Summary
Burada kantitatif PCR (qPCR) kullanılarak saptanan epigenetik imzalar ile bağışıklık hücresi kimliğini ve saflığını belirlemenin sağlam bir yöntemini tanımlıyoruz. Belirli bir lokustaki DNA demethylation belirli bir hücre tipi için benzersiz bir tanımlayıcı olarak hizmet verir ve CD8+ veya Th17 T hücrelerinin tanımlanmasına olanak tanır.
Abstract
Bağışıklık hücre alt tipi popülasyon frekansları T hücre tedavilerinin etkinliği üzerinde büyük bir etkiye sahip olabilir. Akış sitometrisi gibi mevcut yöntemler, belirli numune gereksinimlerine, yüksek numune girdisine sahiptir, düşük üretim emarelerine sahiptir ve standartlaştırılması zordur, bunların hepsi de geliştirme sırasında hücre terapisi ürünlerinin karakterizasyonuna zarar verir ve Üretim.
Burada açıklanan tahliller, izole genomik DNA (gDNA) kullanarak hücrelerin heterojen bir karışımında bağışıklık hücre tiplerini doğru bir şekilde tanımlar ve ölçer. DNA metilasyon desenleri bisülfit dönüşüm yoluyla ortaya çıkar, metillenmemiş sitozinlerin urasillere dönüştürüldüğü bir süreç. Metillenmemiş DNA bölgeleri, dönüştürülmüş alanları hedefleyen astarlar kullanılarak qPCR amplifikasyonu ile tespit edilir. Bir benzersiz lokus başına tsur ölçülür ve belirli bir hücre türü için doğru bir tanımlayıcı olarak hizmet vermektedir. Tahliller sağlamdır ve CD8+, düzenleyici ve Th17 T hücrelerini yüksek bir iş elde etme biçimiyle tanımlar. Bu optimize tahliller potansiyel hücre tedavisi süreci için süreç içi ve ürün serbest bırakma testi için kullanılabilir.
Introduction
Hücresel immünoterapiT hücrelerinin kullanımı son on yılda önemli ölçüde artmıştır, özellikle şeyrerik antijen reseptörünün gelişiyle (CAR) T hücre teknolojisi1. T hücre tabanlı tedaviler büyük klinik başarı ile karşılanmış olsa da, onlar heterojen ve hücre özellikleri ve kimlikleri donörler arasında önemli ölçüde değişebilir2. T hücre popülasyonlarının heterojenliği terapötik etkinlik üzerinde önemli etkilere sahip olabilir ve klinik çalışmalardan elde edilen sonuçları karmaşıkhale getirebilir. Bu nedenle, T hücre immünoterapilerinin optimal formülasyonlarını belirlemek için ürün üretimi ve formülasyonu sırasında T hücre heterojenitesini anlamak çok önemlidir.
Geniş anlamda, T hücreleri iki gruba ayrılabilir: CD4+ yardımcı T hücreleri, immünomodülatör sitokinler salgılayan, ve CD8+ sitotoksik T hücreleri, hangi doğrudan büyük histokompatibilite kompleksi üzerinde cognate antijen sunan hücreleri lyse (MHC) I molekülleri. CD4+ yardımcı T hücreleri, benzersiz bir sitokin kümesi oluşturan sayısız özel alt kümeye farklılaşabilir. Bazı son hücre ürününde CD4 + CD8 + T hücreleri için tanımlanmış bir oranı in vivo etkinliği ve kalıcılık maksimize ama hücre üretimi karmaşık olabilir öneririz3. Düzenleyici T hücreleri (Tregs), CD4 + T hücrelerinin bir alt kümesi, immünsupresif ve bağışıklık hücrelerinin aktivasyonunu azaltır. Düzenleyici T hücreleri tümör toleransı aracılık karıştığı olmuştur ve, CAR T hücre üretimi sırasında varsa, CAR T hücrelerinin antitümör bağışıklık yanıtı inhibe edebilirsiniz4,5,6. T helper 17 (Th17) T hücreleri gibi diğer CD4+ alt kümeleri tümör temizliğini teşvik eder ve T hücre tedavilerinin etkinliğini artırmak için kullanılabilir. Böylece, artan Th17 CD4 + T hücreleri interlökin artan üretim 17 (IL-17) antitümör bağışıklık yanıtı5teşvik katı tümör ayarlarında özel ilgi olduğunu 5,7,8,9. Tümör yanıtlarında Th17 hücrelerinin önemini anlamak in vitro7,9bu hücreleri oluşturmak için stratejiler içine daha fazla araştırma yol açmıştır . Bu nedenle, bu T hücre alt kümelerini tespit etme yöntemleri T hücre tedavilerini optimize etmek için çok önemlidir ve sağlam, kolay, ölçeklenebilir ve tekrarlanabilir olmalıdır.
Akış sitometri bir bağışıklık hücresinin kimliğini belirlemek için en yaygın yöntemdir. Ancak, akış sitometri onlar hasat aynı gün analiz edilmelidir canlı, bozulmamış hücreleri gerektirir. Hücre içi sitokin boyama (ICS) için, protein salgıinin t hücreleri içinde sitokinler tutmak için gereklidir. Ancak, farklı inhibitör bileşikleri belirli sitokinlerin salgılanması üzerinde diferansiyel etkileri vardır, kullanıcıların ilgi sitokin tespiti için özel kokteyller oluşturmak zorunda10,11. Ayrıca, akış sitometri sadakat özellikle ve güçlü hedeflerine bağlamak antikor klonlar dayanır. Farklı antikor klonların kullanımı değişen sonuçlara neden olabilir ve kesin olmayan sonuçlara yol açabilir, bu da yöntemin12'yistandartlaştırmasını zorlaştırabilir. Ayrıca, akış sitometrisi yoluyla toplanan verilerin analizi ve böylece verilerden elde edilen sonuçlar, kapılar13,14ayarlanır nasıl dayalı kullanıcılar arasında büyük ölçüde değişebilir. Bu nedenlerden dolayı, akış sitometrihücre tedavisi gelişimi sırasında hassas kalite kontrolü için ideal değildir.
Spesifik gen loci'nde genomik metilasyonun değerlendirilmesi hücre kimliğini belirlemede alternatif bir yöntemdir. Belirli hücre türlerini tanımlamak için DNA metilasyon kullanmanın mantığı birden fazla makalede tanımlanmıştır ve belirli bir hücre popülasyonunda bulunan belirli metilasyon örüntülerine dayanır15,16,17. Hedef hücrelerde, bazı siteler metillenmemiş nükleotidler içerirken, hedef olmayan hücrelerde bu bölgeler metillenmiştir. Bu desen, sadece metillenmemiş sitozin nükleotitlerini (C) urasil (U) dönüştüren bisülfit dönüşüm yoluyla saptanabilir. Astar lar ve problar dönüştürülen sitelere karşı tasarlanabilir, daha sonra güçlendirilmiş ve qPCR16ile tespit.
Burada açıklanan analiz, heterojen popülasyonlarda immün hücre alt tiplerinin sıklığını, bir temizlik genine göre spesifik metillenmemiş lokus sayısını ölçerek ölçür. CD8 B geni için metillenmemiş düzenleyici elementlerin kopyaları CD8 testinde, FoxP3 Treg'de ve IL-17'de Th17'de bu tsözde ölçülür. Bu loci ilgi belirli hücre popülasyonu izole tarafından tespit edildi (örneğin, CD8 + T hücreleri) ve sadece bu hücre tipinde metillenmemiş loci tanımlamak için bisülfit sıralama gerçekleştirerek15. Astar ve problar benzersiz metillenmemiş loci karşı geliştirilen ve örnekleri qPCR ile analiz edilir. Bilinen kopya sayılarının standart eğrisi, yüksek kopya numarası standart plazmidin seyreltilmesinden oluşturulur ve ct değerinin transkript kopya numarasına dönüştürülmesine olanak sağlar.
Test performansını değerlendirmek için, referans gDNA ve kalibratör plazmidi de dahil olmak üzere kontrol örnekleri gereklidir. Referans genomik malzeme bilinen bağışıklık hücresi frekansları ile birden fazla donör birhavuzkan örneğidir ve bir kalite kontrolü için kullanılır (QC) tahsin performans kontrolü. Kalibratör örneği, equimolar oranlı CD8, FoxP3 ve GAPDH gen dizilerini içeren sentezlenmiş bir plazmiddir. Farklı genomik bölgelerdeki bisülfit dönüşümleri verim açısından farklılık göstereceği için bisülfit dönüşüm verimliliğinin bir ölçüsü olarak kullanılır. Kalibratör içinde HEDEFIN GAPDH'ye oranı 1'dir, ancak bisülfit dönüşüm verimliliğindeki farklılıklar nedeniyle bu oran değişebilir. Bu kalibrasyon faktörü CD8 ve Treg tahlillerine uygulanır. Treg testinde kullanılan tilkip3 geni X kromozomu üzerinde yer alır. Bu test FoxP3 sadece metillenmemiş kopyaları ölçer ve FoxP3 sadece bir kopyasını Tregs metillenmemiş olduğundan, bu test seks agnostik ve hem erkek hem de kadın örnekleri ile kullanılabilir18. Th17 testi, temizlik geni olarak kalibratör numunesi veya GAPDH kullanmaz. Bunun yerine, Th17 dışı hücrelerde bulunan metillenmiş lokusları hedefleyen başka bir astar seti dahildir ve toplam hücre sayısı IL-17'nin metillenmiş ve metillenmemiş kopyalarının toplamıile yansıtılır. QPCR'den elde edilen veriler, veriler üzerinde kalite kontrol denetimleri gerçekleştiren ve başlangıç popülasyonu içindeki hedef hücrenin yüzdesini hesaplayan önceden ayarlanmış bir analiz şablonuna girilir. Bu, otomatik ve tarafsız veri analizi sağlayarak kullanıcı öznelliğini ortadan kaldırır ve standartlaştırma yeteneklerini geliştirir.
Bu titret, kültürlü veya sabit hücreler veya dondurulmuş hücre peletleri kullanılarak bir lökapheresis prosedürü ile izole edilebilir gDNA kullanır. Düşük numune gereksinimi, numune başlangıç materyalinde esneklik, yüksek doğruluk ve standart analiz, akış sitometrisi ile ilişkili sınırlamaları gidermektedir ve hücre tedavisi prosesi gelişimi sırasında kalite kontrol amaçları için idealdir.
Protocol
Tüm insan örnekleri, insan araştırma etiği yönergelerini izleyerek ticari bir kaynaktan elde edilebildi.
1. Genomik DNA izolasyonu
NOT: Genomik DNA izolasyonu, periferik kan mononükleer hücreleri (PBMCs), saflaştırılmış T hücreleri veya diğer hematopoetik hücre tipi gibi herhangi bir hematopoetik hücreden ticari olarak kullanılabilen bir kit (Bkz. Malzeme Tablosu)kullanılarak gerçekleştirilir. Bu deneyde üç farklı insan donörün periferik kan mononükleer hücreleri (PBMCs) ve T hücreleri kullanılmıştır.
- 1-2 x 106 hematopoetik hücreleri konik bir tüpe yerleştirin ve santrifüj 400 x g 10 dakika boyunca yerleştirin.
- Supernatant'ı tamamen aspire edin.
- Numuneye 350 μL lysis/bağlayıcı tampon ekleyin ve 55 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.
- 30 s için hücre süspansiyon ve girdap 350 μL proteinaz K (20 mg /mL) 50 μL ekleyin.
- 50 μL DNA bağlayıcı paramanyetik boncuk ve 400 μL %100 isopropanol ekleyin ve oda sıcaklığında 3 dakika kuluçka (RT).
- Tüpü 2 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve boncukları rahatsız etmemeye özen tonuyla süpernatantı çıkarın. DNA bu adımda manyetik boncuklara bağlı.
- 950 μL yıkama tamponu ekleyin 1. Girdap 30 s ve tekrar adım 1.6 için.
- Adımı 1.7'yi tekrarlayın.
- 950 μL yıkama tamponu 2 ekleyin. Girdap 30 s ve tekrar adım 1.6 için.
- 2 dk. Tüpü manyetik bir standa 1 dakika boyunca 100 μL elüsyon tamponu ve girdap ekleyin ve gDNA içeren süpernatantı yeni bir tüpe aktarın.
- 260 nm, 280 nm ve 230 nm'de OD elde ederek bir florimetre kullanarak gDNA'nın saflığını ölçmek için hematopoetik hücrelerden izole edilen gDNA'nın 1 μL'sini kullanın. 260 ve 280 nm'deki optik yoğunluk (OD oranı) oranının 1.7-2.0, 260 ve 230 nm'deki OD oranının 1.5-2.4 arasında olduğundan emin olun.
2. Örnek hazırlama
- Bir termomiker 56 °C'ye önceden ısıtın.
- Tüm numuneler, kalibratörler ve referans malzeme için 2 mL'lik tüpleri etiketleyin.
- Rt'de numuneleri ve kalibratörü elüsyon arabelleğiyle (adım 1 için kullanılan kit ile birlikte kullanılabilir) seyreltin.
- Tüm deneysel numuneler için gDNA'yı toplam 142 μL hacmine seyreltin. Örneğin, 100 ng/μL'de 4 μL gDNA'yı 138 μL elüsyon tamponuna seyreltin.
NOT: 400-1.200 ng gDNA teşrin için kullanılabilir. - Kalibratörün 75 μL'sini toplam 142 μL hacmine seyreltin.
- Referans gDNA konsantrasyonunu bir spektrofotometre ile kontrol edin, BOŞ olarak TE (pH = 8.0) kullanarak.
- Referans gDNA'nın 1.000-1.200 ng'sini toplam 142 μL hacmine seyreltin. Örneğin, 100 ng/μL'de 10μL referans gDNA'yı 132 μL elüsyon tamponuna seyreltin.
- Tüm deneysel numuneler için gDNA'yı toplam 142 μL hacmine seyreltin. Örneğin, 100 ng/μL'de 4 μL gDNA'yı 138 μL elüsyon tamponuna seyreltin.
- Tüpleri 56 °C'de 5 dk 900 rpm'de bir termomikte kuluçkaya yatırın. Örnekleri toplamak için tüpleri kısaca aşağı çevirin.
3. Bisülfit dönüşüm
NOT: Bisülfit dönüşüm sırasında kuluçka sürelerini önerilen süreleri takip edin. Aşırı kuluçka veya az kuluçka tahkikat sonuçlarını etkileyecektir.
- Termomiker'i 80 °C'ye ayarlayın.
- Tüm tüplere 270 μL amonyum bisülfit ve 90 μL tetrahidrofurfuryl alkol (THFA) ekleyin. Girdap tamamen karıştırmak ve kısaca alt sıvı toplamak için örnekleri aşağı spin.
- Tüpleri 80 °C'de bir termomikte 900 rpm'de 45 dk'ya inküp atın. Bir ısı bloğu kullanıyorsanız, kuluçka sırasında 1-2 s her 4,5 dk için tüpler girdap.
- Kısaca örnekleri aşağı spin ve adım 4 veya 5 ile devam etmeden önce 3-5 dakika boyunca RT soğumasını bekleyin. Son hacim ~500 μL olmalıdır.
4. CD8 ve Treg tahlilleri
- Bisülfit dönüşüm sonrası DNA arınması
NOT: Bu adım, bisülfitdönüştürülmüş DNA üzerinde ticari olarak kullanılabilen DNA arıtma kiti (bkz. Malzemeler Tablosu)kullanılarak gerçekleştirilir. Reaktiflerin kullanmadan önce RT'ye ısıtıldığından emin olun.- Arınmaya başlamadan önce, 30 s. Şişelerde listelenen hacimleri izleyerek yıkama tamponlarına etanol ve izopropanol ekleyerek DNA izolasyonu paramanyetik boncuklarının homojen bir karışımını oluşturun ve 65 °C'ye kadar bir ısı bloğu ayarlayın.
- RT'de, adım 3.4'ten itibaren her tüpe 870 μL lizis/bağlayıcı tampon ve 105 μL DNA bağlayıcı paramanyetik boncuk ekleyin. Girdap tamamen karıştırmak ve kısaca tüpler aşağı spin.
- Tamamen karıştırmak için 2-propanol ve girdap 570 μL ekleyin.
- Bir thermomixer veya standart dönen karıştırıcı 50 rpm 7 dakika IÇIN RT tüpler inkübasyon.
- Kısaca tüpleraşağı dön. Tüpleri manyetik rafa yerleştirin ve 5 dakika kuluçkaya yatırın.
- Örnekler hala manyetik raftayken, boncukları rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın.
NOT: DNA boncuklara bağlıdır. - Tüpleri manyetik raftan çıkarın ve 900 μL yıkama tamponu 1 ekleyin. Girdap tüpler tamamen boncuklar resuspend ve daha sonra kısaca tüpler aşağı spin.
- Tüpleri manyetik rafa geri döndürün ve 3 dakika kuluçkaya yatırın.
- Örnekler hala manyetik raftayken, boncukları rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın.
- Yıkama yıkar (4.1.7-4.1.9), yıkama tamponu 1 ile bir kez, sonra iki kez yıkama tampon 2 ile tekrarlayın.
- Supernatant çıkardıktan sonra, kısaca tüpler aşağı spin ve 3 dakika için manyetik raf dönmek.
- Tüm artık yıkama tamponu 2 çıkarın ve tüpleri manyetik raftan çıkarın.
- 65 °C'de tüp kapakları açık boncukları 15 dk kurulayın.
- Her tüpe 60 μL elüsyon tamponu ekleyin ve 1400 rpm'de 7 dakika BOYUNCA RT'de kuluçkaya yatırın. Alternatif olarak, bir köpük adaptörü kullanarak orta hızda girdap.
- Kısaca tüpler aşağı spin ve 2 dakika için manyetik raf üzerine yerleştirin.
- Boncukları rahatsız etmeden 55 μL'lik yeni bir tüpe aktarın. Eluat, bisülfitli DNA içerir. DNA konsantrasyonu ölçümü gerekli değildir.
- QPCR'ı kur ve çalıştır
- QPCR makinesini ve yazılımını çalıştıran bilgisayarı açın.
- Yazılım kullanıcı arabiriminde yeni bir deneme oluşturun ve denemeyi çalıştırmak için hangi bloğun kullanıldığını seçin.
- Deneme türü olarak Standart Eğri'yi seçin.
- Varsa, hangi algılama kimyasını kullanmak istediğinizi seçin. Bu titret, TaqMan reaktiflerinikullanır. Aksi takdirde, pasif başvuru olarak ROX'u seçin.
- Varsa, Standartolarak çalıştırılanan enstrümanın özelliklerini seçin.
- Deneysel tasarımınızı hedefleri (örneğin, GAPDH veya CD8 ile FAM muhabir olarak) ve floresan olmayan bir sorgulayıcı atayarak tanımlayın.
- Standartlar, örnekler ve denetimler için örnek adlar atayın.
- Daha sonra, qPCR plakasına göre her iyi pozisyon atayın. Her kuyu, CD8 veya GAPDH gibi bir hedef ve örnek bir ad gerektirir. Her örnek üç etekli olarak çalıştırılır ve aletin plaka düzenine yansıtılmalıdır.
- Her standart görev Standart atamave Tablo 1'egöre son kopya numaralarını belirtin.
- Örnekler, kalibratör atayın ve Bilinmeyengörevi başvurun.
- NTC veya Nolarak hiçbir şablon denetimi için kuyular belirleyin.
- Lambda DNA'sının (10 ng/μL) seri seyreltmelerini standart olarak kullanılacak şekilde hazırlayın (Bkz. Tablo 1).
- QPCR ana karışık kokteyller, hedef hücre tipi için bir ve GAPDH için bir hazırlayın (Tablo 2'yebakınız). Tüm numuneleri, standartları ve NTC kontrolünü üç etekli olarak çalıştırın.
NOT: GAPDH toplam hücre sayısını ölçmek için kullanılır ve hedef amplifikasyona paralel olarak çalıştırılır. CD8 B geni için metillenmemiş düzenleyici elementlerin kopyaları CD8 testinde, FoxP3 Treg'de ve IL-17 Th17'de ölçülür. - QPCR için 96 kuyu plakası kullanın. Önce 3 μL şablon DNA'yı kuyulara yükleyin. Daha sonra, ana karışımın 7 μL'sini yükleyin.
- Plakayı bir qPCR filmle kapatın ve qPCR aletine yerleştirmeden önce plakayı kısa bir süre aşağı doğru çevirin.
- Tablo 3'tegösterildiği gibi qPCR çalıştırın.
- Çalışma tamamlandıktan sonra qPCR verilerini .txt veya .xlsx dosyası olarak dışa aktarın.
- Ct Ortalamasını, Ct Standart Sapmasını ve Kopya Numarasını hesaplamak için CD8 tahlilleri ve Treg tahlilleri (Bkz. Malzemeler Tablosu)için Analiz Şablonlarını kullanarak verileri analiz edin.
| İlk plazmid Kopya Numarası/3 μL | Birim | Dilüent DNA [1] | 3 μL başına Son Kopya Numarası | Etiket |
| 31250 | 1000 μL | - | 31250 | STD#1 |
| 31250 | 200 μL | 800 μL | 6250 | STD#2 |
| 6250 | 200 μL | 800 μL | 1250 | STD#3 |
| 1250 | 200 μL | 800 μL | 250 | STD#4 |
| 250 | 200 μL | 800 μL | 50 | STD#5 |
| 1250 | 30 μL | 1200 μL | 30 | STD#6 [2] |
| [1] TE'de 10 ng/μL Lambda DNA (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) | ||||
| [2] STD#6'yı hazırlamak için STD#3'u kullanın | ||||
Tablo 1: Standart seyreltmelerin hazırlanması. 31250-30 nüsha lık 4 günlük seyreltme standartları tabloya göre seyreltici olarak TE/lambda DNA kullanılarak hazırlanmıştır. Cd8 ve GAPDH için de aynı standart seyreltmeler kullanılmıştır. Standartlar -20 °C'de saklandı.
| Reaktif | Tutar |
| Lambda DNA (TE'de 50 ng/μL, pH8.0) | 1 μL |
| TaqMan tsay | 0,5 μL |
| Su, Nükleaz içermez | 0,5 μL |
| Ana Karışım | 5 μL |
| Toplam | 7 μL |
Tablo 2: QPCR kokteylinin hazırlanması. QPCR ana karışımını, şablon DNA'sını tabloya göre hariç olmak üzere, CD8 ve GAPDH için birer tane olmak üzere iki ayrı tüp halinde hazırlayın.
| Adım | Zaman | Temp | Döngü |
| Kuluçka öncesi | 35 dk | 95°C | 1X |
| Amplifikasyon | 15 sn | 95°C | 50X |
| 1 dk | 61°C | ||
| Cooldown | 5 sn | 42°C | 1X |
Tablo 3: CD8 ve Treg tsay için qPCR çalışma parametreleri. QPCR tabloda belirtilen parametrelere göre çalıştırıldı.
5. Th17 tsur
- Bisülfit dönüşüm sonrası DNA arınması
- Bölüm 4.1'de açıklandığı gibi arınma adımlarını gerçekleştirin.
- Numuneleri uzaklaştırmak için her tüpe 25 μL elüsyon tamponu ekleyin ve 1400 rpm'de 7 dakika BOYUNCA RT'de kuluçkaya yatırın. Alternatif olarak, bir köpük adaptörü kullanarak orta hızda girdap.
- Kısaca tüpler aşağı spin ve 2 dakika için bir manyetik raf üzerinde yerleştirin.
- Boncukları rahatsız etmeden 20 μL'lik yeni bir tüpe aktarın. Eluat, bisülfitli DNA içerir.
- DNA preamplifikasyonu
NOT: QPCR19ile doğru niceleme için düşük bolluk hedefleri için DNA preamplifikasyonu önerilir. Th17 metilasyon tayı bu nedenle preamplifikasyon gerektirecek şekilde tasarlanmıştır.- 2 μL'lik bisülfit dönüştürülmüş DNA'yı PCR şerit tüplerine aktarın. 2 μL su ile bir NTC tüp oluşturun.
- Tüm numuneler için preamplifikasyon ana karışımını oluşturun (bkz. Tablo 4).
- Her tüpe ana karışımın 23 l'sini ekleyin. Tüpleri kaplayın, girdap, ve kısaca tüpler aşağı spin.
- Isıtmalı bir kapak kullanarak bir termocycler üzerinde preamplifikasyon protokolü çalıştırın. (Tablo 5). Koşu tamamlandıktan sonra, kısaca tüpler aşağı spin.
- Güçlendirilmiş DNA'nın 2 μL'sini yeni tüplere aktarın ve numuneleri 1:40'da seyrelterek 78°L su ekleyin.
- qPCR kurmak ve çalıştırmak
- QPCR'ı kurmak ve çalıştırmak için bölüm 4.2'yi izleyin.
- Ct Ortalamasını, Ct Standart Sapmasını ve Kopya Numarasını hesaplamak için Th17 tahlilinin analiz şablonunu kullanarak verileri analiz edin (bkz. Malzeme Tablosu).
| Reaktif | Tutar |
| Su, Nükleaz içermez | 9,5 μL |
| Sıcak Başlangıç PCR Master Mix | 12,5 μL |
| Th17 PCR Astar | 1 μL |
| Toplam | 23 μL |
Tablo 4: Th17 testi için DNA'yı önceden yükseltin. Ön amplifikasyon reaksiyon ana karışımı tabloya göre hazırlanmıştır.
| Adım | Zaman | Temp | Döngü |
| Kuluçka öncesi | 35 dk | 95°C | 1X |
| Denatürasyon | 1 dk | 95°C | 12 X |
| Tavlama | 45 sn | 55°C | |
| Uzama | 30 sn | 72°C | |
| Son uzama | 10 dk | 72°C | 1X |
| Tutun | Belirsiz | 4°C |
Tablo 5: Th17 DNA'sını önceden nemleyin. Th17 DNA'sı gerçek qPCR'dan önce 12 döngü boyunca önceden yükseltildi.
Representative Results
Her üç metilasyon tahlilleri gDNA girişi ile başlar ve tüm hücre popülasyonu içinde CD8 + T hücreleri, Treg veya Th17 hücrelerinin bir yüzdesi ile sonuçlanır. Bisülfit dönüşümden sonra qPCR'den elde edilen veriler, sağlanan analiz şablonu kullanılarak analiz edilmiştir. Bu şablon, test örneklerindeki hedeflerin kopya sayısını ve toplam hücre sayısını tahmin etmek için standart örneklerden elde edilen standart eğrileri kullanmaktadır. Yüzde hücre türü daha sonra çözümleme şablonlarında tümleşik formüller kullanılarak hesaplandı. Şekil 1, hem akış sitometrisi hem de tanımlanan metilasyon testini kullanarak üç farklı donörden hem periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMCs) hem de T hücrelerinin analizinden elde edilen CD8+ testinden elde edilen temsili verileri göstermektedir. Her iki hücre tipinde tüm donörler arasında iki yöntem arasındaki eğilimler benzerdi. Şekil 2, Treg tsay'ından gelen temsili verileri gösterir. Üç saflaştırılmış Treg donörü hem metilasyon tabanlı qPCR hem de akış sitometrisi kullanılarak analiz edildi ve sonuçlar gösterilen grafikte çizildi. Her iki yöntemin sonuçları nispeten benzerdi. Ancak, her durumda akış sitometri daha yüksek değerler verdi. Şekil 3, akış sitometrisi ve metilasyon ile saptanan Th17 hücrelerinin karşılaştırılmasını göstermektedir. Bu grafikte, deneysel yöntemler için uyarılmış ve uyarılmamış koşullar vardır. Hücreler PMA ve iyonomisin ile uyarılma ve bir protein taşıma inhibitörü ile tedavi böylece akış sitometri 20 ile tespit edilebilir, böylece her hücre içinde mevcut IL-17A miktarını artırmak gerekir20. Metilasyon durumu, stimülasyon durumuna bakılmaksızın saptanabilir. Akış sitometrimetrimet ile karşılaştırıldığında Th17 hücrelerinin daha düşük seviyelerde verdi. Çıktının duyarlılığı ve özgüllüğü, Tablo 6'dagösterilen boş (LOB), algılama sınırı (LOD) ve nicelik (LOQ) değerleri sınırı ile gösterilmiştir.
Şekil 1: Üç farklı donör için hem PBMC'ler hem de T hücreleri için CD8+ yüzdelerinin akış ve metilasyon karşılaştırması. Üç farklı donörden gelen PBMC'ler ve T hücreleri tüm popülasyondaki CD8+ T hücrelerinin yüzdesi için akış sitometrisi veya metilasyon kullanılarak titreedildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Üç farklı donör için saflaştırılmış Treg için Treg yüzdelerinin akış ve metilasyon karşılaştırması. Saflaştırılmış Treg hücreleri tüm popülasyondaki Treg hücrelerinin yüzdesi için akış sitometrisi veya metilasyon kullanılarak titretilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Uyarılmış ve uyarılmamış deney grupları için Th17 yüzdelerinin akış ve metilasyon karşılaştırması. Uyarılmış ve uyarılmamış T hücreleri hem akış sitometrisi hem de metilasyon kullanılarak analiz edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Tahlil | Lob | Lod | LoQ |
| CD8 | 0 | 19 | 52 |
| Gapdh | 0 | 7 | 21 |
| TilkiP3 | 0 | 3 | 12 |
| Th17 TpG | 0 | 35 | 73 |
| Th17 CpG | 0 | 38 | 73 |
Tablo 6: LoB, LoD, Metilasyon bazlı tahliller için kopya numaralarıloq. Dozun duyarlılığı ve özgüllüğü MIQE yönergeleri21,22tarafından elde edilen LoB, LoD ve LoQ değerleri tarafından ayrıntılı olarak açıklanır. Genel olarak, en az 40 kopya doğru bu tahliller tarafından tespit edilebilir.
Discussion
Yeni immünoterapötiklerin gelişiyle, bağışıklık hücresi kimliği ve saflık tespit standart yöntemler için bir ihtiyaç vardır. Sağlam, doğrulanabilir ve ölçeklenebilir süreç içi ve serbest bırakma testleri için değerlendirme yöntemleri oluşturulacak ve hücre tabanlı tedavilerin ticarileştirilmesinde büyük bir sorun teşkil etmektedir. Akış sitometrisi şu anda bağışıklık hücre fenotipliği için en yaygın yöntem olmakla birlikte, yüksek numune kalitesi ve miktar gereksinimleri düzenli kullanım için zor olun. Ayrıca, iyi bir üretim uygulama (GMP) ortamında akış sitometri uygulanması operatöre bağlı gating stratejileri ve kullanılan her marker için referans standartlarının gerekliliği ile sınırlıdır13,14. Otomatik gating'in, sağlamlığı geliştirdiği gösterilmiş olsa da, henüz köklü bir kalite kontrol stratejisi değildir. Gen ekspresyonu profilleme de hücre tedavisi ürün kimliği ve saflık karakterize etmek için kullanılabilir iken, veriler yarı kantitatif ve emek yoğun. Ayrıca, RNA ve mikroRNA DNA'dan nispeten daha az kararlıdır ve sağlam ve tekrarlanabilir sonuçların eksikliğine katkıda bulunabilir. Böylece, belirli bir lokus epigenetik DNA metilasyon durumunu kullanarak bir hücre ilgi türünü tanımlamak ve ölçmek için kararlı, kolay, sağlam ve ölçeklenebilir bir yöntem sağlar.
Metilasyon desenlerinin fenotip hücrelerine saplanması üç kritik adıma dayanır: Birincisi, töz, açıklanan yöntemlere göre izole edilen gDNA kullanımını gerektirir. Yüksek kaliteli DNA gereklidir ve kullanılmadığı takdirde bisülfit dönüşümetkilenebilir 23,24. Düşük kaliteli DNA elde edilirse, daha fazla arıtma testi güvenilirliğini sağlamak için tavsiye edilir. İkinci olarak, metillenmemiş sitozinin urasil'e başarılı bisülfit dönüşümü gereklidir. Bisülfit dönüşümünde en kritik adım DNA denatürasyonudur23,25. Amonyum bisülfit kullanarak yüksek sıcaklık denatürasyonu, sodyum bisülfit aksine, dönüşüm verimliliği ve tutarlılığı artırır ve bu tahliller için önerilen süreçtir25,26. Kullanıcılar reaksiyonun 80 °C'de meydana geldiğinden ve numune karıştırmanın sık yapıldığından emin olmalıdır. Bu nedenlerden dolayı, dijital termomiker önerilir (Bkz. Malzeme Tablosu). Üçüncü olarak, qPCR hazırlanması sırasında uygun pipetleme tekniği takip edilmelidir. Üç teknik çoğaltmaqPCR reaksiyon sırasında kantitatif gerçek zamanlı PCR deneyleri (MIQE) yönergeleri27yayınlanması için minimum bilgilere uymak için gereklidir. Daha fazla teknik çoğaltma dahil kabul edilebilir, ancak gerekli değildir. Yanlış pipetleme tekniği ve/veya teknik çoğaltmalar dahil olmamak, güvenilmez qPCR sonuçlarına yol açacaktır.
Kritik adımlar izlenir ve istenen sonuçlar hala elde edilmezse, sorunu saptamak için tahmin içindeki birden çok denetimden yararlanılabilir. Uygun bisülfit dönüşüm bu talimi en önemli adımdır. Yanlış bisülfit dönüştürme, çözümleme şablonu tarafından hesaplanan başarısız bir kalibrasyon faktörü ve/veya referans değerleri ile vurgulanır. Bisülfit dönüşüm yanlış yapıldıysa (örneğin, reaksiyon RT'de gerçekleştirilseydi), qPCR sırasında amplifikasyon olmaz. Ayrıca, qPCR reaksiyon hazırlığı sırasında bir hata yapıldığında (örneğin, qPCR ana karışımı eklenmediyse) herhangi bir amplifikasyon görülmez. Bu iki sorun, standart örnekler araştırılarak ayrılabilir. Standart numunelerde amplifikasyon, ancak referans, kalibratör ve deneysel numuneler, bisülfit dönüşüm doğru gerçekleştirilmediğini gösterir. Örneklerin hiçbirinde amplifikasyon qPCR'nin doğru yapılmadığını göstermez.
Bu tahlil, diğer fenotitipleme yöntemleriile ilişkili sıkı örnekleme gereksinimi ve analiz değişkenliğini, özellikle akış sitometrisini ele alırken, dikkat edilmesi gereken sınırlamalar vardır. Bu tahlil, genellikle akış sitometrisi ile gerçekleştirilen çok katlı analizi yasaklayan hedef hücre için benzersiz bir tanımlayıcı olarak kullanılan tek bir lokus hedefler. Bu, Th17 gibi karmaşık hücre türlerini tanımlamayı zorlaştırır. Ancak, tek bir lokus metilasyon desenleri kullanımı birden fazla hücrenin doğru bir henotypik belirteç olduğu gösterilmiştir ve birden fazla klinik çalışmalarda kullanılmıştır15,16. Bu özellikle FOXP3 metilasyon imzaları değerlendirilmesi geçici FOXP3 ifade hücreleri gerçek Tregs tespit etmek için doğru ve kesin bir yöntemdir Tregsdoğrudur 28. Çok katlı analizkaybı, sorgulanan loci doğruluğu ile telafi edilir. Bir qPCR reaksiyonunda birden fazla loci tespitine olanak sağlamak için birden fazla qPCR boyave quenchers olabilir.
Bu töz hücre fenotip ve kimliğini belirlemede akış sitometrisi için alternatif bir yöntem olarak kullanılabilir. Bu tetkiksin sitometrinin tam olarak verdiği değerleri sağlamadığı unutulmamalıdır (Şekil 1-3). Bunun nedeni kısmen akış sitometrisi ile ilişkili veri analizinin değişkenliğinden kaynaklanmaktadır. Gating stratejisine bağlı olarak, akış sitometri sonuçları önemli ölçüde değişebilir. Bu durum özellikle, varyasyon katsayısının (CV) %1514'ekadar çıkabildiği IL-17 gibi hücre içi hedeflere bakmak için karmaşık boyama protokolleri kullanırken geçerlidir. Birden fazla kullanıcı arasında, sunulan test sürekli bir CV vardı <15%, test sağlamlığı ve geliştirilmiş standardizasyon yetenekleri destekleyen. Hücre stimülasyonu gerektiğinde epigenetik ve akış sitometrisi esaslı fenotipleme arasındaki en büyük farklar görülmektedir(Şekil 3). Akış sitometrisi ile Th17 hücrelerinin tespiti T hücre stimülasyonu ve hücre içi sitokin boyama için ortak bir protokol kullanılarak gerçekleştirildi29,30,31. Th17 fenotipinde epigenetik ölçüm ile akış sitometrisi arasındaki farklar IL-17 üretiminin kinetiklerinden kaynaklanabilir. Metilasyon imzaları sabit iken, protein üretimi zaman alır ve floresan antikorlar tarafından tespit edilecek yeterli miktarda mevcut olmalıdır20,32. Epigenetik tabanlı fenotileme yöntemleri ile tespit edilen Th17 hücrelerinin seviyesini görmek için protein taşıma inhibitörü ve hücre stimülasyon kokteyli ile 6 saat kuluçka gerekebilir. Değerlerin neden eşleşmediğini ve en doğru fenotipleme yöntemini belirlemek için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.
Bu raporda, basit ve sağlam bir şekilde hücrelerin heterojen bir karışımı nda bağışıklık hücre tiplerini nasıl tanımlayıp ölçebileceğimizi ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Tahliller tasarlanmış ve hücre bazlı terapötik süreç ve sürüm testi için potansiyel kullanım için optimize edin. Açıklanan tahliller hücre terapisi uygulamalarında kullanılacak yüksek nitelikli hammadde ihtiyacını karşılar. Akış sitometrisinin eksikliklerini ve stabilite, numune gereksinimleri, önceden stimülasyon, hücre içi boyama için hücresel permeabilizasyon ve veri analizinin öznelliği gibi diğer moleküler yöntemlerin eksikliklerini gidererek, açıklanan tahliller aynı doğrultudadır. hücre tabanlı tedavilerin ticarileştirilmesi hedefleri ile.
Disclosures
Suman K. Pradhan, Jerry Guzman, Carl Dargitz, Mark Landon ve Uma Lakshmipathy Thermo Fisher Scientific tarafından istihdam edilmektedir. Sven Olek, Bjoern Samans ve Ulrich Hoffmueller sırasıyla Epiontis şirketinin kurucusu ve çalışanlarıdır. Bu makalenin yapımında yazı yardımı kullanılmadı.
Acknowledgments
Proje Thermo Fisher Bilimsel Intramural hibe tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0 ml Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 22363344 | |
| Analysis template for CD8 assay | Click Here | ||
| Analysis template for Th17 assay | Click Here | ||
| Analysis template for Treg assay | Click Here | ||
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer, blue/red/violet6/yellow | Thermo Fisher Scientific | A29004 | |
| CTS PureQuant CD8+ T-Cell Assay | Thermo Fisher Scientific | A43674 | |
| CTS PureQuant Th17 Assay | Thermo Fisher Scientific | A43676 | |
| CTS PureQuant Treg Assay | Thermo Fisher Scientific | A43675 | |
| Dynabeads SILANE Genomic DNA Kit | Thermo Fisher Scientific | 37012D | Used for genomic DNA isolation and purification after bisulfite conversion. Contains elution buffer to dilute samples. |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Used as a magnetic rack during DNA isolation and purification |
| eBioscience Essential Human T cell Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42923 | |
| eBioscience Essential Human Th1/Th17 Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42927 | |
| eBioscience Essential Human Treg Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42925 | |
| Eppendorf SmartBlock 2 mL | Eppendorf | 5362000035 | |
| Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | Recommended sample mixer |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND 1000 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Applied Biosystems | AM12450 | |
| QuantStudio 12S Flex | Applied Biosystems | 4470661 | |
| TE, pH 8.0, RNase-free | Thermo Fisher Scientific | AM9849 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | H2KT17113 |
References
- Hartmann, J., Schüßler-Lenz, M., Bondanza, A., Buchholz, C. J. Clinical development of CAR T cells-challenges and opportunities in translating innovative treatment concepts. EMBO Molecular Medicine. 9, 1183-1197 (2017).
- Graham, C., Jozwik, A., Pepper, A., Benjamin, R. Allogeneic CAR-T Cells: More than Ease of Access? Cells. 7, E155 (2018).
- Turtle, C. J., et al. CD19 CAR-T cells of defined CD4+:CD8+ composition in adult B cell ALL patients. Journal of Clinical Investigation. 126, 2123-2138 (2016).
- Akalin, I., et al. Effects of Chimeric Antigen Receptor (CAR) Expression on Regulatory T Cells. Molecular Therapy. 17, S25 (2009).
- Knochelmann, H. M., et al. CAR T Cells in Solid Tumors: Blueprints for Building Effective Therapies. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Chen, M. L., et al. Regulatory T cells suppress tumor-specific CD8 T cell cytotoxicity through TGF-β signals in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102, 419-424 (2005).
- Muranski, P., et al. Tumor-specific Th17-polarized cells eradicate large established melanoma. Blood. 112, 362-373 (2008).
- Majchrzak, K., et al. Exploiting IL-17-producing CD4+ and CD8+ T cells to improve cancer immunotherapy in the clinic. Cancer Immunology, Immunotherapy. 65, 247-259 (2016).
- Guedan, S., et al. ICOS-based chimeric antigen receptors program bipolar TH17/TH1 cells. Blood. 124, 1070-1080 (2014).
- Vicetti Miguel, R. D., Maryak, S. A., Cherpes, T. L. Brefeldin A, but not monensin, enables flow cytometric detection of interleukin-4 within peripheral T cells responding to ex vivo stimulation with Chlamydia trachomatis. Journal of Immunological Methods. 384, 191-195 (2012).
- Lovelace, P., Maecker, H. T. Multiparameter Intracellular Cytokine Staining. Methods in Molecular Biology. 699, 165-178 (2011).
- Presicce, P., Moreno-Fernandez, M. E., Lages, C. S., Orsborn, K. I., Chougnet, C. A. Association of two clones allows for optimal detection of human FOXP3. Cytometry A. 77, 571-579 (2010).
- Pachón, G., Caragol, I., Petriz, J. Subjectivity and flow cytometric variability. Nature Reviews Immunology. 12, 396 (2012).
- Westera, L., et al. Centrally Determined Standardization of Flow Cytometry Methods Reduces Interlaboratory Variation in a Prospective Multicenter Study. Clinical and Translational Gastroenterology. 8, e126 (2017).
- Baron, U., et al. Epigenetic immune cell counting in human blood samples for immunodiagnostics. Science Translational Medicine. 10, (2018).
- Kleen, T. O., Yuan, J. Quantitative real-time PCR assisted cell counting (qPACC) for epigenetic - based immune cell quantification in blood and tissue. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 46 (2015).
- Rapko, S., et al. DNA methylation analysis as novel tool for quality control in regenerative medicine. Tissue Engineering. 13, 2271-2280 (2007).
- Wieczorek, G., et al. Quantitative DNA Methylation Analysis of FOXP3 as a New Method for Counting Regulatory T Cells in Peripheral Blood and Solid Tissue. Cancer Research. 69, 599-608 (2009).
- Andersson, D., et al. Properties of targeted preamplification in DNA and cDNA quantification. Expert Review of Molecular Diagnosis. 15, 1085-1100 (2015).
- Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 159, 197-207 (1993).
- Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of Blank, Limit of Detection and Limit of Quantitation. Clinical Biochemistry Reviews. 29, S49-S52 (2008).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55, 611-622 (2009).
- Li, Y., Tollefsbol, T. O. DNA methylation detection: Bisulfite genomic sequencing analysis. Methods in Molecular Biology. 791, 11-21 (2011).
- Warnecke, P. M., et al. Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing. Methods. 27, 101-107 (2002).
- Genereux, D. P., Johnson, W. C., Burden, A. F., Stöger, R., Laird, C. D. Errors in the bisulfite conversion of DNA: modulating inappropriate- and failed-conversion frequencies. Nucleic Acids Research. 36, e150 (2008).
- Darst, R. P., Pardo, C. E., Ai, L., Brown, K. D., Kladde, M. P. Bisulfite Sequencing of DNA. Current Protocols in Molecular Biology. 91, 7.9.1-7.9.7 (2010).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50, S1-S5 (2010).
- Baron, U., et al. DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. European Journal of Immunology. 37, 2378-2389 (2007).
- Yao, Z., et al. Human IL-17: a novel cytokine derived from T cells. Journal of Immunology. 155, 5483-5486 (1995).
- Lockhart, E., Green, A. M., Flynn, J. L. IL-17 production is dominated by gammadelta T cells rather than CD4 T cells during Mycobacterium tuberculosis infection. Journal of Immunology. 177, 4662-4669 (2006).
- Liang, S. C., et al. Interleukin (IL)-22 and IL-17 are coexpressed by Th17 cells and cooperatively enhance expression of antimicrobial peptides. Journal of Experimental Medicine. 203, 2271-2279 (2006).
- Olsen, I., Sollid, L. M. Pitfalls in determining the cytokine profile of human T cells. Journal of Immunological Methods. 390, 106-112 (2013).
