Fremstilling af mitokondrier fra æggestokkene Cancer væv og kontrol ovarie væv til kvantitativ proteomics analyse
Summary
Denne artikel præsenterer en protokol med differentialhastighed centrifugering i kombination med tæthed gradient centrifugering at adskille mitokondrier fra humane æggestokkene Cancer væv og kontrol ovarie væv til kvantitativ proteomics analyse, resulterer i en høj kvalitet mitokondrie prøve og høj gennemløb og høj reproducerbarhed kvantitativ proteomics analyse af en menneskelig ovariecancer mitokondrie proteome.
Abstract
Kræft i æggestokkene er en almindelig gynækolog cancer med høj dødelighed, men uklar molekyl mekanisme. De fleste kræft i æggestokkene er diagnosticeret i den avancerede fase, som alvorligt hæmmer terapi. Mitokondrie ændringer er et kendetegn for humane ovariecancer, og mitokondrier er centrene for energimetabolisme, celle signalering og oxidativ stress. Dybtgående indsigt i de ændringer af mitokondrie proteom i æggestokkene kræft sammenlignet med kontrol æggestokkene væv vil gavne dybtgående forståelse af de molekylære mekanismer af kræft i æggestokkene, og opdagelsen af effektive og pålidelige biomarkører og terapeutiske mål. En effektiv mitokondrie præparationsmetode kombineret med et isobarisk tag til relativ og absolut kvantificering (iTRAQ) kvantitative proteomics er præsenteret her for at analysere humane ovariecancer og kontrol mitokondrie proteomer, herunder centrifugeringshastighed, tæthed gradient centrifugering, kvalitetsvurdering af mitokondrie prøver, protein fordøjelse med trypsin, iTRAQ mærkning, stærk kation udveksling fraktionering (SCX), væskekromatografi (LC), tandem massespektrometri (MS/ MS), database analyse, og kvantitativ analyse af mitokondrie proteiner. Mange proteiner er blevet identificeret med succes for at maksimere dækningen af den humane ovariecancer mitokondrie proteom og for at opnå den differentielt udtrykte mitokondrie protein profil i humane ovariekræft.
Introduction
Kræft i æggestokkene er en almindelig gynækolog cancer med høj dødelighed, men uklar molekyl mekanisme1,2. De fleste af æggestokkene kræft er diagnosticeret i den avancerede fase, som alvorligt hæmmer terapi. Mitokondrie ændringer er et kendetegn for humane ovariecancer, og mitokondrier er centrene for energimetabolisme, celle signalering og oxidativ stress3,4,5,6,7. Dybtgående indsigt i de ændringer af mitokondrie proteom i æggestokkene kræft sammenlignet med kontrol æggestokkene væv vil gavne dybtgående forståelse af de molekylære mekanismer af kræft i æggestokkene, og opdagelsen af effektive og pålidelige biomarkører og terapeutiske mål. Mitokondrie metabolisme er blevet foreslået og anerkendt som et mål for kræftbehandling, og antimitokondriel terapi kan i sidste ende være meget gavnligt for at forhindre gentagelse og metastase af kræft8. Individuelle metaboliske profilering er også allerede praktiseres som et nyttigt redskab til kræft stratificering og forudsigende strategier9,10.
Det langsigtede mål med denne forskning er at udvikle og anvende en kvantitativ mitokondriel proteomics metode til at studere kræft i æggestokkene for afklaring af mitokondrie proteom ændringer mellem ovariecancer og kontrol æggestokkene væv, og deres molekylære netværk ændringer fra en systematisk multi-omics vinkel11,12, hvilket vil resultere i opdagelsen af mitokondrier-målrettede molekylære biomarkører13 for afklaring af de molekylære mekanismer af kræft i æggestokkene, forudsigelse og personlig behandling af kræftpatienter i æggestokkene. Isobariske Tags til relativ og absolut kvantificering (itraq) mærkning3,4 er en effektiv metode til at kvantificere mitokondrie protein ændringer. Forberedelse af høj kvalitet mitokondrie prøver fra Human ovariecancer og kontrol æggestokkene væv er forudsætningen for iTRAQ kvantitativ analyse af mitokondrie proteomer3. Mitokondrie forberedelse kombineret med itraq kvantitative proteomics er med held blevet anvendt i langsigtede forskningsprogrammer om den humane ovariecancer mitokondrie proteom, herunder etablering af mitokondrie proteom referencekort3, analyse af differentielt udtrykte mitokondrie profiler4,14 og post-translationelle modifikationer, herunder fosforylering, som allerede har resulteret i opdagelsen af vigtige signalering pathway netværk ændringer i humane æggestokkene kræft5, herunder ændringer i energimetabolisme4, lipid metabolisme, og mitophagy pathway-systemer3.
Tidligere undersøgelser har fundet, at differentialhastighed centrifugering i kombination med tæthed gradient centrifugering er en effektiv metode til at isolere og rense mitokondrier fra humane ovariecancer og kontrol æggestokkene væv3,4,5,14. ITRAQ-mærkningen kombineret med stærk kation udveksling (SCX)-Liquid kromatografi (LC)-tandem massespektrometri (MS/MS) er den vigtigste teknik til at detektere, identificere og kvantificere proteinerne fra de forberedte mitokondrie prøver.
Her beskrives detaljerede protokoller for mitokondrie præparat kombineret med iTRAQ kvantitative proteomics. Disse er blevet anvendt med succes i analysen af humane æggestokkene Cancer væv mitokondrie proteomer. Protokollerne omfatter forberedelse af prøver, differentialhastighed centrifugering, tæthed gradient centrifugering, kvalitetsvurdering af mitokondrie prøver, protein fordøjelse med trypsin, iTRAQ mærkning, SCX fraktionering, LC, MS/MS, database søgning, og kvantitativ analyse af mitokondrie proteiner. Desuden er denne protokol let oversætter til at analysere andre humane væv mitokondrie proteomer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mitokondrie ændringer er et kendetegn for kræft i æggestokkene. Forberedelse af høj kvalitet mitokondrie prøver fra humane ovariecancer og kontrol væv for store kvantitative proteomics gavne den dybtgående forståelse af mitokondrie funktion i æggestokkene Cancer patogenese og mitokondrie molekylære netværk ændringer, og hjælpe med at præcisere sin molekylære mekanisme til efterfølgende opdagelse af Target Therapy og effektive biomarkører baseret på mitokondrier4,<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Hunan Provincial hundred talent plan (til X.Z.), Xiangya Hospital midler til talent Introduktion (til XZ), National Natural Science Foundation i Kina (Grant No. 81572278 og 81272798 til XZ), tilskuddene fra Kina “863” plan Projekt (Grant No. 2014AA020610-1 til XZ) og Hunan Provincial Natural Science Foundation of China (Grant No. 14JJ7008 til XZ). X.Z. udtænkt konceptet for det nuværende manuskript, opnåede itraq kvantitative proteomics data af mitokondrier prøver, skrev og revideret manuskriptet, koordinerede det relevante arbejde, og var ansvarlig for den finansielle støtte og tilsvarende Arbejde. H.L. tilberedte mitokondrier prøver. S.Q. deltog i delvis arbejde. X. H. Z deltog i skriftligt og redigeret engelsk sprog. N.L. analyseret iTRAQ proteomics data. Alle forfattere godkendte det endelige manuskript.
Materials
| BCA protein assay kit | Vazyme | E112 | BCA protein assay kit is a special 3-component version of our popular BCA reagents, optimized to measure (A562nm) total protein concentration of dilute protein solutions (0.5 to 20 micrograms/ml). |
| Bovine serum albumin (BSA) | Solarbio | A8020-5G | Heat shock fraction, Australia origin, protease free, low fatty acid, low IgG, pH 7, ≥98% |
| Centrifuge | XiangYi | TDZ4–WS | |
| CHAPS | Sigma | C9426-5G | BioReagent, suitable for electrophoresis, ≥98% (HPLC) (Sigma-Aldrich) |
| Diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | 798681-100G | Anhydrous, free-flowing, Redi-Dri, ≥98% |
| DTT | Sigma | 10197777001 | 1,4-Dithiothreitol |
| Easy nLC | Proxeon Biosystems (now Thermo Fisher Scientific) | ||
| Ethylen glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E0396-10G | BioXtra, ≥97 .0% |
| Homogenizer | SilentShake | HYQ-3110 | |
| iTRAQ reagent kit | Applied Biosystems | Applied Biosystems iTRAQ Reagents–Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A | |
| Low-temperature super-speed centrifuger | Eppendorf | 5424R | |
| Mannitol | Macklin | M813424-100G | Mannitol is a polyol (polyhydric alcohol) produced from hydrogenation from fructose that functions as a sweetener, humectant, and bulking agent. It has low hygroscopicity and poor oil solvency. |
| MASCOT search engine | Matrix Science, London, UK; version 2.2 | ||
| Nagarse | Solarbio | P9090 | |
| N-hydroxysuccinimide (SDT) | Sigma | 56480-25G | Purum, ≥97.0% (T) |
| Nycodenz | Alere/Axis-Shield | 1002424-1 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) protease inhibitor | Solarbio | P0100-1ML | PMSF is a protease inhibitor that reacts with serine residues to inhibit trypsin, chymotrypsin, thrombin, and papain. |
| Potassium chloride | Macklin | P816354-25G | Potassium chloride, KCI, also known as potassium muriate and sylvite, is a colorless crystalline solid with a salty taste that melts at 776°C (1420 OF). It is soluble in water, but insoluble in alcohol. Potassium chloride is used in fertilizers, pharmaceuticals, photography, and as a salt substitute. |
| Proteome Discover 1.4 | Matrix Science, London, UK | ||
| PVDF membrane | Millipore | 05317 | It is 1 roll, 26.5 cm x 1.875 m, 0.45 µm pore size, hydrophobic PVDF transfer membrane with low background fluorescence for western blotting. It is compatible with visible and infrared fluorescent probes. |
| Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| SCX column | Sigma | 58997 | It is 5-μm particle size, length 5cm × i.d. 4.6mm (Supelco). |
| Sodium orthovanadate (V) | Macklin | S817660-25G | Sodium orthovanadate (Vanadate) is a general competitive inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. The inhibition by sodium orthovanadate is reversible upon the addition of EDTA or by dilution. |
| Sucrose | Macklin | S824459-500G | Vetec reagent grade, 99% |
| Thiourea | Sigma | 62-56-6 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Tris base | Sigma | 10708976001 | TRIS base is useful in the pH range of 7.0-9.0. It has a pKa of 8.1 at 25°C. |
| Trypsin (cell culture use) | Gibco | 25200-056 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. |
| Urea | Sigma | U5378-100G | powder, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture |
References
- Sakhuja, S., Yun, H., Pisu, M., Akinyemiju, T. Availability of healthcare resources and epithelial ovarian cancer stage of diagnosis and mortality among Blacks and Whites. Journal of Ovarian Research. 10, 57 (2017).
- Gadducci, A., et al. Surveillance procedures for patients treated for epithelial ovarian cancer: a review of the literature. International Journal of Gynecological Cancer. 17, 21-31 (2007).
- Li, N., Li, H., Cao, L., Zhan, X. Quantitative analysis of the mitochondrial proteome in human ovarian carcinomas. Endocrine-Related Cancer. 25, 909-931 (2018).
- Li, N., Zhan, X., Zhan, X. The lncRNA SNHG3 regulates energy metabolism of ovarian cancer by an analysis of mitochondrial proteomes. Gynecologic Oncology. 150, 343-354 (2018).
- Li, N., Zhan, X. Signaling pathway network alterations in human ovarian cancers identified with quantitative mitochondrial proteomics. EPMA Journal. 10, 153-172 (2019).
- Deng, P., Haynes, C. M. Mitochondrial dysfunction in cancer: Potential roles of ATF5 and the mitochondrial UPR. Semin Cancer Biology. 47, 43-49 (2017).
- Georgieva, E., et al. Mitochondrial dysfunction and redox imbalance as a diagnostic marker of “free radical diseases”. Anticancer Research. 37, 5373-5381 (2017).
- Sotgia, F., et al. A mitochondrial based oncology platform for targeting cancer stem cells (CSCs): MITO-ONC-RX. Cell Cycle. 17, 2091-2100 (2018).
- Lee, J. H., et al. Individualized metabolic profiling stratifies pancreatic and biliary tract cancer: a useful tool for innovative screening programs and predictive strategies in healthcare. EPMA Journal. 9, 287-297 (2018).
- Zhan, X., Long, Y., Lu, M. Exploration of variations in proteome and metabolome for predictive diagnostics and personalized treatment algorithms: Innovative approach and examples for potential clinical application. Journal of Proteomics. 188, 30-40 (2018).
- Lu, M., Zhan, X. The crucial role of multiomic approach in cancer research and clinically relevant outcomes. EPMA Journal. 9, 77-102 (2018).
- Hu, R., Wang, X., Zhan, X. Multi-parameter systematic strategies for predictive, preventive and personalised medicine in cancer. EPMA Journal. 4, 2 (2013).
- Cheng, T., Zhan, X. Pattern recognition for predictive, preventive, and personalized medicine in cancer. EPMA Journal. 8, 51-60 (2017).
- Zhan, X., Zhou, T., Li, N., Li, H. The differentially mitochondrial proteomic dataset in human ovarian cancer relative to control tissues. Data in Brief. 20, 459-462 (2018).
- McMillan, J. D., Eisenback, M. A. Transmission electron microscopy for analysis of mitochondria in mouse skeletal muscle. Bio-protocol. 8, e2455 (2018).
- Paul, P. K., et al. Targeted ablation of TRAF6 inhibits skeletal muscle wasting in mice. Journal of Cell Biology. 191, 1395-1411 (2010).
- Pascual-Ahuir, A., Manzanares-Estreder, S., Proft, M. Pro- and antioxidant functions of the peroxisome-mitochondria connection and its impact on aging and disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 9860841 (2017).
- Schrader, M., Costello, J., Godinho, L. F., Islinger, M. Peroxisome-mitochondria interplay and disease. Journal of Inherited Metabolic Disease. 38, 681-702 (2015).
- Bartolák-Suki, E., Imsirovic, J., Nishibori, Y., Krishnan, R., Suki, B. Regulation of mitochondrial structure and dynamics by the cytoskeleton and mechanical factors. International Journal of Molecular Sciences. 18, 1812 (2017).
- Rezaul, K., Wu, L., Mayya, V., Hwang, S., Han, D. A systematic characterization of mitochondrial proteome from human T leukemia cells. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 169-181 (2005).
- Zhan, X., et al. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?. Electrophoresis. 39, 965-980 (2018).
- Zhan, X., Li, N., Zhan, X., Qian, S. Revival of 2DE-LC/MS in proteomics and its potential for large-scale study of human proteoforms. Med One. 3, e180008 (2018).
