यहां हम मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) का उपयोग करके पाए गए एपिजेनेटिक हस्ताक्षरों के माध्यम से प्रतिरक्षा सेल पहचान और शुद्धता का निर्धारण करने की एक मजबूत विधि का वर्णन करते हैं। एक विशिष्ट लोकस पर डीएनए डिमेथिलेशन एक विशेष सेल प्रकार के लिए एक अद्वितीय पहचानकर्ता के रूप में कार्य करता है और सीडी8 +, नियामक या Th17 टी कोशिकाओं की पहचान के लिए अनुमति देता है।
प्रतिरक्षा कोशिका उपप्रकार जनसंख्या आवृत्तियों टी सेल चिकित्सा की प्रभावकारिता पर एक बड़ा प्रभाव हो सकता है। प्रवाह साइटोमेट्री की तरह वर्तमान तरीकों में विशिष्ट नमूना आवश्यकताएं होती हैं, उच्च नमूना इनपुट, कम थ्रूपुट होते हैं, और मानकीकरण करना मुश्किल होता है, जिनमें से सभी अपने विकास के दौरान सेल थेरेपी उत्पादों के लक्षण वर्णन के लिए हानिकारक होते हैं और विनिर्माण.
यहां वर्णित परखें अलग जीनोमिक डीएनए (जीडीएनए) का उपयोग कर कोशिकाओं के विषम मिश्रण में प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों की सही पहचान और मात्रा निर्धारित करती हैं। डीएनए मिथाइलेशन पैटर्न को बाइसुल्फेट रूपांतरण के माध्यम से प्रकट किया जाता है, एक प्रक्रिया जिसमें अनमेथिलेटेड साइटोसिन को यूरासिल में परिवर्तित किया जाता है। परिवर्तित क्षेत्रों को लक्षित करने वाले प्राइमर का उपयोग करके क्यूपीसीआर प्रवर्धन के माध्यम से अमेथिलेटेड डीएनए क्षेत्रों का पता लगाया जाता है। परख के अनुसार एक अद्वितीय लोकस मापा जाता है और एक विशिष्ट सेल प्रकार के लिए एक सटीक पहचानकर्ता के रूप में कार्य करता है। परख मजबूत हैं और सीडी 8 +, नियामक, और Th17 टी कोशिकाओं को उच्च थ्रूपुट तरीके से पहचानते हैं। इन अनुकूलित रूपों संभावित रूप से सेल थेरेपी प्रक्रिया के लिए इन-प्रोसेस और उत्पाद रिलीज परीक्षण के लिए उपयोग किया जा सकता है।
सेलुलर इम्यूनोथेरेपी में टी कोशिकाओं का उपयोग पिछले दशक में काफी बढ़ गया है, विशेष रूप से चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर) टी सेल प्रौद्योगिकी1के आगमन के साथ । जबकि टी सेल आधारित चिकित्सा महान नैदानिक सफलता के साथ मुलाकात की गई है, वे विषम और सेल विशेषताओं और पहचान दानदाताओं2के बीच काफी भिंन हो सकते हैं । टी सेल आबादी की विषमता चिकित्सीय प्रभावकारिता पर प्रमुख प्रभाव हो सकता है और नैदानिक परीक्षणों से निष्कर्ष जटिल हो सकता है । इस कारण से, टी सेल इम्यूनोथेरपी के इष्टतम योगों को निर्धारित करने के लिए उत्पाद विनिर्माण और निर्माण के दौरान टी सेल विषमता को समझना महत्वपूर्ण है।
एक व्यापक अर्थ में, टी कोशिकाओं को दो समूहों में विभाजित किया जा सकता है: सीडी4 + सहायक टी कोशिकाएं, जो इम्यूनोमोडुलेटरी साइटोकिन्स, और सीडी8 + साइटोटॉक्सिक टी कोशिकाओं को स्रावित करती हैं, जो सीधे प्रमुख हिस्टोअनुकूली परिसर (एमएचसी) मैं अणुओं पर कॉग्नेट एंटीजन पेश करने वाली कोशिकाओं को लाय करती हैं। सीडी 4 + सहायक टी कोशिकाएं विशिष्ट सबसेट के असंख्य में अंतर कर सकती हैं जो साइटोकिन्स का एक अनूठा सेट पैदा करते हैं। कुछ सुझाव देते हैं कि अंतिम सेल उत्पाद में सीडी 8 + टी कोशिकाओं को सीडी 4 + का एक परिभाषित अनुपात वीवो प्रभावकारिता और दृढ़ता में अधिकतम करता है लेकिन सेल विनिर्माण3को जटिल बना सकता है। नियामक टी कोशिकाएं (ट्रेग्स), सीडी 4 + टी कोशिकाओं का सबसेट, इम्यूनोसप्रेसिव हैं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की सक्रियता को कम करते हैं। नियामक टी कोशिकाओं ट्यूमर सहिष्णुता मध्यस्थता में फंसाया गया है और, अगर कार टी सेल विनिर्माण के दौरान मौजूद है, कार टी कोशिकाओं4,5,6की एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बाधित कर सकते हैं । टी हेल्पर 17 (Th17) टी कोशिकाओं जैसे अन्य CD4 + सबसेट ट्यूमर निकासी को बढ़ावा देते हैं और टी सेल उपचारों की प्रभावकारिता बढ़ाने के लिए लीवरेज किया जा सकता है। इस प्रकार, Th17 CD4 + टी कोशिकाओं में वृद्धि ठोस ट्यूमर सेटिंग्स में विशेष रुचि है जहां इंटरल्यूकिन 17 (आईएल-17) के उत्पादन में वृद्धि एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया5,7,8,9को बढ़ावा देती है। ट्यूमर प्रतिक्रियाओं में Th17 कोशिकाओं के महत्व को समझने के लिए रणनीतियों में अधिक जांच के लिए इन कोशिकाओं को विट्रो7,9में उत्पन्न करने के लिए प्रेरित किया है । इसलिए, इन टी सेल सबसेट का पता लगाने के तरीके टी सेल उपचारों को अनुकूलित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं और मजबूत, आसान, स्केलेबल और प्रजनन योग्य होना चाहिए।
प्रतिरक्षा कोशिका की पहचान निर्धारित करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री सबसे आम तरीका है। हालांकि, प्रवाह साइटोमेट्री को लाइव, अक्षुण्ण कोशिकाओं की आवश्यकता होती है जिन्हें उसी दिन विश्लेषण किया जाना चाहिए जब उन्हें काटा जाता है। इंट्रासेलर साइटोकिन धुंधला (आईसीएस) के लिए, टी कोशिकाओं के भीतर साइटोकिनको बनाए रखने के लिए प्रोटीन स्राव अवरोध की आवश्यकता होती है। हालांकि, विभिन्न अवरोधक यौगिकों में विशिष्ट साइटोकिनके स्राव पर अंतर प्रभाव पड़ता है, जो उपयोगकर्ताओं को ब्याज10,11के साइटोकिन का पता लगाने के लिए विशेष कॉकटेल बनाने के लिए मजबूर करते हैं। इसके अतिरिक्त, प्रवाह साइटोमेट्री की निष्ठा एंटीबॉडी क्लोन पर निर्भर करती है जो विशेष रूप से और शक्तिशाली रूप से अपने लक्ष्य के लिए बाध्य करती है। विभिन्न एंटीबॉडी क्लोन का उपयोग अलग-अलग परिणाम पैदा कर सकता है और सटीक निष्कर्ष निकाल सकता है, जिससे विधि को12का मानकीकरण करना मुश्किल हो जाता है। इसके अलावा, प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से एकत्र किए गए डेटा का विश्लेषण, और इस प्रकार डेटा से तैयार किए गए निष्कर्ष, उपयोगकर्ताओं के बीच बहुत भिन्न हो सकते हैं कि गेट्स13,14कैसे सेट किए जाते हैं। इन कारणों से, सेल थेरेपी विकास के दौरान सटीक गुणवत्ता नियंत्रण के लिए प्रवाह साइटोमेट्री आदर्श नहीं है।
विशिष्ट जीन लोकी पर जीनोमिक मिथाइलेशन का आकलन सेल पहचान निर्धारित करने का एक वैकल्पिक तरीका है। विशिष्ट कोशिका प्रकारों की पहचान करने के लिए डीएनए मिथाइलेशन का उपयोग करने का औचित्य कई लेखों में वर्णित किया गया है और यह किसी दिए गए कोशिका जनसंख्या15,16,17में मौजूद विशिष्ट मिथाइलेशन पैटर्न पर निर्भर करता है । लक्ष्य कोशिकाओं में, कुछ साइटों में अमेथीटेड न्यूक्लियोटाइड्स होते हैं, जबकि गैर-लक्षित कोशिकाओं में ये साइटें मिथाइलेटेड होती हैं। इस पैटर्न का पता बाइसुल्फेट रूपांतरण के माध्यम से लगाया जा सकता है, एक प्रक्रिया जो विशेष रूप से अनमेथिलेटेड साइटोसाइन न्यूक्लियोटाइड्स (सी) को यूरासिल (यू) में परिवर्तित करती है। प्राइमर्स और जांच को परिवर्तित साइटों के खिलाफ डिजाइन किया जा सकता है, फिर क्यूपीसीआर16के माध्यम से परिलक्षित और पता लगाया जा सकता है।
यहां वर्णित परख एक हाउसकीपिंग जीन की तुलना में विशिष्ट अमेथीटेड लोकी की संख्या को निर्धारित करके विषम आबादी के भीतर प्रतिरक्षा कोशिका उपप्रकारों की आवृत्ति को मापता है । सीडी 8 बी जीन के लिए अमेथिलेटेड नियामक तत्वों की प्रतियां सीडी8 परख, ट्रेग में FoxP3, और इस परख में Th17 में आईएल-17 में मापा जाता है । इन लोकी की पहचान विशिष्ट कोशिका जनसंख्या ब्याज (जैसे, सीडी8 + टी कोशिकाओं) को अलग करके की गई थी और केवल उस सेल प्रकार15में अनमेथिलेटेड लोकी की पहचान करने के लिए बाइसुल्फेट अनुक्रमण का प्रदर्शन किया गया था। प्राइमर्स और जांच विशिष्ट रूप से अमेथाइलेटेड लोकी के खिलाफ विकसित किए जाते हैं और क्यूपीसीआर के माध्यम से नमूनों का विश्लेषण किया जाता है। ज्ञात कॉपी नंबरों का एक मानक वक्र उच्च कॉपी संख्या मानक प्लाज्मिड के कमजोर होने से बनाया गया है, जिससे सीटी मूल्य को ट्रांसक्रिप्ट कॉपी नंबर में बदलने की अनुमति होती है।
परख प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए, नियंत्रण नमूनों की आवश्यकता होती है, जिसमें एक संदर्भ जीडीएनए और एक कैलिब्रेटर प्लाज्मिड शामिल है। संदर्भ जीनोमिक सामग्री ज्ञात प्रतिरक्षा कोशिका आवृत्तियों के साथ कई दाताओं से एक पूल रक्त नमूना है और एक गुणवत्ता नियंत्रण (QC) परख प्रदर्शन की जांच के लिए प्रयोग किया जाता है । कैलिब्रेटर नमूना एक संश्लेषित प्लाज्मिड है जिसमें समतुल्य अनुपात में सीडी8, फॉक्सपी 3 और गगध जीन दृश्य शामिल हैं। इसका उपयोग बाइसुल्फेट रूपांतरण दक्षता के उपाय के रूप में किया जाता है, क्योंकि विभिन्न जीनोमिक क्षेत्रों के भीतर बाइसुल्फेट रूपांतरण दक्षता में भिन्न होंगे। अंशांकन के भीतर GAPDH के लिए लक्ष्य का अनुपात 1 है, लेकिन bisulfite रूपांतरण दक्षता के मतभेदों के कारण, अनुपात भिन्न हो सकते हैं । यह अंशांकन कारक सीडी 8 और ट्रेग परखों पर लागू होता है। FoxP3, Treg परख में इस्तेमाल जीन, एक्स गुणसूत्र पर स्थित है । क्योंकि यह परख केवल FoxP3 की अमेथीकृत प्रतियां उपाय है, और FoxP3 की केवल एक प्रति Tregs में unmethylated है, इस परख सेक्स नास्तिक है और दोनों पुरुष और महिला नमूनों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है18। Th17 परख एक हाउसकीपिंग जीन के रूप में एक अंशांकन नमूना या GAPDH का उपयोग नहीं करता है । इसके बजाय, गैर-Th17 कोशिकाओं में मौजूद मेथिलेटेड लोकी को लक्षित करने वाला एक और प्राइमर सेट शामिल है और कोशिकाओं की कुल संख्या आईएल-17 की मिथाइलेटेड और अमेथीटेड प्रतियों के योग से परिलक्षित होती है। क्यूपीसीआर से प्राप्त डेटा को प्रीसेट विश्लेषण टेम्पलेट में दर्ज किया जाता है जो डेटा पर गुणवत्ता नियंत्रण जांच करता है और शुरुआती आबादी के भीतर लक्ष्य सेल के प्रतिशत की गणना करता है। यह स्वचालित और निष्पक्ष डेटा विश्लेषण प्रदान करता है, जिससे उपयोगकर्ता व्यक्तिपरकता को हटाया जा सके और मानकीकरण क्षमताओं में सुधार हो।
यह परख जीडीएनए का उपयोग करती है, जिसे सुसंस्कृत या निश्चित कोशिकाओं, या जमे हुए सेल छर्रों का उपयोग करके ल्यूकापेरेसिस प्रक्रिया द्वारा अलग किया जा सकता है। कम नमूना आवश्यकता, नमूना शुरू सामग्री में लचीलापन, उच्च सटीकता, और मानकीकृत विश्लेषण प्रवाह साइटोमेट्री से जुड़ी सीमाओं को संबोधित करते हैं और सेल थेरेपी प्रक्रिया विकास के दौरान गुणवत्ता नियंत्रण उद्देश्यों के लिए आदर्श हैं।
नए इम्यूनोथेरप्यूटिक्स के आगमन के साथ, प्रतिरक्षा कोशिका पहचान और शुद्धता का पता लगाने के मानकीकृत तरीकों की आवश्यकता है। इन-प्रोसेस और रिलीज िंग टेस्टिंग के लिए मूल्यांकन विधियां जो मजबूत, मान्य और स्केलेबल हैं, स्थापित किए जाने और सेल-आधारित उपचारों के व्यावसायीकरण के लिए एक बड़ी चुनौती पैदा करने के लिए रहते हैं। जबकि फ्लो साइटोमेट्री वर्तमान में प्रतिरक्षा सेल फेनोटाइपिंग के लिए सबसे आम तरीका है, उच्च नमूना गुणवत्ता और मात्रा आवश्यकताओं को नियमित उपयोग के लिए मुश्किल बना देता है। इसके अलावा, एक अच्छे विनिर्माण अभ्यास (जीएमपी) वातावरण में प्रवाह साइटोमेट्री को लागू करना ऑपरेटर-निर्भर गेटिंग रणनीतियों और13,14उपयोग किए गए प्रत्येक मार्कर के लिए संदर्भ मानकों की आवश्यकता द्वारा सीमित है। हालांकि स्वचालित गेटिंग को परख मजबूती में सुधार करने के लिए दिखाया गया है, यह अभी तक एक अच्छी तरह से स्थापित गुणवत्ता नियंत्रण रणनीति नहीं है । जबकि जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग का उपयोग सेल थेरेपी उत्पाद पहचान और शुद्धता की विशेषता के लिए भी किया जा सकता है, डेटा अर्धमात्रात्मक और श्रम गहन हैं। इसके अतिरिक्त, आरएनए और माइक्रोआरएनए डीएनए की तुलना में अपेक्षाकृत कम स्थिर हैं और मजबूत और प्रजनन योग्य परिणामों की कमी में योगदान दे सकते हैं। इस प्रकार, एक विशिष्ट लोकस की एपिजेनेटिक डीएनए मिथाइलेशन स्थिति का उपयोग करने से कोशिका प्रकार की पहचान करने और मात्रा निर्धारित करने की एक स्थिर, आसान, मजबूत और स्केलेबल विधि प्रदान की जाती है।
फेनोटाइप कोशिकाओं के लिए मिथाइलेशन पैटर्न का पता लगाना तीन महत्वपूर्ण चरणों पर निर्भर करता है: सबसे पहले, परख के लिए जीडीएनए के उपयोग की आवश्यकता होती है, जो वर्णित तरीकों के अनुसार अलग-थलग है। उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए की आवश्यकता होती है और यदि उपयोग नहीं किया जाता है, तो बाइसुल्फेट रूपांतरण23,24प्रभावित हो सकता है। यदि कम गुणवत्ता वाले डीएनए प्राप्त किया जाता है, तो परख विश्वसनीयता सुनिश्चित करने के लिए आगे शुद्धिकरण की सिफारिश की जाती है। दूसरा, यूरासिल में अनमेथिलेटेड साइटोसाइन के सफल बाइसुल्फेट रूपांतरण की आवश्यकता है। बिसुल्फेट रूपांतरण में सबसे महत्वपूर्ण कदम डीएनए निंदा23,25है . सोडियम बाइसुल्फेट के विपरीत अमोनियम बाइसुल्फेट का उपयोग करके उच्च तापमान की निंदा, रूपांतरण दक्षता और स्थिरता को बढ़ाती है और इन परखों के लिए अनुशंसित प्रक्रिया25,26है। उपयोगकर्ताओं को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि प्रतिक्रिया 80 डिग्री सेल्सियस पर होती है और नमूना मिश्रण अक्सर किया जाता है। इन कारणों से, एक डिजिटल थर्मोमिक्सर की सिफारिश की जाती है (सामग्री की तालिकादेखें)। तीसरा, क्यूपीसीआर तैयारी के दौरान उचित पाइपिंग तकनीक का पालन किया जाना चाहिए। मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर प्रयोगों (MIQE) दिशानिर्देश27के प्रकाशन के लिए न्यूनतम जानकारी का पालन करने के लिए क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया के दौरान तीन तकनीकी प्रतिकृतियों की आवश्यकता होती है। अधिक तकनीकी प्रतिकृतियों को शामिल करना स्वीकार्य है लेकिन आवश्यक नहीं है । अनुचित पाइपिंग तकनीक और/या तकनीकी प्रतिकृतियों सहित नहीं अविश्वसनीय qPCR परिणाम के लिए नेतृत्व करेंगे ।
यदि महत्वपूर्ण चरणों का पालन किया जाता है और वांछित परिणाम अभी भी प्राप्त नहीं किए जाते हैं, तो परख के भीतर कई नियंत्रणों को इस मुद्दे को इंगित करने के लिए लीवरेज किया जा सकता है। उचित bisulfite रूपांतरण इस परख में सबसे महत्वपूर्ण कदम है । अनुचित बाइसुल्फेट रूपांतरण को एक असफल अंशांकन कारक और/या विश्लेषण टेम्पलेट द्वारा गणना किए गए संदर्भ मूल्यों द्वारा हाइलाइट किया जाएगा । यदि बाइसुल्फेट रूपांतरण गलत तरीके से किया गया था (उदाहरण के लिए, यदि प्रतिक्रिया आरटी पर की गई थी), तो क्यूपीसीआर के दौरान कोई प्रवर्धन नहीं होगा। इसके अलावा, यदि क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया तैयारी के दौरान कोई त्रुटि नहीं की गई थी (उदाहरण के लिए, यदि क्यूपीसीआर मास्टर मिश्रण नहीं जोड़ा गया था)। मानक नमूनों की जांच कर के इन दोनों मुद्दों को अलग किया जा सकता है। मानक नमूनों में प्रवर्धन, लेकिन संदर्भ, अंशांकन और प्रायोगिक नमूनों से संकेत नहीं मिलता कि बाइसुल्फेट रूपांतरण सही ढंग से नहीं किया गया था। किसी भी नमूने में प्रवर्धन नहीं होने से यह पता चलता है कि क्यूपीसीआर को सही ढंग से नहीं किया गया था ।
हालांकि यह परख अन्य फेनोटाइपिंग विधियों से जुड़े कड़े नमूना आवश्यकता और विश्लेषण परिवर्तनशीलता को संबोधित करता है, विशेष रूप से साइटोमेट्री प्रवाह, ऐसी सीमाएं हैं जिन्हें नोट किया जाना चाहिए। यह परख एक एकल लोकस को लक्षित करती है जिसका उपयोग लक्ष्य कोशिका के लिए एक अद्वितीय पहचानकर्ता के रूप में किया जाता है, जो मल्टीप्लेक्स विश्लेषण को प्रतिबंधित करता है जो आमतौर पर प्रवाह साइटोमेट्री के साथ किया जाता है। यह Th17 जैसे जटिल सेल प्रकारों की पहचान करना मुश्किल बनाता है। हालांकि, एक ही लोकस पर मिथाइलेशन पैटर्न का उपयोग कई कोशिकाओं का सटीक फेनोटाइपिक मार्कर दिखाया गया है और इसका उपयोग15,16कई नैदानिक परीक्षणों में किया गया है। यह विशेष रूप से ट्रेग्स में सच है जहां FOXP3 मिथाइलेशन हस्ताक्षर का आकलन क्षणिक FOXP3 से सच Tregs का पता लगाने के लिए एक सटीक और स्पष्ट तरीका हैकोशिकाओं को व्यक्त 28। मल्टीप्लेक्स विश्लेषण के नुकसान की भरपाई लोकी से पूछताछ की गई सटीकता से की जाती है । परख के भविष्य के पुनरावृत्तियों में एक क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया में कई लोकी का पता लगाने के लिए अनुमति देने के लिए कई क्यूपीसीआर रंग और बुझाने वाले शामिल हो सकते हैं।
इस परख का उपयोग सेल फेनोटाइप और पहचान निर्धारित करने में प्रवाह साइटोमेट्री के लिए एक वैकल्पिक विधि के रूप में किया जा सकता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यह परख सटीक मूल्यों है कि प्रवाह साइटोमेट्री करता है(आंकड़े 1-3)उपज नहीं है । यह प्रवाह साइटोमेट्री से जुड़े डेटा विश्लेषण की परिवर्तनशीलता के हिस्से में कारण है। गेटिंग रणनीति के आधार पर, प्रवाह साइटोमेट्री के परिणाम काफी भिन्न हो सकते हैं। आईएल-17 जैसे इंट्रासेल्युलर लक्ष्यों को देखने के लिए जटिल धुंधला प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय यह विशेष रूप से मामला है, जहां भिन्नता (सीवी) का गुणांक 15%14जितना अधिक हो सकता है। कई उपयोगकर्ताओं के बीच, परख लगातार प्रस्तुत की गई परख और 15% का सीवी था, जो परख और बेहतर मानकीकरण क्षमताओं की मजबूती का समर्थन करता है। एपिजेनेटिक और फ्लो साइटोमेट्री-आधारित फेनोटाइपिंग के बीच सबसे बड़ा अंतर तब देखा जाता है जब सेल उत्तेजना की आवश्यकता होती है(चित्रा 3)। फ्लो साइटोमेट्री के माध्यम से Th17 कोशिकाओं का पता लगाने टी सेल उत्तेजना और इंट्रासेलर साइटोकिन धुंधला29,30,31के लिए एक आम प्रोटोकॉल का उपयोग कर पूरा किया गया था । एपिजेनेटिक माप और प्रवाह साइटोमेट्री के बीच Th17 फेनोटाइपिंग में देखे गए मतभेद आईएल-17 उत्पादन के काइनेटिक्स के कारण हो सकते हैं। जबकि मिथाइलेशन हस्ताक्षर स्थिर हैं, प्रोटीन उत्पादन में समय लगता है और फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी20,32द्वारा पता लगाने के लिए पर्याप्त मात्रा में मौजूद होना चाहिए। प्रोटीन परिवहन अवरोधक और सेल उत्तेजना कॉकटेल के साथ 6 एच ऊष्मायन को एपीजेनेटिक आधारित फेनोटाइपिंग विधियों के माध्यम से पता लगाए गए Th17 कोशिकाओं के स्तर को देखने के लिए विस्तारित करने की आवश्यकता हो सकती है । सटीक कारण यह निर्धारित करने के लिए अधिक अध्ययनों की आवश्यकता होती है कि मूल्य सबसे सटीक फेनोटाइपिंग विधि का मिलान और निर्धारण क्यों नहीं करते हैं।
इस रिपोर्ट में, हम विस्तार से कैसे पहचान और एक सरल और मजबूत तरीके से कोशिकाओं के एक विषम मिश्रण में प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार की मात्रा निर्धारित करने के लिए । परखों को इन-प्रोसेस और सेल-आधारित चिकित्सा विज्ञान के रिलीज परीक्षण के लिए संभावित उपयोग के लिए डिज़ाइन और अनुकूलित किया गया है। वर्णित परखसेल थेरेपी अनुप्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले उच्च योग्य कच्चे माल की आवश्यकता को पूरा करते हैं। प्रवाह साइटोमेट्री और स्थिरता, नमूना आवश्यकताओं, पूर्व उत्तेजना, इंट्रासेलुलर धुंधला के लिए सेलुलर पार्मेबिलाइजेशन, और डेटा विश्लेषण की व्यक्तिपरकता जैसे अन्य आणविक तरीकों की कमियों को दूर करके, वर्णित परखें लाइन में हैं सेल आधारित चिकित्सा के व्यावसायीकरण के लक्ष्यों के साथ।
The authors have nothing to disclose.
इस परियोजना को थर्मो फिशर साइंटिफिक इंट्राम्यूरल ग्रांट द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।
2.0 ml Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 22363344 | |
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Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer, blue/red/violet6/yellow | Thermo Fisher Scientific | A29004 | |
CTS PureQuant CD8+ T-Cell Assay | Thermo Fisher Scientific | A43674 | |
CTS PureQuant Th17 Assay | Thermo Fisher Scientific | A43676 | |
CTS PureQuant Treg Assay | Thermo Fisher Scientific | A43675 | |
Dynabeads SILANE Genomic DNA Kit | Thermo Fisher Scientific | 37012D | Used for genomic DNA isolation and purification after bisulfite conversion. Contains elution buffer to dilute samples. |
DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Used as a magnetic rack during DNA isolation and purification |
eBioscience Essential Human T cell Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42923 | |
eBioscience Essential Human Th1/Th17 Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42927 | |
eBioscience Essential Human Treg Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42925 | |
Eppendorf SmartBlock 2 mL | Eppendorf | 5362000035 | |
Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | Recommended sample mixer |
NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND 1000 | |
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Applied Biosystems | AM12450 | |
QuantStudio 12S Flex | Applied Biosystems | 4470661 | |
TE, pH 8.0, RNase-free | Thermo Fisher Scientific | AM9849 | |
Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | H2KT17113 |