Um protocolo é apresentado para a síntese de oligômeros peptoides codificados por informações e para a auto-montagem dirigida por sequência desses peptoides em escadas moleculares usando aminas e aldeídos como pares reagentes covalentes dinâmicos e Lewis ácido rare-terra triflates metálicos como reagentes multi-função.
Este protocolo apresenta o uso de reagentes multi-papéis ácidos de Lewis para contornar armadilhas cinéticas observadas durante a automontagem de fios oligoméricos codificados por informações mediadas por interações covalentes dinâmicas emparelhadas de uma maneira que imita o ciclo térmico comumente empregado para a auto-montagem de sequências de ácido nucleico complementar. Momeros de amina primária com aldeído e moieties de pingente de amina são funcionados com grupos de proteção ortogonais para uso como pares reagentes covalentes dinâmicos. Usando um sintetizador de peptídeo automatizado modificado, os monômeros de amina primária são codificados em fios oligo (peptoide) através da síntese submonomera em fase sólida. Após a purificação por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e caracterização por espectrometria de massa de ionização eletrospray (ESI-MS), os oligômeros específicos da sequência são submetidos ao alto carregamento de um triflate metálico de terra rara ácido de Lewis que tanto desprotege os moieties de aldeído e afeta o equilíbrio do par reagente de tal forma que encalhe completamente dissocia. Posteriormente, uma fração do ácido Lewis é extraída, permitindo a afusão de fios específicos de sequência complementar para formar escadas moleculares codificadas por informações caracterizadas pela espectrometria de massa de desorização/ionização de laser assistido por matriz (MALDI-MS). O simples procedimento descrito neste relatório contorna armadilhas cinéticas comumente experimentadas no campo da montagem covalente dinâmica e serve como uma plataforma para o design futuro de arquiteturas robustas e complexas.
O progresso na automontagem, processo pelo qual pequenas subunidades geram arquiteturas maiores através de vias termodinamicamente orientadas, proporcionou um melhor controle sobre nanoestruturas macro e supramoleculars tipicamente explorando interações intermoleculares como o acúmulo de π e a ligação de hidrogênio1,2,3,4. Em particular, os ácidos nucleicos (ou seja, polinucleotídeos) emergiram como uma mídia de nanoconstrução notavelmente versátil como a alta densidade de informação fornecida pela combinação de base watson-Crick permite a montagem de estruturas complexas e seqüenciais-seletivas4,5. Considerando que a força inerentemente baixa dessas ligações intermoleculares transitórias permite rearranjo sub-unidade e correção de erros, as estruturas resultantes são muitas vezes suscetíveis à degradação térmica e mecânica6. Em contrapartida, interações covalentes dinâmicas7,8,9, uma classe de reações covalentes que são reversíveis ou reorganizáveis em condições leves e recentemente foram empregadas para produzir macromoléculas intrincadas como escadas10,11,12,13, gaiolas14,15,16, e pilhas17, oferecem aumento dos pontos fortes de vínculo e estruturas robustas. Infelizmente, a capacidade de rearranjo e verificação de erros é diminuída pelas taxas relativamente baixas de rearranjo dessas espécies covalentes, reduzindo sua capacidade de automontagem em produtos desejados18. Para lidar com esta armadilha cinética, catalisadores ou condições de reação severas são frequentemente utilizados em conjunto com simples blocos de construção. Aqui, relatamos um processo que contorna a armadilha cinética para permitir a automontagem de escadas moleculares de oligômeros específicos de sequência onde a hibridização é direcionada pelas informações codificadas nas sequências de resíduos oligomeros.
Dada a sua acessibilidade sintética, poli (n-substituiu glicina)s (ou seja, peptoides) são empregados como os precursores oligoméricos dos quais as escadas moleculares são montadas19. Peptoides são isôndeiros estruturais de peptídeos em que grupos pendentes são afixados ao nitrogênio suportado pela espinha dorsal em vez de serem acoplados com o α-carbono20. Usando a síntese em fase sólida, a colocação exata de grupos de pingente covalente dinâmicos ao longo da cadeia peptoide é prontamente alcançada, permitindo o design de oligômeros precursores que podem se reunir em estruturas supramoleculares complexas21.
O rearranjo dinâmico covalente da conectividade imine é empregado neste procedimento, pois a reação de condensação geradora de imine fornece um meio conveniente para caracterizar a automontagem por espectrometria de massa à medida que cada vínculo formado resulta em uma redução em massa de 18 g/mol22. Além disso, o equilíbrio entre os reagentes de amina e aldeído e o produto imine pode ser variado alterando a concentração de ácido. Especificamente, triflates metálicos de terra rara são usados para afetar o equilíbrio, e além de desproteger aldeídos protegidos por acetileno23,24,25. Para notar, o triflate de scandium já é comumente utilizado no campo da auto-montagem covalente dinâmica, incluindo seu recente sucesso em auxiliar na síntese de estruturas orgânicas covalentes (COFs) à temperatura ambiente26,27. Além disso, a solubilidade contrastante das sequências de oligo (peptoide) e do triflate metálico de rara terra permite o controle de equilíbrio através da extração líquido-líquido. O processo relatado utiliza esse controle para contornar as barreiras cinéticas que impedem a automontagem dirigida pela informação.
A técnica descreve a dinâmica montagem covalente de oligômeros peptoides de rolamento de informações, onde as informações são codificadas na sequência de seus grupos pendentes. O uso de um monomer de amina protegido pelo Alloc em conjunto com um momero aldeído protegido por acetileno permite a desproteção ortogonal, permitindo a desproteção e alásia alloc em situ durante a reação de auto-montagem, garantindo assim que as sequências sintetizadas não reajam prematuramente antes da purificação e caracterização oligomer. É importante ressaltar que a síntese em fase sólida é realizada usando uma resina fotolabile para permitir o decote oligomer do bead irradiação de luz UV ou violeta, impedindo a desproteção prematura do grupo de proteção acetal ácido-labile etileno. Vários esquemas alternativos de desproteção podem ser considerados. Por exemplo, inicialmente empregamos grupos de proteção de ácido-ácido duplo (Boc-amina e acetal-aldeído de etileno) com a intenção de in situ deproteção por um ácido forte seguido de neutralização para permitir que a reação de auto-montagem prossiga; no entanto, essa abordagem resultou na geração imediata de precipitação após a adição da base. Alternativamente, a proteção da amina com um grupo de proteção fotolabile, 2-(2-nitrofenyl)propoxycarbonyl (NPPOC), foi imaginada como o aldeído poderia ser seletivamente desprotegido no tratamento com ácido trifluorocético (TFA) antes da purificação. Infelizmente, na fotolise situ do grupo de proteção com luz UV não deu condições de desproteção quantitativa, mesmo na presença de fotosensitizers e após longos períodos de irradiação25. Trimetilsilylethoxycarbonyl (ou seja, Teoc) pode ser empregado como um grupo protetor de amina e está sujeito ao decote sobre o tratamento com triflates metálicos de terra rara; no entanto, a desproteção quantitativa teoc requer carregamentos triflate metálicos de terra rara muito maiores do que o necessário para a desproteção acetal de etileno. Para este protocolo, a Teoc-amines pode ser usada, mas a concentração de ácido de Lewis deve ser ajustada de acordo, pois a desproteção subquantitativa da mina pode ser problemática para estruturas auto-montadas maiores. Grupos funcionais alifáticos foram brevemente considerados, mas a desproteção de aldeídos alifáticos requer condições severas que truncam sequências peptoides32,33.
A incorporação de Neee e Nma como resíduos espaçadores inertes servem para melhorar a solubilidade do oligomer e permitir a marcação em massa fácil dos oligômeros precursores para pagar a identificação pronta das espécies geradas por espectroscopia em massa. Além disso, dada a conformação ‘Σ-strand’ de peptoides onde segmentos adjacentes da espinha dorsal adotam estados rotacionais opostos para formar um oligômero linear e sem torção34,35,sequências que incorporam resíduos dinâmicos alternados de covalente e espaçador inerte facilita uma estrutura na qual grupos de pingenteres reativos são orientados na mesma direção. Dada a versatilidade do método submonomerso, uma grande e diversificada biblioteca de aminas primárias pode ser empregada para modificar ainda mais os oligômeros peptoides, mas pode exigir ajustes no protocolo para manter alta eficiência de acoplamento.
Enquanto o ligo (peptoides) pode ser sintetizado manualmente em um vaso de reação de vidro19,a automação do processo diminui o tempo para cada adição de resíduos de várias horas para meia hora. Além disso, a automação diminui a quantidade de resíduos de solventes monomers osmômeros e lave, particularmente desejável ao usar monômeros de amina primária que não estão disponíveis comercialmente. Embora o decote alloc dos resíduos protegidos de amina seja uma reação eficiente, a oxidação do paládio pode resultar em desproteção incompleta. Consequentemente, sugere-se testar uma parte da resina e caracterizar a extensão da desproteção com o ESI-MS. Para decotes de teste, 30 min abaixo de 405 nm irradiação libera peptoide suficiente para espectrometria de massa. A desproteção parcial pode ser limitada com o uso de condições anaeróbicas ou repetindo a reação de desproteção.
Considerando que este artigo se concentra em Sc (OTf)3 como um reagente multifunção, outros triflates metálicos de terras raras, como o triflate do ytterbium, têm sido mostrados para mediar com sucesso a montagem dirigida pela informação de escadas moleculares. Notavelmente, Sc (OTf)3 é o mais ácido de Lewis dos triflates metálicos de terras raras; assim, devido à redução da capacidade catalítica oferecida por outros triflates metálicos de terras raras24,36, maiores equivalentes podem ser necessários para efetuar desproteção acetal completa e dissociação de fios. O número de equivalentes necessários pode ser determinado com espectrometria de massa MALDI observando ponto em que os fios se dissociam completamente. A dissociação é fundamental no processo de automontagem e é análoga ao derretimento de fios de ácido nucleico a temperatura elevada. A extração subsequente do catalisador permite a formação e interrupção de pares dinâmicos de covalente impulsionando a montagem de duplexes específicos de sequência. Esse aperto gradual dos fios oligoméricos contorna a armadilha cinética (que, para escadas moleculares, pode produzir espécies fora do registro ou emparelhar incorretamente sequências) experimentadas por outros métodos.
Clorofórmio é um excelente solvente como separação de fase no sistema de ternário clorofórmio/acetonitrile/água usado aqui promove a extração parcial do ácido Lewis sem resultar em precipitação de estruturas auto-montadas37. Além disso, o clorofórmio é um dos poucos solventes que promove a formação de imine, mantendo a solubilidade molecular da escada. Vestígios de duplexes fora do registro e incorretamente emparelhados podem ser observados devido à natureza dinâmica do sistema. Embora este sistema não seja afetado em grande parte por uma pequena variação nas concentrações de triflate metálicode terras raras após a extração, na ocasião, a extração catalisadorina insuficiente gera uma parcela significativa de hibridização incompleta e acoplamentos oligômeros não específicos. Neste caso, geralmente é preferível primeiro redissociar com mais 1,5 equivalentes de catalisador e, em seguida, extrair uma segunda vez em vez de reextrair imediatamente, já que a dissociação completa de fios únicos é vital para o processo. Para montar simultaneamente várias escadas moleculares codificadas por informações únicas, pode ser necessário aumentar a concentração da solução de estoque triflate metálico de terras raras usada para manter equivalentes e volume total de reação.
Embora essas auto-assembléias sejam caracterizadas principalmente pela espectrometria de massa, outras técnicas, incluindo fluorescência de transferência de energia de ressonância (FRET) são possíveis. As limitações incluem quantidade de material necessário, acessibilidade de monômeros e relação sinal-ruído. Técnicas que requerem solventes, como 1H NMR, podem sofrer adicionalmente de insolubilidade de estruturas automontadas. Além disso, as concentrações de triflate metálico de terra rara após a extração podem ser determinadas através de métodos como ICP-MS ou 19F NMR com um padrão interno.
À medida que o progresso em direção ao melhor controle sobre nanoestruturas e materiais macro e supramoleculars prossegue, surge o desafio de projetar e fabricar conjuntos regulares, mas modificáveis. O protocolo descrito neste relatório fornece um caminho para alcançar tais nanoestruturas através de montagens sequenciais através de interações dinâmicas covalentes.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Energia dos EUA, Escritório de Ciências Básicas de Energia, o prêmio #DESC0012479. A S.C.L. reconhece o apoio do National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program, e a A.F.A. reconhece o apoio da Abu Dhabi National Oil Company (ADNOC).
1,4-Dioxane | Fisher Scientific | D1114 | Certified ACS |
2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoic acid (HABA) | Millipore-Sigma | 54793 | Matrix substance for MALDI-MS; ≥99.5% |
4-(2-Aminoethyl)aniline | Ontario Chemicals | A2076 | 98% |
4-Cyanobenzaldehyde | Oakwood Chemical | 049317 | 99% |
4-Methylpiperidine | TCI America | P0445 | ≥98.0% |
4-Toluenesulfonyl chloride | Oakwood Chemical | BR1703 | 99% |
50 mL High Performance Centrifuge Tubes | VWR International | 21008-240 | Centrifuge Tubes used for automated synthesizer |
Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | Glacial |
Acetic anhydride | Fisher Scientific | A10 | Certified ACS |
Acetonitrile | Millipore-Sigma | 34851 | For HPLC; Gradient grade; ≥99.9% |
All-plastic Norm-Ject syringes | Thermo Fisher Scientific | S7510-10 | Luer-Slip Syringe |
Allyl chloroformate | Acros Organics | 221741000 | 97% |
Bromoacetic acid | Alfa Aesar | A14403 | ≥98.0% |
Chloroform | Millipore-Sigma | 288306 | Anhydrous; ≥99%; Contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer |
Chloroform-d | Acros Organics | AC320690075 | For NMR; 99.8 atom % D; Packaged in 0.75 ml ampoules |
Dichlorodimethylsilane | Acros Organics | 1133100 | ≥99.0% |
Dichloroethane | Fisher Scientific | E175 | Certified ACS |
Dichloromethane | Fisher Scientific | D37-4 | Stabalized; Certified ACS |
Diethyl ether | Acros Organics | 615080010 | Anhydrous; ACS reagent |
Diethylene glycol monoethyl ether | TCI America | E0048 | ≥99.0% |
Ethanol | Decon Labs | 2701 | 200 Proof; Anhydrous |
Ethylene glycol | Fisher Scientific | E178 | Certified |
Fmoc-Photolabile SS resin | CreoSalus | SA50785 | 100-200 mesh; 1% DVB |
Glass Peptide Vessel | Chemglass | CG-1866-02 | Solid Phase, T-Bore PTFE Stpk, Vacuum, Medium Frit, GL 25 Thread |
LC-6AD HPLC pumps | Shimadzu Corporation | Equipment | |
LED 405nm | ThorLabs | M405L2-C1 | 405 nm LED used for photocleavage of peptoid |
LED Driver | ThorLabs | LEDD1B | Driver for LED light used in photocleavage of peptoid |
Liberty Blue Automated Peptide Synthesizer | CEM Corporation | Equipment | |
Lithium aluminum hydride | Millipore-Sigma | 199877 | Powder; Reagent grade; 95%; CAUTION: Mildly pyrophoric, handle under inert gas and protect from moisture |
Luna C18 analytical RP-HPLC column | Phenomenex | 00G-4252-E0 | Equipment |
Luna C18 prepatory RP-HPLC column | Phenomenex | 00G-4253-P0-AX | Equipment |
Methanol | Fisher Scientific | A412 | Certified ACS |
Microliter Syringe | Hamilton Company | 80700 | Cemented Needle (N) |
N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIC) | Oakwood Chemical | M02889 | ≥99.0%; CAUTION: DIC is hazardous to eyes, skin, via respiratory inhalation, and may cause skin sensitization |
N,N-Dimethylformamide | Millipore-Sigma | 319937 | ACS reagent; ≥99.8% |
Nitric acid | Fisher Scientific | A200-212 | Certified ACS Plus |
Nitrogen gas | Cryogenic Gases | Contents under pressure, may explode if heated | |
Phenylsilane | Oakwood Chemical | S13600 | 97% |
Prominence SPD-10A UV/vis Detector | Shimadzu Corporation | Equipment | |
p-Toluenesulfonic acid monohydrate | Millipore-Sigma | 402885 | ACS reagent; ≥98.5% |
Scandium(III) triflate | Oakwood Chemical | 009343 | 99% |
Single-use Needle | Exel International | 26420 | 18G x 1 1/2″ |
Sodium azide | Oakwood Chemical | 094448 | 99%; CAUTION: NaN3 may react with lead and copper which results in the formation of highly explosive metal azides. It is acutely toxic and fatal if swallowed or in contact with skin. |
Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | Powder; Certified ACS |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | Pellets; Certified ACS |
Sodium sulfate | Fisher Scientific | S421-500 | Anhydrous; Granular; Certified ACS |
Syringe Filter 0.45 µm | VWR International | 28145-497 | PTFE, Syringe Filters with Polypropylene Housing |
Tetrahydrofuran | Fisher Scientific | T397 | Certified |
Tetrakis(triphenylphosphine) palladium(0) | Oakwood Chemical | 034279 | 98% |
Toluene | Fisher Scientific | T324 | Certified ACS |
Triphenylphosphine | Oakwood Chemical | 037818 | 99% |