimer SNX-BAR Mvp1-Mvp1 fue purificado a partir de bacterias y heterodímeros nativos Snx4-Atg20 y Vps5-Vps17 fueron expresados y purificados en alto rendimiento de la levadura, mientras que sólo Snx4-Atg20 se encontró para unir preferentemente fosfatidilserina (PS) y formar estructuras estrechas tipo tubo en estudios de unión liposoma6. Mientras que otros en el campo han revelado importantes propiedades de los SNX-BARs utilizando homodímeros SNX-BAR purificados recombinantemente de bacterias, toxicidad asociada con la expresión de heterodímeros SNX-BAR en sistemas similares han obstaculizado su caracterización nativa7,8,9,10. Por lo tanto, sin un sistema confiable para obtener heterodímeros nativos expresados recombinantemente puros, los investigadores deben renunciar a estas líneas de investigación. En la Figura 1, presentamos un flujo de trabajo de cuatro partes para 1) construir una cepa de levadura sobreexpresando heterodímeros SNX-BAR para purificación de afinidad en tándem, 2) expresar y purificar heterodímeros nativos SNX-BAR, 3) preparar liposomas sintéticos unilamellares, y 4) establecer un ensayo de tubulación liposoma o sedimentaciones, proporcionando una herramienta vital para que los investigadores investiguen el creciente catálogo de nexinos de clasificación encontrados en la naturaleza.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, demostramos un flujo de trabajo optimizado para purificar dimers SNX-BAR en levadura y dos ensayos para evaluar sus propiedades biofísicas en liposomas sintéticos. La principal ventaja sobre la expresión típica de proteínas recombinantes en Escherichia coli u otros sistemas es la capacidad de expresar uniformemente proteínas SNX-BAR en un huésped nativo, evitando así los problemas de toxicidad e insolubilidad encontrados en la purificación de SNX-BARs en otros sistemas. También es notable que nu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio GM060221 y en parte por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales salud bajo el número de premio T32GM007223. R.C. fue apoyado en parte por el Programa de Becas de Investigación de la Facultad de la UNC-Charlotte.
Materials
| 0.2 micrometer PC Membranes | Avanti | 610006 | |
| 10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad) | Bio-Rad | 731-1550 | |
| 27 Gauge needle | BD Biosciences | 301629 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff | Amicon | UFC501024 | |
| Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer | Avestin | EF-C3 | |
| BCA assay | Pierce | 23225 | |
| Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
| DOPC | Avanti | 850375 | |
| DOPS | Avanti | 840035 | |
| ergosterol (Sigma) | Sigma | 47130-U | |
| Extruder Set with Block 0.2 microlter/1mL | Avanti | 610000 | |
| FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV) | |||
| Glass culture tubes | VWR | 47729-570 | |
| IgG sepharose beads (GE Healthcare) | GE Healthcare | 17-0969-01 | |
| Microlter glass syringes | Hamilton | 7637-01 | |
| New Brunswick Excella E25 | Eppendorf | M1353-0000 | or equivalent shaking 30 C |
| Ni-NTA Magnetic Agarose Beads | Pierce | 78605 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-076 | |
| PI3P | Echelon | P-3016 | or Echelon equivalent |
| Polycarbonate bottle assembly | Beckman Coulter | 355622 | |
| TLA-100 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
| Type 45 Ti Rotor | Beckman Coulter | ||
| Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve | VWR | 75871-436 | |
| Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1) | A&J Vacuum | PN07050 | |
| Vortex with foam holder | VWR | 10153-838 | |
| VWR KIT MICROTUBE | VWR | 12620-880 | |
References
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