Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Utarbeidelse av mitokondrier fra eggstokkene Cancer vev og kontroll eggstokkene vev for kvantitativ Proteomikk analyse

Published: November 18, 2019 doi: 10.3791/60435
Automatic Translation
1,2,3,4, 5, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Key Laboratory of Cancer Proteomics of Chinese Ministry of Health, Xiangya Hospital, Central South University, 2Hunan Engineering Laboratory for Structural Biology and Drug Design, Xiangya Hospital, Central South University, 3State Local Joint Engineering Laboratory for Anticancer Drugs, Xiangya Hospital, Central South University, 4National Clinical Research Center for Geriatric Disorders, Xiangya Hospital, Central South University, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Xiangya Hospital, Central South University

Summary

Denne artikkelen presenterer en protokoll av differensial-Speed sentrifugering i kombinasjon med tetthet gradient sentrifugering å skille mitokondrier fra humant eggstokkene kreft vev og kontroll eggstokkene vev for kvantitativ Proteomikk analyse, resulterer i en høy kvalitet mitokondrie prøven og høy-gjennomstrømning og høy reproduserbarhet kvantitativ Proteomikk analyse av en menneskelig kreft i eggstokkene mitokondrie proteom.

Abstract

Kreft i eggstokkene er en vanlig Gynecologic kreft med høy dødelighet, men uklart molekylær mekanisme. De fleste kreft i eggstokkene er diagnostisert i den avanserte scenen, som alvorlig hemmer terapi. Mitokondrie endringer er et kjennetegn på menneskelige eggstokkene kreft, og mitokondrier er sentrene for energi metabolisme, celle signalering, og oksidativt stress. Dyptgående innsikt i endringene av mitokondrie proteom i eggstokkene kreft i forhold til å kontrollere eggstokkene vev vil dra i dybden forståelse av molekylære mekanismer av eggstokkene kreft, og oppdagelsen av effektive og pålitelige biomarkører og terapeutiske mål. En effektiv mitokondrie forberedelse metoden kombinert med en isobar kode for relative og absolutte kvantifisering (iTRAQ) kvantitative Proteomikk er presentert her for å analysere menneskelige eggstokkene kreft og kontroll mitokondrie proteomes, inkludert differensial-Speed sentrifugering, tetthet gradient sentrifugering, kvalitetsvurdering av mitokondrie prøver, protein fordøyelse med Trypsin, iTRAQ merking, sterk spesifiserer utveksling fraksjonering (SCX), flytende kromatografi (LC), tandem masse massespektrometri (MS/ MS), database analyse, og kvantitativ analyse av mitokondrie proteiner. Mange proteiner har blitt identifisert for å maksimere dekningen av den menneskelige eggstokkene kreft mitokondrie proteom og for å oppnå differensielt uttrykt mitokondrie protein profil i Human eggstokkene kreft.

Introduction

Eggstokkene kreft er en vanlig Gynecologic kreft med høy dødelighet, men uklart molekylær mekanisme1,2. De fleste av eggstokkene kreft er diagnostisert i den avanserte scenen, som alvorlig hemmer terapi. Mitokondrie endringer er et kjennetegn på menneskelige eggstokkene kreft, og mitokondrier er sentre for energi metabolisme, celle signalering, og oksidativt stress3,4,5,6,7. Dyptgående innsikt i endringene av mitokondrie proteom i eggstokkene kreft i forhold til å kontrollere eggstokkene vev vil dra i dybden forståelse av molekylære mekanismer av eggstokkene kreft, og oppdagelsen av effektive og pålitelige biomarkører og terapeutiske mål. Mitokondrie metabolisme har blitt foreslått og anerkjent som et mål for kreft terapi, og antimitochondrial terapi kan til slutt være svært gunstig for å hindre gjentakelse og metastasering av kreft8. Individuell metabolsk profilering er også allerede praktisert som et nyttig verktøy for kreft lagdeling og prediktiv strategier9,10.

Det langsiktige målet med denne forskningen er å utvikle og bruke en kvantitativ mitokondrie Proteomikk metode for å studere eggstokkene kreft for avklaring av mitokondrie proteom endringer mellom eggstokkene kreft og kontroll eggstokkene vev, og deres molekylære nettverk endringer fra en systematisk multi-omics vinkel11,12, noe som vil resultere i oppdagelsen av mitokondrier-målrettede molekylær biomarkører13 for avklaring av den molekylære mekanismer av eggstokkene kreft, prediksjon, og personlig behandling av eggstokkene kreftpasienter. Isobar koder for relative og absolutte kvantifisering (iTRAQ) merking3,4 er en effektiv metode for å kvantifisere mitokondrie protein endringer. Utarbeidelse av høy kvalitet mitokondrie prøver fra humant eggstokkene kreft og kontroll eggstokkene vev er forutsetningen for iTRAQ kvantitativ analyse av mitokondrie proteomes3. Mitokondrie forberedelse kombinert med iTRAQ kvantitative Proteomikk har blitt brukt i langsiktige forskningsprogrammer om den menneskelige eggstokkene kreft mitokondrie proteom, inkludert etablering av mitokondrie proteom referansekart3, analyse av differensielt uttrykt mitokondrie profiler4,14 og post-translational modifikasjoner, inkludert fosforylering, som allerede har resultert i oppdagelsen av viktige signalering veien nettverksendringer i Human eggstokkene kreft5, inkludert endringer i energi metabolisme4, lipid metabolisme, og mitophagy Pathway-systemer3.

Tidligere studier har funnet at differensial-Speed sentrifugering i kombinasjon med tetthet gradient sentrifugering er en effektiv metode for å isolere og rense mitokondrier fra menneskelige eggstokkene kreft og kontroll eggstokkene vev3,4,5,14. Den iTRAQ merking kombinert med sterk spesifiserer utveksling (SCX)-Liquid kromatografi (LC)-tandem masse massespektrometri (MS/MS) er den viktigste teknikken for å oppdage, identifisere og kvantifisere proteiner fra forberedt mitokondrie prøvene.

Her beskrives detaljerte protokoller for mitokondrie forberedelser kombinert med iTRAQ kvantitative Proteomikk. Disse har blitt brukt i analysen av humant eggstokkene kreft vev mitokondrie proteomes. Protokollene inkluderer utarbeidelse av prøver, differensial-hastighet sentrifugering, tetthet gradient sentrifugering, kvalitet vurdering av mitokondrie prøver, protein fordøyelse med Trypsin, iTRAQ merking, SCX fraksjonering, LC, MS/MS, database søk, og kvantitativ analyse av mitokondrie proteiner. Videre, denne protokollen lett oversettes til å analysere andre menneskelige vev mitokondrie proteomes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Vevsprøver av eggstokkene, inkludert kreft i eggstokkene (n = 7) og vev med normal kontroll eggstokkene (n = 11) ble brukt i denne protokollen. Den nåværende protokoll3,4,5 er godkjent av Xiangya sykehus medisinsk etikk komité Central South University, Kina.

1. utarbeidelse av mitokondrier fra kreft vev i humant eggstokkene

  1. Klargjør 250 mL av mitokondrie isolasjons buffer ved å blande 210 mM mannitol, 70 mM sukrose, 100 mM kalium klorid (KCl), 50 mM Tris-HCl, 1 mM diamin Tetraacetic yre (EDTA), 0,1 mM etylen glykol BIS (2-aminoethyl Eter) Tetraacetic syre (EGTA), 1 mM phenylmethanesulfonyl fluor (PMSF) protease inhibitor, 2 mM natrium orthovanadate (V), og 0,2% storfe serum albumin (BSA), pH 7,4.
  2. Plasser ~ 1,5 g av eggstokkene kreft vev i et rent glass parabolen.
  3. Tilsett 2 mL av pre-kjølt mitokondrie isolasjon buffer å lett vaske blodet fra vevet overflaten 3x.
  4. Bruk feilfri saks for å fullt hakke vevet inn i ca 1 mm3 stykker, og overføre hakket vev i en 50 ml sentrifugerør.
  5. Tilsett 13,5 mL mitokondrie isolasjons buffer som inneholder 0,2 mg/mL nagarse, og bruk deretter en elektrisk homogenisator til å homogenisere (bruk skala 2, 10 s 6 ganger, intervall 10 s) hakket vev (2 min, 4 ° c).
  6. Tilsett ytterligere 3 mL mitokondrie isolasjons buffer i vevet homogenater og bland dem godt med pipettering.
  7. Sentrifuger den preparerte vev homogenate (1 300 x g, 10 min, 4 ° c). Fjern den grove kjernefysiske fraksjonen (dvs. pellet) og holde supernatanten.
  8. Recentrifuge supernatanten (10 000 x g, 10 min, 4 ° c). Fjern levermikrosomer (dvs. supernatanten) og hold pellet.
  9. Tilsett 2 mL mitokondrie isolasjons buffer og resuspend pellet brønnen ved lys pipettering.
  10. Sentrifuger pellet suspensjonen (7 000 x g, 10 min, 4 ° c). Kast supernatanten og behold grov mitokondrier (dvs. pellet).
  11. Tilsett 12 mL av 25% tetthet gradient medium (dvs. Nycodenz) å resuspend den utpakkede råolje mitokondrier.
  12. Lag en usammenhengende tetthet gradient ved å fylle et rør fra bunn til topp med 5 mL 34%, 8 mL 30%, 12 mL 25% (inneholder råolje mitokondrier fra trinn 1,11), 8 mL 23%, og 3 mL 20% tetthet gradient medium, og sentrifuger det (52 000 x g, 90 min, 4 ° c).
  13. Bruk en lang og sløv sprøyte for å samle renset mitokondrier i grensesnittet mellom 25% og 30% tetthet gradient medium i en ren tube.
  14. Legg til mitokondrie isolasjons buffer i de innsamlede mitokondrier for å fortynne den til en tre-fold volum. Sentrifuger (15 000 x g, 20 min., 4 ° c) og kast supernatanten.
  15. Tilsett 2 mL mitokondrie isolasjons buffer for å resuspend pellet, og sentrifuger (15 000 x g, 20 min, 4 ° c). Kast supernatanten og hold pellet.
  16. Samle den siste pellet (dvs. renset mitokondrier) og oppbevar den ved-20 ° c.
    Merk: Kombiner alle renset mitokondrier fra eggstokkene kreft vev som mitokondrier prøven for kvantitativ Proteomikk analyse.

2. utarbeidelse av mitokondrier fra menneske kontroll eggstokkene vev

  1. Klargjør 250 mL av mitokondrie isolasjons buffer som beskrevet i trinn 1,1.
  2. Plasser ~ 1,5 g av normal kontroll eggstokkene vev i et rent glass parabolen.
  3. Tilsett 2 mL pre-kjølt mitokondrie isolasjon buffer for å lett vaske blodet fra vevet overflaten 3x.
  4. Bruk feilfri saks for å fullt hakke vevet inn i ca 1 mm3 stykker, og overføre hakket vev i en 50 ml sentrifugerør.
  5. Tilsett 8 mL 0,05% Trypsin/20 mM EDTA i fosfat-bufret saltvann (PBS) til hakket kontroll vev, og fordøye (30 min, romtemperatur), som bidrar til å lyse vev og celler og slipp mitokondrier. Deretter sentrifuge (200 x g, 5 min). Kast supernatanten, og holde vev og celler.
  6. Tilsett 13,5 mL mitokondrie isolasjons buffer som inneholder 0,2 mg/mL nagarse, og bruk deretter en elektrisk homogenisator til å homogenisere (bruk skala 2, 10 s 6 ganger, intervall 10 s) hakket vev (2 min, 4 ° c).
  7. Tilsett ytterligere 3 mL mitokondrie isolasjons buffer i vevet homogenater og bland dem godt med pipettering.
  8. Sentrifuger den preparerte vev homogenate (1 300 x g, 10 min, 4 ° c). Fjern den grove kjernefysiske fraksjonen (dvs. pellet) og holde supernatanten.
  9. Recentrifuge supernatanten (10 000 x g, 10 min, 4 ° c). Fjern levermikrosomer (dvs. supernatanten) og hold pellet.
  10. Tilsett 2 mL mitokondrie isolasjons buffer for å resuspend pellet brønnen ved lys pipettering.
  11. Sentrifuger pellet suspensjonen (7 000 x g, 10 min, 4 ° c). Kast supernatanten og behold grov mitokondrier (dvs. pellet).
  12. Tilsett 12 mL 25% tetthet gradient medium for å resuspend den utpakkede råolje mitokondrier.
  13. Lag en usammenhengende tetthet gradient ved å fylle et rør fra bunn til topp med 8 mL 38%, 5 mL 34%, 8 mL 30%, 12 mL 25% (som inneholder råolje mitokondrier fra trinn 2,12), 8 mL 23%, og 3 mL 20% tetthet gradient medium, og sentrifuger det (52 000 x g, 90 min, 4 ° c).
  14. Bruk en lang og sløv sprøyte for å samle renset mitokondrier i området fra grensesnittet mellom 25% og 30% til grensesnittet mellom 34% og 38% i et rent rør.
  15. Legg til mitokondrie isolasjons buffer i de innsamlede mitokondrier for å fortynne den til en tre-fold volum. Sentrifuger (15 000 x g, 20 min., 4 ° c) og kast supernatanten.
  16. Tilsett 2 mL mitokondrie isolasjons buffer for å resuspend pellet, og sentrifuger den (15 000 x g, 20 min, 4 ° c). Kast supernatanten og hold pellet.
  17. Samle den siste pellet (dvs. renset mitokondrier) og oppbevar den ved-20 ° c.
    Merk: Kombiner alle renset mitokondrier fra kontroll eggstokkene vev som mitokondrie prøvene for kvantitativ Proteomikk analyse.

3. verifisering av kvaliteten på renset vev mitokondrie prøver

  1. Ta et rør av renset mitokondrie prøver (dvs. pellets fra eggstokkene kreft vev fra trinn 1,16 og kontroll eggstokkene vev fra trinn 2,17) for verifisering med elektron mikroskopi (EM).
    Merk: den detaljerte protokollen ble beskrevet tidligere15,16.
  2. Klargjør mitokondrie protein utvinnings buffer ved å blande 8 M urea, 2 M thiourea, 40 mM Tris, 1 mM EDTA, 130 mM dithiotreitol (DTT) og 4% (w:v) 3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio) -1-propanesulfonate (KARER). Juster pH til 8,52.
  3. Ta et rør av renset mitokondrie prøver (dvs. pellets fra eggstokkene kreft vev i trinn 1,16 og kontroll eggstokkene vev i trinn 2,17) og legge mitokondrie protein utvinning buffer (mitokondrie prøver til protein utvinning buffer, 1:5) til resuspend pellet. Frys prøvene i flytende nitrogen 3x og oppbevar ved romtemperatur i 2 timer.
  4. Sentrifuger på 12 000 x g, 30 min, 4 ° c, samle supernatanten (dvs. den utpakkede mitokondrie protein prøven), og måle proteininnholdet med en bicinchoninic syre (BCA) protein analysen Kit.
  5. Forbered 50 mL av 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) ved å blande 9,08 g Tris og 40 mL ddH2O, justere pH til 8,8 ved hjelp av HCL, og legge ddH2O til et endelig volum på 50 ml. Oppbevares ved 4 ° c.
  6. Forbered 50 mL på 1 M Tris-HCl (pH 6,8) ved å blande 6,06 g Tris og 40 mL ddH2O, Juster pH-verdien til 6,8 ved hjelp av HCL, og Legg til ddH2O i et endelig volum på 50 ml. Oppbevares ved 4 ° c.
  7. Klargjør 100 mL 30% akrylamid-BIS-løsning ved å blande 29 g akrylamid, 1 g av BIS-akrylamid og 80 mL ddH2o, og Legg til ddH2o i et endelig volum på 100 ml. Oppbevar den i en brun flaske ved 4 ° c.
  8. Forbered 1 000 mL på 10x Tris-Glycine elektroforese buffer ved å blande 29 g av Glycine, 58 g av Tris, 3,7 g natrium natriumdodecylsulfat sulfat (SDS), og 800 mL av ddH2o, og deretter legge ddH2o til et endelig volum på 1 000 ml.
  9. Forbered 10 mL laste buffer ved å blande 2 mL glyserin, 0,02 g bromophenol blå, 0,4 g av SDS, 2 mL Tris-HCl pH 6,8, og 7 mL ddH2o, og deretter legge ddH2o til et endelig volum på 10 ml.
  10. Forbered 10 mL av 10% natrium natriumdodecylsulfat sulfat-polyakrylamid gel elektroforese (SDS-side) løse gel ved å blande 4 mL ddH2O, 3,3 ml 30% akrylamid-BIS løsning, 2,5 mL av 1,5 M Tris-HCL (pH 8,8), 0,1 ml 10% SDS, 0,1 ml 10% ammonium persulfate, og 0,004 ml av TETRAMETYLETYLENDIAMIN (TEMED). Hell SDS-PAGE løse gel løsning i platen mellom glass platene til nivået på bunnen av kammen. Tilsett 2 mL isopropylalkohol alkohol på toppen. Permisjon i 30 min.
  11. Fjern isopropylalkohol alkohol og vask toppen med ddH2O 3x. Hell 5% konsentrasjon gel løsning som inneholder 4,1 mL ddH2O, 1,0 ml 30% acylamide-BIS løsning, 0,75 ml 1 M Tris-HCL (pH 6,8), 0,06 ml 10% SDS, 0,06 ml 10% ammonium persulfate, og 0,006 ml av TEMED. Umiddelbart sette kammen inn i konsentrasjonen gel løsning, la i 30 min, og deretter ta ut kammen.
  12. Klargjør 1x Tris-Glycine elektroforese buffer ved å fortynne 100 mL av 10x Tris-Glycine elektroforese buffer med 900 mL ddH2O og hell i Elektroforetiske tanken.
  13. Bland 30 μg av mitokondrie proteiner fra kreft i eggstokkene og kontroller eggstokkene fra trinn 3,4 med laste buffer for å nå et endelig volum på 20 μL. kok blandingen i 5 min, og skill den med 10% SDS-PAGE løse gel ved hjelp av en konstant spenning på 100 V. Når bromphenol blå når bunnen, stopp elektroforese.
  14. Forbered 1,5 L av Elektroforetiske overføringsbuffer ved å blande 150 mL 10x Tris-Glycine elektroforese buffer, 1 050 mL ddH2O, og 300 ml metanol.
  15. Sug PVDF membranen i 100% metanol i 10 min og i Elektroforetiske overføringsbuffer i minst 5 min. sug fem ark med filter papir i 1x elecrophoretic overføringsbuffer i minst 5 min.
  16. Ta ut SDS-side gel inneholder proteiner, og suge den i Elektroforetiske overføringsbuffer i 10 min.
  17. Lag en overføring kassett ved å plassere en våt svamp på den hvite platen, tre ark med vått filter papir, PVDF membran, SDS-side gel med proteiner, to ark med vått filter papir, og den våte svamp fra bunnen til toppen. Unngå eventuelle bobler.
  18. Plasser overførings kassetten i Elektroforetiske tanken, hell i Elektroforetiske overføringsbuffer, og deretter overføre for 2 h under en konstant 200 mA strøm.
  19. Forbered 10x Tris-bufret saltvann (TBS) lagerløsning ved å blande 12,114 g Tris, 29,22 g av NaCl, og legge ddH2O til et endelig volum på 500 ml. Forbered 2 L av 1x TBST ved å blande 200 mL 10x TBS, 2 mL mellom-20 og 1 798 mL ddH2O. klargjør 100 ml blokkerings løsning ved å blande 100 ml TBST og 5 g av BSA.
  20. Etter overføring, ta ut PVDF membranen, vask lett i TBST i 5 min, deretter blokkere den i blokkerende løsning for 1 t ved romtemperatur.
  21. Ruge PVDF membranen (4 ° c over natten) med forskjellige primære antistoffer spesifikke for ulike subcellulære organeller, inkludert Lamin B (celle nucleus; geit anti-humant antistoff 1:1 000 blokkering løsning), flotillin-1 (cytomembrane; kanin anti-menneskelige antistoff 1:500 blokkering løsning), COX4I1 (mitokondrie; kanin anti-menneskelige 1:1000 blokkerende løsning), GM130 (Golgi apparat; mus anti-menneskelige antistoff 1:1000 blokkerende løsning), catalase (peroksisomproliferatoraktiverende; kanin anti-humant antistoff 1:1000 blokkering løsning), og katepsin B (lysosome; kanin anti-humant antistoff 1:1000 blokkerende løsning). Vaskes lett i TBST i 5 min 3x.
  22. Ruge PVDF-membranen i 1 time ved romtemperatur med tilsvarende sekundære antistoffer (kanin anti-geit, geit anti-kanin, eller geit anti-mus). Vaskes lett i TBST i 5 min 3x. Visualiser den med electrochemiluminescence (ECL).

4. iTRAQ-SCX-LC-MS/MS analyse

Merk: de detaljerte prosedyrene for del 4 viser til iTRAQ-instruksjonene (tabell med materialer).

  1. Legg til SDT-buffer (4% SDS, 100 mM Tris-HCl pH 7,6 og 100 mM DTT) til renset mitokondrie prøvene (dvs. pellets fra eggstokkene kreft vev fra trinn 1,16 og kontroll eggstokkene vev fra trinn 2,17). Vortex prøven til det ikke er synlig utfelling.
    Merk: mitokondrie prøven til SDT buffer forholdet skal være 1:5.
  2. Kok SDT-behandlet prøven i 5 min, kjøle ned prøven på isen, og deretter sentrifuger (2 000 x g, 2 min).
  3. Samle supernatanten som utvinnes mitokondrie protein prøver og måle proteininnhold med en BCA protein analysen Kit.
  4. Ta SDT-utpakkede mitokondrie proteiner (200 mikrogram av hver prøve) for reduksjon, alkylation, fordøyelse med Trypsin, desalinering, og lyophilization3,4. Gjør tre replikerer for hver prøve.
  5. Behandle tryptic-peptider (100 mikrogram i hver prøve) fra trinn 4,4 med 100 mm tetraethyl ammonium bromide-oppløsning (pH 8,5), og Merk de tryptic peptider med en av 6-Plex iTRAQ reagenser i henhold til instruksjonene3,4. Merk hver prøve 3x.
  6. Bland like 6 merket tryptic peptid prøver (tre fra eggstokkene kreft vev og tre fra kontroll eggstokkene vev), og tørk med et vakuum konsentratoren.
  7. Fractionate de blandede iTRAQ-merkede peptider med SCX kromatografi i 60 fraksjoner (en brøkdel per 1 min), og Kombiner deretter hver to fraksjoner som en SCX-fraksjonert sample (n = 30).
  8. Subject hver SCX-fraksjonert sample til LC-MS/MS analyse på en masse spektrometer3,4 kombinert med en nano LC system innen en 60-min LC separasjon gradient for å få MS/MS data.
  9. Søk i MS/MS data for å identifisere proteiner med søkemotoren (tabell av materialer).
  10. Bruk iTRAQ for å kvantifisere hvert protein og bestemme mitokondrie differensielt uttrykt proteiner (mtDEPs) med en endring av > 1.5 eller <-1,5 fold, og p < 0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det var en forskjell i utarbeidelse av mitokondrier fra eggstokkene kreft vev og kontroll eggstokkene vev. Denne studien fant at det var mye lettere å forberede mitokondrier fra eggstokkene kreft vev enn fra kontroll eggstokkene vev3,4. Noen forbedringer måtte gjøres til protokollen for utarbeidelse av mitokondrier fra kontroll eggstokkene vev. Først før vev homogenisering, var det nødvendig å legge til 8 mL 0,05% Trypsin/20 mM EDTA i PBS løsningen lagt til hakket kontroll vev, etterfulgt av fordøyelsen i 30 min ved romtemperatur, og sentrifugering ved 200 x g i 5 min (se protokoll trinn 2,5). Dette forbedret utarbeidelse av mitokondrier. For det andre var den usammenhengende tettheten gradient annerledes for utarbeidelse av mitokondrier fra kontroll eggstokkene vev og eggstokkene kreft vev (figur 1). For kreft i eggstokkene ble det fremstilt ved å tilsette 5 mL 34%, 8 mL 30%, 12 mL 25% (som inneholder råolje mitokondrier), 8 mL 23% og 3 mL med 20% tetthet gradient medium fra bunn til topp i et rør. Renset mitokondrier ble funnet i grensesnittet mellom 25% og 30% etter sentrifugering (figur 1A, se protokoll trinn 1,12 og 1,13). For kontroll eggstokkene vev ble det utarbeidet ved å legge til 8 mL 38%, 5 mL 34%, 8 mL 30%, 12 mL 25% (inneholder råolje mitokondrier), 8 mL 23%, og 3 mL 20% tetthet gradient medium fra bunn til topp i et rør. I dette tilfellet var renset mitokondrier i området fra grensesnittet mellom 25% og 30% til grensesnittet mellom 34% og 38% etter sentrifugering (figur 1B, se protokoll trinn 2,13 og 2,14).

Protokollen obatined høykvalitets mitokondrie prøver. Høykvalitets mitokondrie prøver er forutsetningen for kvantitative mitokondrie Proteomikk. Denne studien evaluerte kvaliteten på mitokondrier som ble utarbeidet med differensial-hastighet sentrifugering og tetthet gradient sentrifugering via EM (figur 2) og Western BLOT (WB, Figur 3). EM bilder viste at både i eggstokkene kreft og kontroll eggstokkene vev de viktigste organeller isolert var mitokondrier, med unntak av en liten mengde peroxisomes. Den morfologi av mitokondrier endret mer i eggstokkene kreft enn kontroll eggstokkene vev (figur 2). WB bilder viste at de viktigste komponenten i forberedt mitokondrie prøver fra eggstokkene kreft og kontroll eggstokkene var mitokondrier, med unntak av en liten mengde av peroxisomes (Figur 3). Den WB resultatene var forenlig med EM resultater. Det var rimelig for peroxisomes å være inneholdt i forberedt mitokondrier, fordi mitokondrier samhandle mye med peroxisomes3,17,18, som igjen gjenspeiler funksjonell fullstendighet av mitokondrier. Disse resultatene viste den høye kvaliteten på de forberedte mitokondrie prøvene.

Mengden av mitokondrie protein utarbeidet med denne protokollen var tilstrekkelig for videre analyse. Det er nødvendig å få en tilstrekkelig mengde mitokondrie prøver fra kreft i eggstokkene og kontroll eggstokkene vev. Denne studien kombinerte mitokondrie prøvene fremstilt av syv eggstokkene kreft vev, og fra 11 kontroll eggstokkene vev3. Totalt 2 409 μg av mitokondrie protein prøve ble innhentet for kreft i eggstokkene, og 4 440 mikrogram mitokondrie protein prøve for kontroll eggstokkene vev (tabell 1). Vanligvis, for iTRAQ kvantitative Proteomikk, trenger hvert utvalg minst 600 mikrogram proteiner (200 mikrogram proteiner per hver iTRAQ-merking, 3 replikerer). Derfor var de forberedte mitokondrie protein prøvene tilstrekkelige for iTRAQ kvantitative Proteomikk analyser.

Oppnåelse av maksimalt antall kvantifisert proteiner fordeler den grundige undersøkelse av mitokondrier i humant eggstokkene kreft. Denne studien oppdaget, identifiserte, og kvantifisert 5 115 proteiner i eggstokkene kreft i forhold til kontroll eggstokkene vev, inkludert 2 565 (50,14%) upregulated proteiner (forholdet mellom kreft og kontroller > 1) og 2 550 (49,86%) downregulated proteiner (forholdet mellom kreft og kontroller < 1)3 (tabell 2). Videre, denne studien bestemmes 1 198 mtDEPs mellom eggstokkene kreft og kontroll eggstokkene med > 1.5 eller <-1,5 fold endringer (p < 0,05), inkludert 523 (43,66%) upregulated proteiner og 675 (56,34%) downregulated proteiner4 (tabell 2). Disse dataene er i dag den største mitokondrie proteom profil i eggstokkene kreft.

Figure 1
Figur 1: råolje mitokondrier ble renset med usammenhengende tetthet gradient sentrifugering for eggstokkene kreft (A) og kontroll eggstokkene (B) vev. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Electron mikroskop bilde av mitokondrier isolert fra kreft i eggstokkene (A) og kontroll eggstokkene (B) vev. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: organelle-spesifikke antistoffer-baserte Western Blot-bilder av mitokondrier isolert fra kreft i eggstokkene (A) og kontroll eggstokkene (B) vev. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Mitokondrie protein prøve Volum (μL) Konsentrasjon (μg/μL) Proteiner (μg)
Kreft i eggstokkene 530 4,545 2 409
Kontrollere eggstokkene vev 750 5,92 4 440

Tabell 1: mengden av tilberedte mitokondrie protein prøver.

Kategori Antall totalt proteiner * Antall differensielt uttrykt proteiner#
Opp-regulering 2 565 (50,14%) 523 (43,66%)
Ned-regulering 2 550 (49,86%) 675 (56,34%)
Totalt 5 115 (100,0%) 1 198 (100,0%)
* Ratio av kreft til kontrollene er > 1 for opp-regulering, < 1 for Down-regulering.
# Ratio av kreft til kontroller er > 1.5 fold for opp-regulering, og <-1,5 fold for ned-regulering.

Tabell 2: antall iTRAQ-identifiserte proteiner fra tilberedte mitokondrie prøver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mitokondrie endringer er et kjennetegn på kreft i eggstokkene. Utarbeidelse av høykvalitets mitokondrie prøver fra menneskelige eggstokkene kreft og kontroll vev for stor skala kvantitative Proteomikk fordel den inngående forståelse av mitokondrie funksjon i eggstokkene kreft patogenesen og mitokondrie molekylær nettverksendringer, og bidra til å avklare sin molekylære mekanisme for senere oppdagelse av Target terapi og effektiv biomarkører basert på mitokondrier4,5,8. Differensial-hastighet sentrifugering i kombinasjon med tetthet gradient sentrifugering effektivt isolert og renset mitokondrier fra menneskelige eggstokkene kreft og kontroll eggstokkene vev. De forberedte mitokondrie prøvene var av meget høy kvalitet og var egnet for videre kvantitativ Proteomikk analyse.

De preparerte mitokondrie prøvene inneholdt en liten mengde peroxisomes3,17,18 og cytosolic proteiner19,20. Dette bør ikke bare betraktes som forurensning, fordi de direkte eller indirekte samhandler eller overholder mitokondrier for å la mitokondrier fungere mer fullstendig. Studier har funnet at mitokondrier samhandle mye med utgangen cytoskeleton19,20 og peroxisomes17,18. Det er uunngåelig for noen cytosolic proteiner og peroksisomproliferatoraktiverende proteiner å være inneholdt i isolerte mitokondrie prøver.

Den viktigste teknikken for å oppdage, identifisere og kvantifisere proteiner fra de forberedte mitokondrie prøvene var iTRAQ merking-SCX-LC-MS/MS. Denne studien identifiserte og kvantifisert 5 115 mitokondrie proteiner3, inkludert 1 198 mtDEPs4,14. Den largenumber av mitokondrie proteiner som finnes i eggstokkene kreft vev inkluderer de som kan bidra til å forstå rollen som mitokondrier i eggstokkene kreft patogenesen og også være en ressurs for oppdagelsen av personlig Target Therapy basert på mitokondrie metabolisme8, og selv finne effektive biomarkører basert på mitokondrie Genomics, Proteomikk og Plantemetabolomikk fra en systematisk multi-omics vinkel9,11,12,13. Videre, med innføringen av proteoform og protein arter konsepter i proteom, grundig utforskning av mitokondrie proteoforms eller protein arter kan direkte føre til oppdagelsen av effektive og pålitelige biomarkører og terapeutiske mål for eggstokkene kreft10,21,22.

Videre er dagens protokoller i analyse av humant eggstokkene kreft vev mitokondrie proteomes beskrevet her er lett oversettes til å studere andre menneskelige sykdommen mitokondrie proteomes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Hunan Provincial Hundred talent plan (til X.Z.), den Xiangya Hospital Funds for talent Innledning (til XZ), National Natural Science Foundation i Kina (Grant no. 81572278 og 81272798 til XZ), tilskudd fra Kina "863" plan Prosjekt (Grant no. 2014AA020610-1 til XZ), og Hunan Provincial Natural Science Foundation i Kina (Grant no. 14JJ7008 til XZ). X.Z. unnfanget konseptet for det nåværende manuskriptet, fikk iTRAQ kvantitative Proteomikk data av mitokondrier prøver, skrev og reviderte manuskriptet, koordinerte det relevante arbeidet, og var ansvarlig for den økonomiske støtten og tilsvarende Arbeid. H.L. forberedt mitokondrier prøver. S.Q. deltok i delvis arbeid. X. H. Z deltok i skriftlig og redigert engelsk språk. N.L. analyserte iTRAQ Proteomikk data. Alle forfatterne godkjente det endelige manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCA protein assay kit Vazyme E112 BCA protein assay kit is a special 3-component version of our popular BCA reagents, optimized to measure (A562nm) total protein concentration of dilute protein solutions (0.5 to 20 micrograms/ml).
Bovine serum albumin (BSA) Solarbio A8020-5G Heat shock fraction, Australia origin, protease free, low fatty acid, low IgG, pH 7, ≥98%
Centrifuge XiangYi TDZ4--WS
CHAPS Sigma C9426-5G BioReagent, suitable for electrophoresis, ≥98% (HPLC) (Sigma-Aldrich)
Diamine tetraacetic acid (EDTA) Sigma 798681-100G Anhydrous, free-flowing, Redi-Dri, ≥98%
DTT Sigma 10197777001 1,4-Dithiothreitol
Easy nLC Proxeon Biosystems (now Thermo Fisher Scientific)
Ethylen glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA) Sigma E0396-10G BioXtra, ≥97 .0%
Homogenizer SilentShake HYQ-3110
iTRAQ reagent kit Applied Biosystems Applied Biosystems iTRAQ Reagents–Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A
Low-temperature super-speed centrifuger Eppendorf 5424R
Mannitol Macklin M813424-100G Mannitol is a polyol (polyhydric alcohol) produced from hydrogenation from fructose that functions as a sweetener, humectant, and bulking agent. It has low hygroscopicity and poor oil solvency.
MASCOT search engine Matrix Science, London, UK; version 2.2
Nagarse Solarbio P9090
N-hydroxysuccinimide (SDT) Sigma 56480-25G Purum, ≥97.0% (T)
Nycodenz Alere/Axis-Shield 1002424-1
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) protease inhibitor Solarbio P0100-1ML PMSF is a protease inhibitor that reacts with serine residues to inhibit trypsin, chymotrypsin, thrombin, and papain.
Potassium chloride Macklin P816354-25G Potassium chloride, KCI, also known as potassium muriate and sylvite, is a colorless crystalline solid with a salty taste that melts at 776°C (1420 OF). It is soluble in water, but insoluble in alcohol. Potassium chloride is used in fertilizers, pharmaceuticals, photography, and as a salt substitute.
Proteome Discover 1.4 Matrix Science, London, UK
PVDF membrane Millipore 05317 It is 1 roll, 26.5 cm x 1.875 m, 0.45 µm pore size, hydrophobic PVDF transfer membrane with low background fluorescence for western blotting. It is compatible with visible and infrared fluorescent probes.
Q Exactive mass spectrometer Thermo Fisher Scientific
SCX column Sigma 58997 It is 5-μm particle size, length 5cm × i.d. 4.6mm (Supelco).
Sodium orthovanadate (V) Macklin S817660-25G Sodium orthovanadate (Vanadate) is a general competitive inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. The inhibition by sodium orthovanadate is reversible upon the addition of EDTA or by dilution.
Sucrose Macklin S824459-500G Vetec reagent grade, 99%
Thiourea Sigma 62-56-6 ACS reagent, ≥99.0%
Tris base Sigma 10708976001 TRIS base is useful in the pH range of 7.0-9.0. It has a pKa of 8.1 at 25°C.
Trypsin (cell culture use) Gibco 25200-056 This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation.
Urea Sigma U5378-100G powder, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sakhuja, S., Yun, H., Pisu, M., Akinyemiju, T. Availability of healthcare resources and epithelial ovarian cancer stage of diagnosis and mortality among Blacks and Whites. Journal of Ovarian Research. 10, 57 (2017).
  2. Gadducci, A., et al. Surveillance procedures for patients treated for epithelial ovarian cancer: a review of the literature. International Journal of Gynecological Cancer. 17, 21-31 (2007).
  3. Li, N., Li, H., Cao, L., Zhan, X. Quantitative analysis of the mitochondrial proteome in human ovarian carcinomas. Endocrine-Related Cancer. 25, 909-931 (2018).
  4. Li, N., Zhan, X., Zhan, X. The lncRNA SNHG3 regulates energy metabolism of ovarian cancer by an analysis of mitochondrial proteomes. Gynecologic Oncology. 150, 343-354 (2018).
  5. Li, N., Zhan, X. Signaling pathway network alterations in human ovarian cancers identified with quantitative mitochondrial proteomics. EPMA Journal. 10, 153-172 (2019).
  6. Deng, P., Haynes, C. M. Mitochondrial dysfunction in cancer: Potential roles of ATF5 and the mitochondrial UPR. Semin Cancer Biology. 47, 43-49 (2017).
  7. Georgieva, E., et al. Mitochondrial dysfunction and redox imbalance as a diagnostic marker of "free radical diseases". Anticancer Research. 37, 5373-5381 (2017).
  8. Sotgia, F., et al. A mitochondrial based oncology platform for targeting cancer stem cells (CSCs): MITO-ONC-RX. Cell Cycle. 17, 2091-2100 (2018).
  9. Lee, J. H., et al. Individualized metabolic profiling stratifies pancreatic and biliary tract cancer: a useful tool for innovative screening programs and predictive strategies in healthcare. EPMA Journal. 9, 287-297 (2018).
  10. Zhan, X., Long, Y., Lu, M. Exploration of variations in proteome and metabolome for predictive diagnostics and personalized treatment algorithms: Innovative approach and examples for potential clinical application. Journal of Proteomics. 188, 30-40 (2018).
  11. Lu, M., Zhan, X. The crucial role of multiomic approach in cancer research and clinically relevant outcomes. EPMA Journal. 9, 77-102 (2018).
  12. Hu, R., Wang, X., Zhan, X. Multi-parameter systematic strategies for predictive, preventive and personalised medicine in cancer. EPMA Journal. 4, 2 (2013).
  13. Cheng, T., Zhan, X. Pattern recognition for predictive, preventive, and personalized medicine in cancer. EPMA Journal. 8, 51-60 (2017).
  14. Zhan, X., Zhou, T., Li, N., Li, H. The differentially mitochondrial proteomic dataset in human ovarian cancer relative to control tissues. Data in Brief. 20, 459-462 (2018).
  15. McMillan, J. D., Eisenback, M. A. Transmission electron microscopy for analysis of mitochondria in mouse skeletal muscle. Bio-protocol. 8, e2455 (2018).
  16. Paul, P. K., et al. Targeted ablation of TRAF6 inhibits skeletal muscle wasting in mice. Journal of Cell Biology. 191, 1395-1411 (2010).
  17. Pascual-Ahuir, A., Manzanares-Estreder, S., Proft, M. Pro- and antioxidant functions of the peroxisome-mitochondria connection and its impact on aging and disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 9860841 (2017).
  18. Schrader, M., Costello, J., Godinho, L. F., Islinger, M. Peroxisome-mitochondria interplay and disease. Journal of Inherited Metabolic Disease. 38, 681-702 (2015).
  19. Bartolák-Suki, E., Imsirovic, J., Nishibori, Y., Krishnan, R., Suki, B. Regulation of mitochondrial structure and dynamics by the cytoskeleton and mechanical factors. International Journal of Molecular Sciences. 18, 1812 (2017).
  20. Rezaul, K., Wu, L., Mayya, V., Hwang, S., Han, D. A systematic characterization of mitochondrial proteome from human T leukemia cells. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 169-181 (2005).
  21. Zhan, X., et al. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome? Electrophoresis. 39, 965-980 (2018).
  22. Zhan, X., Li, N., Zhan, X., Qian, S. Revival of 2DE-LC/MS in proteomics and its potential for large-scale study of human proteoforms. Med One. 3, e180008 (2018).

Tags

Kreftforskning kreft i eggstokkene mitokondrier differensial-Speed sentrifugering tetthet gradient sentrifugering isobar tag for relative og absolutte kvantifisering (iTRAQ) merking sterk signal utveksling (SCX) flytende kromatografi (LC) tandem masse massespektrometri (MS/MS) mitokondrie proteom
Utarbeidelse av mitokondrier fra eggstokkene Cancer vev og kontroll eggstokkene vev for kvantitativ Proteomikk analyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhan, X., Li, H., Qian, S., Zhan,… More

Zhan, X., Li, H., Qian, S., Zhan, X., Li, N. Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis. J. Vis. Exp. (153), e60435, doi:10.3791/60435 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter