Summary
정보 부호화 된 펩토이드 올리고머의 합성과 동적 공유 반응체 쌍 및 루이스 산성 희토류로 아민과 알데히드를 사용하여 분자 사다리로 이러한 펩토이드의 시퀀스 지시자가 조립하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 다중 역할 시약으로 금속 triflates.
Abstract
이 프로토콜은 상호 보완적인 핵산 서열의 자가 조립을 위해 일반적으로 사용되는 열 사이클링을 모방하는 방식으로 쌍으로 결합된 동적 공유 상호 작용에 의해 매개된 정보 인코딩된 올리고머릭 가닥의 자가 조립 중에 관찰된 운동 트래핑을 우회하기 위해 Lewis acidic 다역할 시약을 사용하는 것을 제시합니다. 알데히드와 아민 펜던트 모이티를 베어링하는 1차 아민 단량체는 동적 공유 반응제 쌍으로 사용하기 위해 직교 보호 그룹과 함께 기능화됩니다. 변형된 자동화된 펩타이드 신디사이저를 사용하여, 1차 아민 단량체는 고체 상 서브모노머 합성을 통해 올리고(peptoid) 가닥으로 인코딩된다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의한 정제와 전기 분무 이온화 질량 분석법(ESI-MS)에 의한 특성화시, 서열 특이적 올리고머는 알데히드 모에이티를 탈피하고 완전히 드란에 있는 반응물 쌍 평형에 영향을 미치는 루이스 산성 희토류 금속 트리플랫의 고부하를 받게 된다. 그 후, 루이스 산의 일부가 추출되어 상보적 서열 특이적 가닥의 어닐링이 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 질량 분석법(MALDI-MS)을 특징으로 하는 정보 부호 분자 사다리를 형성할 수 있게 합니다. 이 보고서에 설명된 간단한 절차는 동적 공유 어셈블리 분야에서 일반적으로 경험되는 운동 트랩을 우회하며 견고하고 복잡한 아키텍처의 미래 설계를 위한 플랫폼 역할을 합니다.
Introduction
소규모 서브유닛이 열역학적 구동 경로를 통해 더 큰 아키텍처를 생성하는 자체 조립 공정은 π-스태킹 및 수소결합1,2,3,4와같은 분자 간 상호 작용을 일반적으로 활용하여 일반적으로 거시 및 초분자 나노 구조에 대한 향상된 제어를 제공했습니다. 특히, 핵산(즉, 폴리뉴클레오티드)은 왓슨크릭 염기 페어링에 의해 제공되는 높은 정보 밀도로서 놀랍도록 다재다능한 나노 시공 매체로 등장하여 복잡하고 서열 선택적구조4,5의조립을 허용한다. 이러한 과도 분자 간 결합의 본질적으로 낮은 강도는 하위 단위 재배열 및 오류 보정을 가능하게하는 반면, 결과 구조는 종종 열 및 기계적열화에 취약합니다 6. 대조적으로, 동적 공유 상호 작용7,8,9,온화한 조건하에서 가역적이거나 재배열 할 수있는 공유 결합 형성 반응의 클래스는 최근 사다리10,11, 12,13,케이지14,15,16및 스택17과같은 복잡한 거대 분자를 산출하기 위해 채택되었습니다. 결합 강도와 견고한 구조를 증가시켰습니다. 불행하게도, 이러한 공유 종의 비교적 낮은 재배열 비율에 의해 재배열 및 오류 확인을 위한 용량이 감소되고, 원하는 제품으로 자체 조립을 위한 그들의 용량을 감소시켰다18. 이러한 운동 트랩핑을 해결하기 위해 촉매 또는 가혹한 반응 조건은 종종 간단한 빌딩 블록과 함께 활용됩니다. 여기서, 우리는 올리고머 잔류 서열에 인코딩된 정보에 의해 혼성화가 지시되는 서열 특이적 올리고머로부터 분자 사다리의 자가 조립을 가능하게 하기 위해 운동 트래핑을 우회하는 과정을 보고한다.
이들의 합성 접근성을 감안할 때, 폴리(N-치환 글리신)s(즉, 펩토이드)는 분자 사다리가 조립되는 올리고머 전구체로서19가지로사용된다. 펩토이드는 펩타이드의 구조적 이소메로, 펜던트 그룹은 α-탄소20과결합되는 대신 백본 매개 질소에 부착된다. 고체 상 합성을 사용하여 펩토이드 사슬을 따라 동적 공유 펜던트 그룹의 정확한 배치가 용이하게 달성되어 복잡한 상분자 구조(21)로조립 할 수있는 전구체 올리고머의 설계가 가능합니다.
imine 연결성의 동적 공유 배열은 imine 발생 응축 반응이 각 결합형성으로 질량 분석법에 의해 자가 조립을 특성화하는 편리한 수단을 제공함에 따라 이 절차에서 사용되어 18 g/mol22의질량 감소를 초래한다. 더욱이, 아민과 알데히드 반응물 및 이민 생성물 사이의 평형은 산 농도를 변화시킴으로써 변화될 수 있다. 구체적으로, 희토류 금속 트리플랫은 평형에 영향을 미치고, 에틸렌 아세탈 보호 알데히드23,24,25를추가로 탈보호하는 데 사용된다. 참고로, 스산듐 트리플랫은 이미 상온26,27에서공유 유기 프레임워크(COF)의 합성을 돕는 최근의 성공을 포함하여 동적 공유 자성 조립 분야에서 일반적으로 사용되고 있다. 또한, 올리고 (펩토이드) 서열과 희토류 금속 triflate의 대조 용해도는 액체 - 액체 추출을 통해 평형 제어를 가능하게한다. 보고된 프로세스는 이 제어를 사용하여 정보 지향자가 조립하는 것을 방지하는 운동 장벽을 우회합니다.
Protocol
주의: 이 프로토콜에 사용되는 여러 화학 물질은 부식성, 인화성 또는 독성이 있으며 화학 적 연기 후드 에서만 사용해야합니다. 사용하기 전에 적절한 개인 보호 장비를 사용하고 모든 관련 안전 데이터 시트 (SDS)를 참조하십시오.
1. 단량체 합성
참고 : 기본 아민은 게시 된 접근 방식에 따라 합성되었다.
- 합성 4-(2-아미노에틸)-N-(알모알카보닐록시)페닐알라민(Npam)25,28
- 10% 아세트산(수성 용액, v/v)의 150 mL에 4-(2-aminoethyl) 애니린 5.0 g(36.7 mmol)을 추가합니다.
참고: 약한 산의 사용은 두 그룹 사이의 pK값의 큰 차이로 인해 종방향 아민에 영향을 주지 않고 방향족 아민의 선택적 보호를 가능하게 한다. - 1,4-다이옥산 150 mL에서 4.9 g (40.4 mmol; 1.1 equiv.) 알릴 클로로포메이트의 용액을 준비합니다.
- 마그네틱 교반 바가 장착된 500 mL 라운드 바닥 플라스크에 용액을 결합하고 밤새 실온에서 반응 혼합물을 저어줍니다.
- 반응을 하기 위해, 500 mL의 탈이온화(DI) 물로 희석하고 디에틸 에테르(Et2O, 300 mL × 3)로 세척한다. 유기 분수를 폐기하십시오.
- 2 M NaOH(수성 용액)를 첨가하여 수성 상을 pH 14로 조정하고, Et2O(150 mL ×3)로 추출한다.
- 유기 분획을 결합하고 DI 물 (150mL × 3)으로 씻으하십시오.
- Na2SO4를통해 건조 한 다음 필터.
- 감소된 압력하에서 건조로 증발합니다.
- 핵 자기 공명 (NMR) 분광학에 의해 고립 된 제품, Npam의신원을 확인합니다. 다음 결과를 기대: 1H NMR (500 MHz, CdCl3) δ: 7.31 (d, J = 8.0 Hz, 2H, Ar), 7.14 (d, J = 8.5 Hz, 2H, Ar), 6.65 (s, 1H, -NH-), 6.04 - 5.89 (m, 1H,-C=- C36,C3 J = 17.1, 1.6 Hz, 1H, -CH = CH,5.26 (dq, J = 10.5, 1.4 Hz, 1H, -CH = CHH),4.66 (dt, J = 5.8, 1.5 Hz, 2H, -CH2-CH = CH2),2.94 (t, J 6 H, H H, H H, H 2-NH2),2.70 (t, J = 6.8 Hz, 2H, -CH2-Ar), 1.04 (s, 2H, -CH2-NH2). 13세 C NMR (125 MHz, CD3OD) δ: 154.85, 137.00, 134.98, 133.51, 129.36, 119.41, 116.92, 65.62, 59.89, 43.47, 38.72.
참고 : 제품은 밝은 노란색 고체이며 전체 수율은 69 %입니다. 더 이상 정제하지 않고 제품을 사용하십시오.
- 10% 아세트산(수성 용액, v/v)의 150 mL에 4-(2-aminoethyl) 애니린 5.0 g(36.7 mmol)을 추가합니다.
- 합성 4-(1,3-다이옥사시클로펜트-2-yl)벤조니트릴29,30
- 톨루엔 200 mL에 4-시아노벤잘데히드 25g(0.19 몰)을 녹입니다.
- 에틸렌 글리콜 42.2 mL (0.768 mmol; 4 equiv.)와 0.02 g (0.1 mmol; 0.05 mol%)을 추가하십시오. 반응 혼합물에 톨루엔-p-설포닉산.
- 120°C에서 밤새 교반하고 반응 중에 생성된 물을 제거하기 위해 딘 스타크 트랩(즉, 아제오트로픽 증류)을 이용하여 역류한다.
- 반응이 완료되고 실온으로 냉각된 후, 40 mL의 5% NaHCO3(v) 수성 용액을 추가합니다.
- 유기층을 추출하고 DI 물로 3회 세척한다.
- Na2SO4를통해 건조 한 다음 필터.
- 감소된 압력하에서 건조로 증발합니다.
- NMR 분광법에 의해 분리된 제품의 신원을 확인합니다. 다음 결과를 기대: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.67 (d, J = 8.0, 2H, Ar), 7.59 (d, J = 8.4, 2H, Ar), 5.84 (s, 1H, CH), 4.12 - 4.03 (AABB, 4H, (Ch2). 13세 C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 143.20, 132.34, 127.30, 118.72, 113.02, 102.56, 65.57.
참고 : 제품은 흰색 결정 고체이며, 86 %의 전체 수율을 갖는다. 더 이상 정제하지 않고 제품을 사용하십시오.
- 4-(1,3-디옥사시클로펜트-2-yl)벤질라민(Npal)29의 합성
- 무수 Et2O의 100 mL에서 4-(1,3-다이옥사시클로펜트-2-yl)의 10 g(0.057 몰)의 용액을 준비한다.
- 0°C에서 둥근 바닥 플라스크에 LiAlH 4~100 mL의 무수 Et2O의 4.3 g(0.11 mol; 2 equiv.)을 조심스럽게 추가합니다. 잘 혼합 된 서스펜션을 만들고 아르곤 채워진 풍선을 사용하여 불활성 분위기에서 시스템을 밀봉하기 위해 저어. 계량에 사용되는 장비의 잔류 LiAlH4는 에탄올로 조심스럽게 담금질합니다.
주의: 리튬 알루미늄 수소화물 (LiAlH4)은온화한 열화입니다. 불활성 가스 에서 처리하 고 습기로부터 보호 합니다. - 반응 혼합물을 0°C의 온도에서 유지하면서 4-(1,3-다이옥사시클로펜트-2-yl) 벤조니트릴 용액을 추가깔때기 또는 주사기 펌프를 사용하여 천천히 첨가한다.
- 반응 혼합물을 0°C에서 4시간 동안 저은 다음 실온에서 12시간 후.
- 반응이 완료되고 0°C로 냉각된 후, 천천히 95% 에탄올(30 mL)을 첨가한다. 물에 50 % 에탄올을 추가하여 더 담금질 (v / v, 20 mL). 버블러를 사용하여 담금질 공정을 모니터링할 수 있습니다.
참고: 적절한 교반 속도를 유지하기 위해 필요에 따라 무수 Et2O를 추가합니다. - 에테르 상류를 분리하고 감소 된 압력하에서 건조로 증발시다.
- 0.45 μm 주사기 필터를 통해 결과 오일을 걸링합니다.
- NMR 분광법에 의해 분리된 제품 인 NpaI의신원을 확인합니다. 다음 결과를 기대합니다: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.44 (d, J = 8, 2H, Ar), 7.32 (d, J = 8, 2H, Ar), 5.80 (s, 1H, CH), 4.14 - 4.0(AABB ', 4H,(CH2O)2),3.87 (s, 2H,-CH2). 13세 C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 144.53, 136.53, 127.16, 126.77, 103.72, 65.39, 46.35.
참고 : 제품은 노란색 오일이며 전체 수율은 70 %입니다. 더 이상 정제하지 않고 제품을 사용하십시오.
- 2-(2-에톡시에톡시)에틸 토실레이트29,31의 합성
- 20 g (0.15 mol) 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르와 50 mL의 테트라 하이드로 푸란 (THF)을 자기 교반기로 250 mL 둥근 바닥 플라스크에 넣습니다.
- 0°C까지 냉각하고 아르곤 충전 풍선을 사용하여 불활성 분위기하에서 시스템을 밀봉합니다.
- 6M 수성 NaOH(2 equiv.)의 50mL를 추가합니다.
- THF 80 mL에 54 g (0.28 mol; 2 equiv.)의 토실 염화물을 용해시키고 반응 혼합물에 용액을 떨어 뜨립니다. 0°C에서 1시간 동안 저어주세요.
- 반응 혼합물이 실온에 도달하고 또 다른 시간 동안 저어 줍니다.
- Et2O(400 mL)로 반응 혼합물을 추출한다.
- 유기층을 1 M NaOH로 씻은 다음 DI 물로 씻습니다.
- Na2SO4를통해 건조 한 다음 필터.
- 감소된 압력하에서 건조로 증발합니다.
- NMR 분광법에 의해 격리된 제품의 신원을 확인합니다. 다음 결과를 기대: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.78 (d, J = 8.0, 2H, -S-C = CH-CH),7.33 (d, J = 8.5, 2H, -S-C = CH-CH),4.15 (t, J = 5.0, 2H, -CH2-C H2-O-Ts), 3.68 (t, J =5.0, 2H, CH2-CH2-O-Ts), 3.60-3.42 (m, 6H, O-CH2-CH2-CH3),2.43 (s, 3H, 3H, 3H, 3H, 3H C-CH3),1.17 (t, J = 7.0, 3H, O-CH2-CH3). 13세 C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 144.79, 132.95, 130.26, 129.80, 127.90, 126.95, 70.75, 69.68, 69.29, 68.61, 66.57, 21.56.
참고 : 제품은 무색 액체이며 전체 수율은 98 %입니다. 더 이상 정제하지 않고 제품을 사용하십시오.
- 2-(2-에톡시에톡시)에틸 아지드29,31의 합성
- 2-(2-에톡시에톡시)의 40 g(0.14 몰)을 자기 교반기로 둥근 바닥 플라스크에 디메틸포르마미드(DMF)의 250 mL에 용해시다. 아르곤이 채워진 풍선을 사용하여 불활성 분위기에서 시스템을 밀봉하십시오.
- 반응 혼합물에 NaN3의 32 g (0.49 mol; 3.5 equiv.)을 추가합니다.
주의: NaN3의무게를 측정할 때는 금속 주걱을 사용하지 마십시오. NaN3는 납 및 구리와 반응하여 매우 폭발성이 높은 금속 아지드의 형성을 초래할 수 있습니다. 삼키거나 피부에 닿으면 급성 독성이 있으며 치명적입니다. - 반응 혼합물을 60 °C로 가열하고 36 시간 동안 실행하십시오. 그런 다음 실온으로 식힙니다.
- 다량의 물 (500 mL)으로 희석하고 Et2O (150 mL × 3)로 추출하십시오.
- 유기층을 분리하고 물 세안을 수행합니다.
- Na2SO4를통해 건조 한 다음 필터.
- 감소된 압력하에서 건조로 증발합니다.
- NMR 분광법에 의해 격리된 제품의 신원을 확인합니다. 다음 결과를 기대: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 3.64 (m, 4H, O-CH2-O-O), 3.58 (m, 2H, N3-CH2-CH2-O), 3.51 (q, J = 7.5, 2H, O-CH2-CH3),3.38 (t, J = 5.0, 2H, N3-CH2-CH2-O), 1.19 (t, J = 7.5, 3H, O-CH2-C3). 13세 C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 70.70, 69.97, 69.80, 66.63, 50.60, 15.08.
참고 : 제품은 노란색 액체이며 전체 수율은 85 %입니다. 더 이상 정제하지 않고 제품을 사용하십시오.
- 2-(2-에톡시에톡시)에틸라민(니)29,31의 합성
- 2-(2-에톡시에톡시)에 160 mL의 THF에 20 g(0.13 몰)을 용해하여 500 mL 라운드 바닥 플라스크에 마그네틱 교반기로 용해시다.
- 트리페닐포스핀 40g(0.15 몰, 1.1°C.)을 넣고 아르곤 에서 실온에서 밤새 저어줍니다.
- 반응 혼합물을 물(220 mL)으로 담금질하고 다른 날 저어줍니다.
- 생성된 용액을 톨루엔으로 세척한 다음 디클로로메탄(DCM)을 세척합니다.
- 진공 하에서 수성 층을 증발시.
- NMR 분광법에 의해 분리 된 제품 인 Neee의신원을 확인하십시오. 다음 결과를 기대: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 3.62-3.42 (m, 8H, NH2-CH2-CH2-O-CH2-O-CH2-CH3),2.82 (m, 2H, NH2-CH2-CH2-O),1.48 (s, 2H, NH2),1.16 (t, J = 7.5, 3H, O-CH2-CH 3). 13세 C NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 73.14, 70.72, 69.64, 66.45, 41.35, 15.00.
참고 : 제품은 노란색 액체이며 전체 수율은 58 %입니다. 더 이상 정제하지 않고 제품을 사용하십시오.
2. 올리고의 고체 상 서브 모노머 합성 (펩토이드)
참고 : 고체 상 합성 (SPS)에 대한 서브 모노머 접근법은 높은 결합 효율로 서열 별 올리고머의 생산을 가능하게하기 때문에 사용되었습니다. 자동화된 펩티드 신디사이저는 올리고(peptoids)를 빠르게 생성하도록 적응하였다. 설정은 다른 계측에 대한 수정이 필요할 수 있습니다.
- 준비
- Fmoc-Photolabile SS 수지 0.125 g의 무게 (0.8 mmol / g 일반적인 로딩, 0.1 mmol 스케일, 100-200 메쉬, 1 % DVB)를 넣고 프릿티드 자동화 신디사이저 반응 용기에 추가하십시오. 용기를 신디사이저의 전자레인지 부분에 삽입합니다.
- 메인 용매 병을 DMF와 디프로텍션 병으로 채우고 DMF(v/v)에 20% 4-메틸피리딘을 채웁니다. 빈 폐기물.
- 총 부피가 1.5 mL × +5 mL로 DMF에서 브로모아세트산 및 N,N'-diisopropylcarbodiimide (DIC)의 1 M 용액을 준비합니다. 추가 5mL는 공기가 기계에 유입되지 않도록 합니다. DMF에 0.47 mL의 아세트산 무수화물을 추가하여 5mL 캡핑 솔루션을 만듭니다.
주의: DIC는 심각한 눈 손상, 피부 자극 및 과민, 호흡기 자극 및 과민반응을 일으킬 수 있습니다. - 변위 단계에 사용되는 N-메틸-2-피롤리돈(NMP)에서 각 1차 아민(Npam, Npal, Neee 및 Nma(2-메톡시에틸라민))의 0.5M 용액을 준비한다. 1차 아민 액의 총 부피는 2.5 mL × (적절한 1차 아민의 잔류물 수) + 2.5 mL이어야 한다.
- 자동화된 신디사이저 매니폴드에 모든 솔루션을 추가합니다.
- 합성
참고 : 자동화 된 펩티드 신디사이저를 사용하여 수행합니다.- DMF 10 mL로 실온에서 5 분 동안 수지팽창. 반응 용기를 빼내십시오.
- 75°C에서 30s, 90°C에서 30s에 대해 20% 4-메틸피리딘 용액의 3 mL로 Fmoc 그룹을 갈라. 용기를 빼내십시오. 반복. DMF로 세척하십시오 (2mL × 2).
- 브로모아세트산 용액의 용기 1.5 mL및 DIC 용액의 1.5 mL를 첨가한다. 브로모아세틸화 반응을 수행하기 위해 75°C에서 4.5분 동안 반응을 가열한다. 수 지 (DMF × 3 의 5 mL)를 씻어 주세요.
- 반응 용기에 2.5 mL 1차 아민 단량액용액을 첨가하여 변위 반응을 수행한다. 75 °C에서 4.5 분 동안 가열하십시오.
- 2.2.3단계를 반복합니다. 및 2.2.4. 2.2.4단계에서 사용되는 1차 아민 단량체를 순차적으로 치장하면서. 서열별 방식으로 올리고(펩토이드) 사슬을 성장시킬 수 있다.
- 최종 변위 단계 후, 아세트탄 무수드 용액의 2.5 mL 및 DIC 용액의 2 mL를 첨가하여 서열을 캡. 50°C에서 2분 동안 가열합니다.
- 3방향 스톱콕이 장착된 프릿드 유리 반응 용기에 수지를 옮김을 옮김으로 옮니다. 유리 반응 용기는 이전에 구슬이 벽에 접착되는 것을 방지하기 위해 실리콘화되어야합니다. 상단에 디클로로에탄 (DCE) (v /v) 용액에 5 % 디클로로 디클로로 메틸실란으로 용기를 채우고 30 분 동안 앉아있게하여 벽을 실라. 용기를 배출하고 DCE와 메탄올로 씻어. 사용하기 전에 건조 유리 용기.
- DCM (5 mL × 3)으로 수지세척하고 N2로 한 쪽 팔로 버블링하고 다른 팔로 진공을 당깁니다.
- 수지및 부착된 올리고(peptoid)를 탈방 및 분열까지 건조 및 보관한다.
- 수지에서 알록 아민 보호 및 분열
- 수지가 하루 이상 보관된 경우, 5 mL의 DMF로 10분 동안 버블링하여 수지의 수를 재조정합니다. 그런 다음 용기를 배수하고 작은 자기 교반 바를 추가합니다.
- 유리 펩타이드 용기에 3 mL의 건조 DCM을 추가합니다.
- 테트라키스(트리페닐포스핀) 팔라듐(0) 및 알록그룹당 페닐실란 25등가의 0.1등가를 계량한다. 클램프를 사용하여 반응 용기를 교반판 위에 위치하여 용매에 매달려 있는 동안 수지가 완만하게 교반되도록 합니다. DCM이 증발하는 것을 방지하기 위해 반응 용기를 캡하십시오.
- 1 시간 후, 용액을 걸레질하고 DCM (3 × 5 mL)으로 수지세척하십시오.
- 2.3.2단계를 반복합니다. 및 2.3.3.
- 수지와 메탄올 및 DCM을 두 번 순차적으로 헹구다.
- 수지 와 자기 교반 막대를 20 mL 바이알로 옮김.
- DMF에서 수지에 침수, 교반, 및 405 nm와 약 25 mW.cm-2에서 36 시간 동안 조사하에 갈라. 수지의 작은 부분은 아민의 완전한 Alloc 보호를 보장하기 위해이 단계 전에 ESI-MS를 변형및 특징화 할 수 있습니다. Alloc 그룹이 남아 있으면 2.3.2 및 2.3.3 단계를 반복합니다.
- 주사기 필터를 통해 수지에서 해방 된 올리고 (펩토이드)를 분리하십시오. 진공 상태의 용매를 제거합니다.
- 올리고의 정화 및 특성화 (펩토이드)
- 펩토이드를 50/50의 물/아세토니트릴 혼합물로 재구성합니다.
- 역상 준비 HPLC (C18)로 정화하십시오. 정제된 분획, 동결 및 동결을 결합하여 백색 분말을 생성합니다. 분말은 추가 사용을 위해 저장될 수 있다.
- 정제 후 ESI-MS로 분석합니다.
- 리플렉트론 포지티브 이온 모드에서 MALDI 질량 분석법을 수행합니다. 아세토니트릴 200 μL에서 샘플 용액(1 mM)의 용액 2 μL을 10 mg의 매트릭스 [2-(4-hydroxyphenylazo)벤조산(HABA)]의 혼합물6 μL과 혼합한다. MALDI 샘플 플레이트에 놓고 공기가 건조되도록 하십시오.
- 순도를 위해 정제 된 올리고 (펩토이드)의 분석 HPLC를 수행하십시오.
3. 시퀀스 선택 적 사다리 자체 조립
-
해리/추출/어닐링을 통한 자체 조립
- 자가 조립에 사용되는 각 올리고(peptoid) 서열의 10mMM 스톡 솔루션과 무수 아세토니트릴에서 스칸듐 트라이플랫(Sc(OTf)3)의10 mM 스톡 용액을 준비합니다.
- 마그네틱 교반 바가 장착된 3 mL 바이알에 각 펩토이드 스톡 용액의 20 μL을 추가합니다. 주식 솔루션에서 잠재적 인 imine 채권 당 Sc (OTf)3 의 1.5 eq를 추가하십시오. 충분한 물과 아세토니트릴을 첨가하여 물/아세토니트릴 용액 합계의 200 μL 2%(v/v)를 형성합니다.
- 알데히드의 아세탈 방지 및 모든 가닥의 해리를 위해 70 °C에서 2 시간 동안 부드럽게 저어줍니다.
- 200 μL의 클로로포름과 2 mL의 물로 바이알을 충전합니다. 부드럽게 흔들어 주세요.
- 혼합물을 (적어도 15 분) 방치하고, 완전한 상 분리 시, 마이크로 리터 주사기로 유기 층을 추출합니다.
- 올리고머 어닐링을 위해 70°C에서 새로운 바이알을 저어, 전형적으로 6h. 사다리 혼성화는 또한 실온에서 수행될 수 있지만 더 긴 기간에 걸쳐 수행될 수 있다.
-
자체 조립 종의 특성화
- 3.1.3., 3.1.5. 및 3.1.6 단계 후에 반응 혼합물 용액에서 MALDI-TOF 질량 분석법을 수행합니다. 을 사용하여 반응을 모니터링합니다. 혼성화가 불완전한 경우, 스톡 솔루션에서 잠재적 이민 결합당 Sc(OTf)3의 1.5 eq를 추가하고 3.1.3-3.1.6 단계를 반복합니다. 완료될 때까지.
- 꾸준한 질소 흐름 하에서 시료를 건조시키고 2% 질산(수성 용액, v/v)의 1 mL로 재구성합니다. 희석 4 × 106-HPLC 물로 접어. 유도적으로 결합된 플라즈마 질량 분석법(ICP-MS)으로 추출 후 스칸디움 농도를 결정합니다.
Representative Results
분자 사다리로 서열 선택적 동적 공유 자기 조립을 겪는 정보 인코딩 된 펩토이드의 능력을 입증하기 위해, 대표적인 가닥, H2N-[Npam-Neee-Npal-Neee] 2-Npam-Nma, 그 상보적인 펩토이드 서열로 합성 및 혼성화되었다. 단량체 Npam 및 Npal(특징 1H NMR (500 MHz), 도 1)은최종 자체 조립 제품의 용해도를 돕는 Neee와 동적 공유 반응기 쌍으로 사용되었다. 부가적으로, 시판되는 Nma 단량체의 혼입은 두 상보적 서열 들 사이의 질량 분화를 가능하게 한다. 고체 상 서브모노머 합성이 완료되면, Alloc-group은 Pd(PPh3)4로제거하였다. 탈보호 전후, 수지의 일부를 405 nm 빛 이하로 절개하고 ESI-MS(도2)를특징으로 한다. 서열을 Prep HPLC에 의해 정제하고, 백색 분말을 달성하기 위해 동질화하고, 순도를 분석HPLC로 확인하였다(도3). 올리고(peptoid)는 이후 그 상보적인 서열,H2N-[Npal-Neee-Nam-Neee] 2-Npal, MALDI-MS에 의해 확인된 레지스트리 사다리를 감당하기 위해 혼성화되었다(그림4).
그림 1: 단량체 합성 계획 및 1H-NMR 스펙트럼. (A) 시약 및 조건이있는 단량체 합성 계획 : (i) 아릴 클로로 포메이트, 10 % 수성 아세트산, 1,4 -다이옥산, 실온, 하룻밤; (ii) 에틸렌 글리콜, 톨루엔-p-설포닉산, 톨루엔, 환류, 하룻밤; (iii) LiAlH4,무수 Et2O, 0°C 에 대해 4시간 동안, 12시간 동안 실온; (iv) 토실 염화물, THF, 0°C; (v)NaN3,DMF, 60 °C, 36 시간; (vi) 트리페닐포스핀, THF, 하룻밤. (b) 단량체 1H-NMR 스펙트럼 (500 MHz, CDCl3): (i) 4-(2-아미노에틸)-N-(알모카르보닐옥시)페닐알라민(Npam); (ii) 4-(1,3-디옥사시클로펜트-2-yl)벤질라민(Npal); (iii) 2-(2-에톡시에톡시)에틸아민(Neee). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 서열 특이적 올리고(펩토이드)의 합성 및 보호 해제. (A) H2N-[Npam-Neee-Npal-Neee] 2-Npam-Nma 전후의 구조 (B) ESI 질량 스펙트럼을 동반한 Alloc-보호 군 제거. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 정보 인코딩된 펩토이드의 정제 및 특성화. (a) 아세토니트릴(MeCN) 및 물의 선형 구배를 가진 예비 HPLC에 의한 가닥 정제의 HPLC 크로마토그램: (1) 30% MeCN, 0.1-2.1 분; (2) 30-95% MeCN, 2.1-16.1 분; (3) 95% MeCN, 16.1-23.1 분; (4) 95% MeCN, 23.1-26.1 min. Peaks i 및 ii는 각각 원하는 생성물을 포함하는 저분자 반응 부산물, 주로 DIC-우레아 및 올리고머 종에 해당한다. (B) 분석적 HPLC 크로마토그램 및 (C) ESI 질량 스펙트럼H2N-[Npam-Neee-Npal-Neee] 2-Npam-Nma 후 동포화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: H2N-[Npam-Neee-Npal-Neee] 2-Npam-Nma 및 그 상보적 서열, H2-[Npal-Neee-Nam-Neee]2-Npal의자체 조립. (A) 두 서열및 결과 시퀀스 구동 어셈블리의 구조. (b) 하룻밤 동안 실온에서 어닐링을 한 후 분자 사다리의 MALDI 질량 스펙트럼. 질량: 예상 [M +Na]+ = 3306.7, 발견 3306.0; 예상[M-1 imine+Na]+ = 3324.7, 발견 3323.9; 예상[M-2 imine +Na]+ = 3342.7, 발견 3342.8; 예상[M-2 imine + CH3OH + H]+ = 3352.8, 발견 3352.0. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
본 명세서의 기술은 정보가 펜던트 그룹의 순서대로 인코딩되는 정보 베어링 펩토이드 올리고머의 동적 공유 어셈블리를 설명합니다. 에틸렌 아탈 보호 알데히드 단량체와 함께 Alloc 보호 아민 단량체를 사용하면 직교 차단이 가능하여 자체 조립 반응 중에 비드 및 아세트탈 보호에 대한 Alloc 보호 가 가능하므로 합성 된 서열이 올리고머 화 및 특성화 이전에 조기에 반응하지 않도록합니다. 중요한 것은, 고체 상 합성은 UV 또는 보라색 광 조사 하에 비드로부터 올리고머 절단을 가능하게 하기 위해 광라빌 수지(photolabile resin)를 사용하여 수행되며, 산-비질, 에틸렌 아세탈 계 보호 군의 조기 보호를 배제한다. 몇 가지 대체 보호 해제 체계가 고려될 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 처음에 이중 산-비질 보호 기(Boc-amine 및 에틸렌 아세탈-알데히드)를 강한 산에 의한 초기 탈방의 의도로 채택하고 중화하여 자가 조립 반응이 진행될 수 있도록 하였다; 그러나, 이 접근법은 염기의 첨가시 침전물의 즉각적인 생성을 초래했다. 대안적으로, 광나래빌 보호기인 2-(2-니트로페닐)의 프로실카보닐(NPPOC)을 가진 아민의 보호는, 알데히드가 정제 전에 삼불화산(TFA)으로 처리될 때 선택적으로 탈보호될 수 있는 것으로 구상되었다. 불행하게도, UV 광을 가진 보호 기의 상태 광용해에서도 광감작제의 존재 및 연장 된 조사 기간25후 양적 보호를 감당하지 못했다. 트리메틸릴레톡카보닐(즉, Teoc)은 아민 보호그룹으로 사용될 수 있으며 희토류 금속 트리플랫으로 처리시 분열을 당할 수 있습니다. 그러나 정량적 Teoc 보호는 에틸렌 아세탈 보호에 필요한 것보다 훨씬 더 높은 희토류 금속 트리플랫 하중을 필요로 합니다. 이 프로토콜의 경우, Teoc-amines가 사용될 수 있지만, 루이스 산 농도는 서브 정량적 아민 보호가 더 큰 자가 조립 구조에 문제가 될 수 있기 때문에 그에 따라 조정되어야 합니다. 알리파틱 작용기는 간략하게 고려되었으나, 알데히드의 보호를 해제하려면 펩티드 서열을 트렁킨 가혹한 조건이요구된다(32,33).
Neee와 Nma를 불활성 스페이서 잔류물로 통합하면 올리고머 용해도를 개선하고 전구체 올리고머의 실용성 대량 태깅을 가능하게하여 대량 분광법에 의해 생성 된 종의 준비 식별을 감당할 수 있습니다. 더욱이, 인접 한 백본 세그먼트선형, 트위스트 없는 올리고머34,35를형성 하기 위해 반대 회전 상태를 채택 하는 펩 토이드의 'Σ-strand' 형태를 감안할 때, 교대 동적 공유 및 불활성 스페이서 잔기를 통합 하는 시퀀스는 반응성 펜던트 그룹 동일한 방향으로 지향 하는 구조를 용이 하 게. 서브모노머 방법의 다양성, 1 차 아민의 크고 다양한 라이브러리는 펩토이드 올리고머를 추가로 수정하기 위해 사용될 수 있지만 높은 결합 효율을 유지하기 위해 프로토콜에 대한 조정이 필요할 수 있습니다.
올리고(peptoids)는 유리 반응용기(19)에서수동으로 합성될 수 있는 반면, 공정의 자동화는 매 잔류물 첨가에 대한 시간을 몇 시간에서 반 시간으로 감소시다. 또한 자동화는 단량체 및 세척 용매 폐기물의 양을 감소시며, 특히 시판되지 않는 1차 아민 단량체를 사용할 때 바람직합니다. 보호 된 아민 잔류물에서 Alloc 분열은 효율적인 반응이지만 팔라듐 산화는 불완전한 보호 를 초래할 수 있습니다. 따라서, 수지의 일부를 갈라테스트하고 ESI-MS로 탈방 정도를 특성화하는 것이 좋습니다. 시험 분열을 위해, 405 nm 조사에서 30 분 질량 분광법을 위한 충분한 펩토이드를 풀어 놓습니다. 부분 제보호는 혐기성 조건의 사용 또는 탈보호 반응을 반복하는 것으로 제한될 수 있다.
이 기사에서는 Sc (OTf)3을 다역할 시약으로 중점하는 반면, 이터비움 트라이플랫과 같은 다른 희토류 금속 트리플랫은 분자 사다리의 정보 지향 조립을 성공적으로 중재하는 것으로 나타났습니다. 특히, Sc(OTf)3은 희토류 금속 트리플랫중 가장 많은 루이스 산성이다. 따라서, 다른 희토류 금속트리플랫(24,36)에의해 제공되는 감소된 촉매 능력으로 인해, 완전한 에틸렌 아세탈 보호 및 가닥 해리효과를 위해 더 큰 등가물들이 요구될 수 있다. 필요한 등가물의 수는 가닥이 완전히 해리되는 지점을 관찰하여 MALDI 질량 분석법으로 결정할 수 있습니다. 해리는 자체 조립 공정에서 중요하며 상승된 온도에서 핵산 가닥의 용융과 유사합니다. 촉매의 후속 추출은 서열 특정 듀플렉스의 조립을 추진하는 동적 공유 페어링의 형성 및 중단을 가능하게합니다. 올리고머 가닥의 이 점진적인 어닐링은 다른 방법에 의해 경험된 운동 트랩(분자 사다리의 경우 레지스트리 밖의 종을 산출하거나 순서를 잘못 쌍으로 만들 수 있음)을 우회합니다.
클로로포름은 여기에 사용되는 클로로포름/아세토니트릴/물 삼차 시스템에서 상 분리로서 우수한 용매로서 자체 조립구조물(37)의침전을 초래하지 않고 루이스 산의 부분추출을 촉진한다. 또한, 클로로포름은 분자 사다리 용해도를 유지하면서 이민 형성을 촉진하는 몇 안되는 용매 중 하나입니다. 시스템의 동적 특성으로 인해 레지스트리 를 벗어난 양과 잘못 페어링된 이중 면류의 미량은 종종 관찰될 수 있습니다. 이 시스템은 추출 시 희토류 금속 트리플랫 농도의 작은 변화에 크게 영향을 받지 않지만, 때때로 불충분한 촉매 추출은 불완전한 혼성화 및 비특이적 올리고머 커플링의 상당 부분을 생성합니다. 이 경우, 단일 가닥의 완전한 해리가 공정에 필수적이기 때문에 일반적으로 촉매의 1.5 등가물로 먼저 다시 해리한 다음 즉시 다시 추출하는 것보다 두 번째 추출하는 것이 바람직합니다. 여러 가지 독특한 정보 부호인 분자 사다리를 동시에 조립하려면 등가물 및 총 반응 량을 유지하는 데 사용되는 희토류 금속 트리플랫 스톡 솔루션의 농도를 증가시켜야 할 수 있습니다.
이러한 자체 어셈블리는 주로 질량 분석법을 특징으로 하지만 형광 공명 에너지 전달(FRET)을 비롯한 다른 기술이 가능합니다. 제한 사항에는 필요한 재료의 양, 단량체의 경제성 및 신호 대 잡음 비율이 포함됩니다. 1H NMR과 같은 용매가 필요한 기술은 자체 조립 된 구조의 불용성으로 인해 추가로 고통을 겪을 수 있습니다. 또한, 희토류 금속 삼중팽창 농도 는 ICP-MS 또는 내부 표준이 있는 19FNMR과 같은 방법을 통해 결정할 수 있다.
매크로 및 수화 나노 구조 및 재료에 대한 향상된 제어를 향한 진전이 진행됨에 따라 정기적이지만 수정 가능한 어셈블리를 설계하고 제작해야 하는 과제가 발생합니다. 이 보고서에 설명된 프로토콜은 동적 공유 상호 작용을 통해 서열 선택적 어셈블리를 통해 이러한 나노 구조를 달성하는 경로를 제공합니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 미국 에너지부, 과학부, 기초 에너지 과학부의 지원을 #DESC0012479. S.C.L.은 국립 과학 재단 대학원 연구 펠로우십 프로그램의 지원을 인정하며, A.F.A.는 아부다비 국영 석유 회사(ADNOC)의 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dioxane | Fisher Scientific | D1114 | Certified ACS |
| 2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoic acid (HABA) | Millipore-Sigma | 54793 | Matrix substance for MALDI-MS; ≥99.5% |
| 4-(2-Aminoethyl)aniline | Ontario Chemicals | A2076 | 98% |
| 4-Cyanobenzaldehyde | Oakwood Chemical | 049317 | 99% |
| 4-Methylpiperidine | TCI America | P0445 | ≥98.0% |
| 4-Toluenesulfonyl chloride | Oakwood Chemical | BR1703 | 99% |
| 50 mL High Performance Centrifuge Tubes | VWR International | 21008-240 | Centrifuge Tubes used for automated synthesizer |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | Glacial |
| Acetic anhydride | Fisher Scientific | A10 | Certified ACS |
| Acetonitrile | Millipore-Sigma | 34851 | For HPLC; Gradient grade; ≥99.9% |
| All-plastic Norm-Ject syringes | Thermo Fisher Scientific | S7510-10 | Luer-Slip Syringe |
| Allyl chloroformate | Acros Organics | 221741000 | 97% |
| Bromoacetic acid | Alfa Aesar | A14403 | ≥98.0% |
| Chloroform | Millipore-Sigma | 288306 | Anhydrous; ≥99%; Contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer |
| Chloroform-d | Acros Organics | AC320690075 | For NMR; 99.8 atom % D; Packaged in 0.75 ml ampoules |
| Dichlorodimethylsilane | Acros Organics | 1133100 | ≥99.0% |
| Dichloroethane | Fisher Scientific | E175 | Certified ACS |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | D37-4 | Stabalized; Certified ACS |
| Diethyl ether | Acros Organics | 615080010 | Anhydrous; ACS reagent |
| Diethylene glycol monoethyl ether | TCI America | E0048 | ≥99.0% |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | 200 Proof; Anhydrous |
| Ethylene glycol | Fisher Scientific | E178 | Certified |
| Fmoc-Photolabile SS resin | CreoSalus | SA50785 | 100-200 mesh; 1% DVB |
| Glass Peptide Vessel | Chemglass | CG-1866-02 | Solid Phase, T-Bore PTFE Stpk, Vacuum, Medium Frit, GL 25 Thread |
| LC-6AD HPLC pumps | Shimadzu Corporation | Equipment | |
| LED 405nm | ThorLabs | M405L2-C1 | 405 nm LED used for photocleavage of peptoid |
| LED Driver | ThorLabs | LEDD1B | Driver for LED light used in photocleavage of peptoid |
| Liberty Blue Automated Peptide Synthesizer | CEM Corporation | Equipment | |
| Lithium aluminum hydride | Millipore-Sigma | 199877 | Powder; Reagent grade; 95%; CAUTION: Mildly pyrophoric, handle under inert gas and protect from moisture |
| Luna C18 analytical RP-HPLC column | Phenomenex | 00G-4252-E0 | Equipment |
| Luna C18 prepatory RP-HPLC column | Phenomenex | 00G-4253-P0-AX | Equipment |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | Certified ACS |
| Microliter Syringe | Hamilton Company | 80700 | Cemented Needle (N) |
| N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIC) | Oakwood Chemical | M02889 | ≥99.0%; CAUTION: DIC is hazardous to eyes, skin, via respiratory inhalation, and may cause skin sensitization |
| N,N-Dimethylformamide | Millipore-Sigma | 319937 | ACS reagent; ≥99.8% |
| Nitric acid | Fisher Scientific | A200-212 | Certified ACS Plus |
| Nitrogen gas | Cryogenic Gases | Contents under pressure, may explode if heated | |
| Phenylsilane | Oakwood Chemical | S13600 | 97% |
| Prominence SPD-10A UV/vis Detector | Shimadzu Corporation | Equipment | |
| p-Toluenesulfonic acid monohydrate | Millipore-Sigma | 402885 | ACS reagent; ≥98.5% |
| Scandium(III) triflate | Oakwood Chemical | 009343 | 99% |
| Single-use Needle | Exel International | 26420 | 18G x 1 1/2″ |
| Sodium azide | Oakwood Chemical | 094448 | 99%; CAUTION: NaN3 may react with lead and copper which results in the formation of highly explosive metal azides. It is acutely toxic and fatal if swallowed or in contact with skin. |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | Powder; Certified ACS |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | Pellets; Certified ACS |
| Sodium sulfate | Fisher Scientific | S421-500 | Anhydrous; Granular; Certified ACS |
| Syringe Filter 0.45 µm | VWR International | 28145-497 | PTFE, Syringe Filters with Polypropylene Housing |
| Tetrahydrofuran | Fisher Scientific | T397 | Certified |
| Tetrakis(triphenylphosphine) palladium(0) | Oakwood Chemical | 034279 | 98% |
| Toluene | Fisher Scientific | T324 | Certified ACS |
| Triphenylphosphine | Oakwood Chemical | 037818 | 99% |
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