Utarbeidelse av mitokondrier fra eggstokkene Cancer vev og kontroll eggstokkene vev for kvantitativ Proteomikk analyse
Summary
Denne artikkelen presenterer en protokoll av differensial-Speed sentrifugering i kombinasjon med tetthet gradient sentrifugering å skille mitokondrier fra humant eggstokkene kreft vev og kontroll eggstokkene vev for kvantitativ Proteomikk analyse, resulterer i en høy kvalitet mitokondrie prøven og høy-gjennomstrømning og høy reproduserbarhet kvantitativ Proteomikk analyse av en menneskelig kreft i eggstokkene mitokondrie proteom.
Abstract
Kreft i eggstokkene er en vanlig Gynecologic kreft med høy dødelighet, men uklart molekylær mekanisme. De fleste kreft i eggstokkene er diagnostisert i den avanserte scenen, som alvorlig hemmer terapi. Mitokondrie endringer er et kjennetegn på menneskelige eggstokkene kreft, og mitokondrier er sentrene for energi metabolisme, celle signalering, og oksidativt stress. Dyptgående innsikt i endringene av mitokondrie proteom i eggstokkene kreft i forhold til å kontrollere eggstokkene vev vil dra i dybden forståelse av molekylære mekanismer av eggstokkene kreft, og oppdagelsen av effektive og pålitelige biomarkører og terapeutiske mål. En effektiv mitokondrie forberedelse metoden kombinert med en isobar kode for relative og absolutte kvantifisering (iTRAQ) kvantitative Proteomikk er presentert her for å analysere menneskelige eggstokkene kreft og kontroll mitokondrie proteomes, inkludert differensial-Speed sentrifugering, tetthet gradient sentrifugering, kvalitetsvurdering av mitokondrie prøver, protein fordøyelse med Trypsin, iTRAQ merking, sterk spesifiserer utveksling fraksjonering (SCX), flytende kromatografi (LC), tandem masse massespektrometri (MS/ MS), database analyse, og kvantitativ analyse av mitokondrie proteiner. Mange proteiner har blitt identifisert for å maksimere dekningen av den menneskelige eggstokkene kreft mitokondrie proteom og for å oppnå differensielt uttrykt mitokondrie protein profil i Human eggstokkene kreft.
Introduction
Eggstokkene kreft er en vanlig Gynecologic kreft med høy dødelighet, men uklart molekylær mekanisme1,2. De fleste av eggstokkene kreft er diagnostisert i den avanserte scenen, som alvorlig hemmer terapi. Mitokondrie endringer er et kjennetegn på menneskelige eggstokkene kreft, og mitokondrier er sentre for energi metabolisme, celle signalering, og oksidativt stress3,4,5,6,7. Dyptgående innsikt i endringene av mitokondrie proteom i eggstokkene kreft i forhold til å kontrollere eggstokkene vev vil dra i dybden forståelse av molekylære mekanismer av eggstokkene kreft, og oppdagelsen av effektive og pålitelige biomarkører og terapeutiske mål. Mitokondrie metabolisme har blitt foreslått og anerkjent som et mål for kreft terapi, og antimitochondrial terapi kan til slutt være svært gunstig for å hindre gjentakelse og metastasering av kreft8. Individuell metabolsk profilering er også allerede praktisert som et nyttig verktøy for kreft lagdeling og prediktiv strategier9,10.
Det langsiktige målet med denne forskningen er å utvikle og bruke en kvantitativ mitokondrie Proteomikk metode for å studere eggstokkene kreft for avklaring av mitokondrie proteom endringer mellom eggstokkene kreft og kontroll eggstokkene vev, og deres molekylære nettverk endringer fra en systematisk multi-omics vinkel11,12, noe som vil resultere i oppdagelsen av mitokondrier-målrettede molekylær biomarkører13 for avklaring av den molekylære mekanismer av eggstokkene kreft, prediksjon, og personlig behandling av eggstokkene kreftpasienter. Isobar koder for relative og absolutte kvantifisering (iTRAQ) merking3,4 er en effektiv metode for å kvantifisere mitokondrie protein endringer. Utarbeidelse av høy kvalitet mitokondrie prøver fra humant eggstokkene kreft og kontroll eggstokkene vev er forutsetningen for iTRAQ kvantitativ analyse av mitokondrie proteomes3. Mitokondrie forberedelse kombinert med iTRAQ kvantitative Proteomikk har blitt brukt i langsiktige forskningsprogrammer om den menneskelige eggstokkene kreft mitokondrie proteom, inkludert etablering av mitokondrie proteom referansekart3, analyse av differensielt uttrykt mitokondrie profiler4,14 og post-translational modifikasjoner, inkludert fosforylering, som allerede har resultert i oppdagelsen av viktige signalering veien nettverksendringer i Human eggstokkene kreft5, inkludert endringer i energi metabolisme4, lipid metabolisme, og mitophagy Pathway-systemer3.
Tidligere studier har funnet at differensial-Speed sentrifugering i kombinasjon med tetthet gradient sentrifugering er en effektiv metode for å isolere og rense mitokondrier fra menneskelige eggstokkene kreft og kontroll eggstokkene vev3,4,5,14. Den iTRAQ merking kombinert med sterk spesifiserer utveksling (SCX)-Liquid kromatografi (LC)-tandem masse massespektrometri (MS/MS) er den viktigste teknikken for å oppdage, identifisere og kvantifisere proteiner fra forberedt mitokondrie prøvene.
Her beskrives detaljerte protokoller for mitokondrie forberedelser kombinert med iTRAQ kvantitative Proteomikk. Disse har blitt brukt i analysen av humant eggstokkene kreft vev mitokondrie proteomes. Protokollene inkluderer utarbeidelse av prøver, differensial-hastighet sentrifugering, tetthet gradient sentrifugering, kvalitet vurdering av mitokondrie prøver, protein fordøyelse med Trypsin, iTRAQ merking, SCX fraksjonering, LC, MS/MS, database søk, og kvantitativ analyse av mitokondrie proteiner. Videre, denne protokollen lett oversettes til å analysere andre menneskelige vev mitokondrie proteomes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mitokondrie endringer er et kjennetegn på kreft i eggstokkene. Utarbeidelse av høykvalitets mitokondrie prøver fra menneskelige eggstokkene kreft og kontroll vev for stor skala kvantitative Proteomikk fordel den inngående forståelse av mitokondrie funksjon i eggstokkene kreft patogenesen og mitokondrie molekylær nettverksendringer, og bidra til å avklare sin molekylære mekanisme for senere oppdagelse av Target terapi og effektiv biomarkører basert på mitokondrier4,<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Hunan Provincial Hundred talent plan (til X.Z.), den Xiangya Hospital Funds for talent Innledning (til XZ), National Natural Science Foundation i Kina (Grant no. 81572278 og 81272798 til XZ), tilskudd fra Kina “863” plan Prosjekt (Grant no. 2014AA020610-1 til XZ), og Hunan Provincial Natural Science Foundation i Kina (Grant no. 14JJ7008 til XZ). X.Z. unnfanget konseptet for det nåværende manuskriptet, fikk iTRAQ kvantitative Proteomikk data av mitokondrier prøver, skrev og reviderte manuskriptet, koordinerte det relevante arbeidet, og var ansvarlig for den økonomiske støtten og tilsvarende Arbeid. H.L. forberedt mitokondrier prøver. S.Q. deltok i delvis arbeid. X. H. Z deltok i skriftlig og redigert engelsk språk. N.L. analyserte iTRAQ Proteomikk data. Alle forfatterne godkjente det endelige manuskriptet.
Materials
| BCA protein assay kit | Vazyme | E112 | BCA protein assay kit is a special 3-component version of our popular BCA reagents, optimized to measure (A562nm) total protein concentration of dilute protein solutions (0.5 to 20 micrograms/ml). |
| Bovine serum albumin (BSA) | Solarbio | A8020-5G | Heat shock fraction, Australia origin, protease free, low fatty acid, low IgG, pH 7, ≥98% |
| Centrifuge | XiangYi | TDZ4–WS | |
| CHAPS | Sigma | C9426-5G | BioReagent, suitable for electrophoresis, ≥98% (HPLC) (Sigma-Aldrich) |
| Diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | 798681-100G | Anhydrous, free-flowing, Redi-Dri, ≥98% |
| DTT | Sigma | 10197777001 | 1,4-Dithiothreitol |
| Easy nLC | Proxeon Biosystems (now Thermo Fisher Scientific) | ||
| Ethylen glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E0396-10G | BioXtra, ≥97 .0% |
| Homogenizer | SilentShake | HYQ-3110 | |
| iTRAQ reagent kit | Applied Biosystems | Applied Biosystems iTRAQ Reagents–Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A | |
| Low-temperature super-speed centrifuger | Eppendorf | 5424R | |
| Mannitol | Macklin | M813424-100G | Mannitol is a polyol (polyhydric alcohol) produced from hydrogenation from fructose that functions as a sweetener, humectant, and bulking agent. It has low hygroscopicity and poor oil solvency. |
| MASCOT search engine | Matrix Science, London, UK; version 2.2 | ||
| Nagarse | Solarbio | P9090 | |
| N-hydroxysuccinimide (SDT) | Sigma | 56480-25G | Purum, ≥97.0% (T) |
| Nycodenz | Alere/Axis-Shield | 1002424-1 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) protease inhibitor | Solarbio | P0100-1ML | PMSF is a protease inhibitor that reacts with serine residues to inhibit trypsin, chymotrypsin, thrombin, and papain. |
| Potassium chloride | Macklin | P816354-25G | Potassium chloride, KCI, also known as potassium muriate and sylvite, is a colorless crystalline solid with a salty taste that melts at 776°C (1420 OF). It is soluble in water, but insoluble in alcohol. Potassium chloride is used in fertilizers, pharmaceuticals, photography, and as a salt substitute. |
| Proteome Discover 1.4 | Matrix Science, London, UK | ||
| PVDF membrane | Millipore | 05317 | It is 1 roll, 26.5 cm x 1.875 m, 0.45 µm pore size, hydrophobic PVDF transfer membrane with low background fluorescence for western blotting. It is compatible with visible and infrared fluorescent probes. |
| Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| SCX column | Sigma | 58997 | It is 5-μm particle size, length 5cm × i.d. 4.6mm (Supelco). |
| Sodium orthovanadate (V) | Macklin | S817660-25G | Sodium orthovanadate (Vanadate) is a general competitive inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. The inhibition by sodium orthovanadate is reversible upon the addition of EDTA or by dilution. |
| Sucrose | Macklin | S824459-500G | Vetec reagent grade, 99% |
| Thiourea | Sigma | 62-56-6 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Tris base | Sigma | 10708976001 | TRIS base is useful in the pH range of 7.0-9.0. It has a pKa of 8.1 at 25°C. |
| Trypsin (cell culture use) | Gibco | 25200-056 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. |
| Urea | Sigma | U5378-100G | powder, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture |
References
- Sakhuja, S., Yun, H., Pisu, M., Akinyemiju, T. Availability of healthcare resources and epithelial ovarian cancer stage of diagnosis and mortality among Blacks and Whites. Journal of Ovarian Research. 10, 57 (2017).
- Gadducci, A., et al. Surveillance procedures for patients treated for epithelial ovarian cancer: a review of the literature. International Journal of Gynecological Cancer. 17, 21-31 (2007).
- Li, N., Li, H., Cao, L., Zhan, X. Quantitative analysis of the mitochondrial proteome in human ovarian carcinomas. Endocrine-Related Cancer. 25, 909-931 (2018).
- Li, N., Zhan, X., Zhan, X. The lncRNA SNHG3 regulates energy metabolism of ovarian cancer by an analysis of mitochondrial proteomes. Gynecologic Oncology. 150, 343-354 (2018).
- Li, N., Zhan, X. Signaling pathway network alterations in human ovarian cancers identified with quantitative mitochondrial proteomics. EPMA Journal. 10, 153-172 (2019).
- Deng, P., Haynes, C. M. Mitochondrial dysfunction in cancer: Potential roles of ATF5 and the mitochondrial UPR. Semin Cancer Biology. 47, 43-49 (2017).
- Georgieva, E., et al. Mitochondrial dysfunction and redox imbalance as a diagnostic marker of “free radical diseases”. Anticancer Research. 37, 5373-5381 (2017).
- Sotgia, F., et al. A mitochondrial based oncology platform for targeting cancer stem cells (CSCs): MITO-ONC-RX. Cell Cycle. 17, 2091-2100 (2018).
- Lee, J. H., et al. Individualized metabolic profiling stratifies pancreatic and biliary tract cancer: a useful tool for innovative screening programs and predictive strategies in healthcare. EPMA Journal. 9, 287-297 (2018).
- Zhan, X., Long, Y., Lu, M. Exploration of variations in proteome and metabolome for predictive diagnostics and personalized treatment algorithms: Innovative approach and examples for potential clinical application. Journal of Proteomics. 188, 30-40 (2018).
- Lu, M., Zhan, X. The crucial role of multiomic approach in cancer research and clinically relevant outcomes. EPMA Journal. 9, 77-102 (2018).
- Hu, R., Wang, X., Zhan, X. Multi-parameter systematic strategies for predictive, preventive and personalised medicine in cancer. EPMA Journal. 4, 2 (2013).
- Cheng, T., Zhan, X. Pattern recognition for predictive, preventive, and personalized medicine in cancer. EPMA Journal. 8, 51-60 (2017).
- Zhan, X., Zhou, T., Li, N., Li, H. The differentially mitochondrial proteomic dataset in human ovarian cancer relative to control tissues. Data in Brief. 20, 459-462 (2018).
- McMillan, J. D., Eisenback, M. A. Transmission electron microscopy for analysis of mitochondria in mouse skeletal muscle. Bio-protocol. 8, e2455 (2018).
- Paul, P. K., et al. Targeted ablation of TRAF6 inhibits skeletal muscle wasting in mice. Journal of Cell Biology. 191, 1395-1411 (2010).
- Pascual-Ahuir, A., Manzanares-Estreder, S., Proft, M. Pro- and antioxidant functions of the peroxisome-mitochondria connection and its impact on aging and disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 9860841 (2017).
- Schrader, M., Costello, J., Godinho, L. F., Islinger, M. Peroxisome-mitochondria interplay and disease. Journal of Inherited Metabolic Disease. 38, 681-702 (2015).
- Bartolák-Suki, E., Imsirovic, J., Nishibori, Y., Krishnan, R., Suki, B. Regulation of mitochondrial structure and dynamics by the cytoskeleton and mechanical factors. International Journal of Molecular Sciences. 18, 1812 (2017).
- Rezaul, K., Wu, L., Mayya, V., Hwang, S., Han, D. A systematic characterization of mitochondrial proteome from human T leukemia cells. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 169-181 (2005).
- Zhan, X., et al. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?. Electrophoresis. 39, 965-980 (2018).
- Zhan, X., Li, N., Zhan, X., Qian, S. Revival of 2DE-LC/MS in proteomics and its potential for large-scale study of human proteoforms. Med One. 3, e180008 (2018).
