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Immunology and Infection

एपिजेनेटिक-आधारित मात्रात्मक पीसीआर का उपयोग करके प्रतिरक्षा सेल पहचान और शुद्धता का निर्धारण

Published: February 19, 2020 doi: 10.3791/60465
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 3, 3, 3, 1
1Cell Biology, Life Sciences Solutions, Thermo Fisher Scientific, 2California Polytechnic State University (Cal Poly), 3Epiontis GmbH, Precision for Medicine

Summary

यहां हम मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) का उपयोग करके पाए गए एपिजेनेटिक हस्ताक्षरों के माध्यम से प्रतिरक्षा सेल पहचान और शुद्धता का निर्धारण करने की एक मजबूत विधि का वर्णन करते हैं। एक विशिष्ट लोकस पर डीएनए डिमेथिलेशन एक विशेष सेल प्रकार के लिए एक अद्वितीय पहचानकर्ता के रूप में कार्य करता है और सीडी8 +, नियामक या Th17 टी कोशिकाओं की पहचान के लिए अनुमति देता है।

Abstract

प्रतिरक्षा कोशिका उपप्रकार जनसंख्या आवृत्तियों टी सेल चिकित्सा की प्रभावकारिता पर एक बड़ा प्रभाव हो सकता है। प्रवाह साइटोमेट्री की तरह वर्तमान तरीकों में विशिष्ट नमूना आवश्यकताएं होती हैं, उच्च नमूना इनपुट, कम थ्रूपुट होते हैं, और मानकीकरण करना मुश्किल होता है, जिनमें से सभी अपने विकास के दौरान सेल थेरेपी उत्पादों के लक्षण वर्णन के लिए हानिकारक होते हैं और विनिर्माण.

यहां वर्णित परखें अलग जीनोमिक डीएनए (जीडीएनए) का उपयोग कर कोशिकाओं के विषम मिश्रण में प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों की सही पहचान और मात्रा निर्धारित करती हैं। डीएनए मिथाइलेशन पैटर्न को बाइसुल्फेट रूपांतरण के माध्यम से प्रकट किया जाता है, एक प्रक्रिया जिसमें अनमेथिलेटेड साइटोसिन को यूरासिल में परिवर्तित किया जाता है। परिवर्तित क्षेत्रों को लक्षित करने वाले प्राइमर का उपयोग करके क्यूपीसीआर प्रवर्धन के माध्यम से अमेथिलेटेड डीएनए क्षेत्रों का पता लगाया जाता है। परख के अनुसार एक अद्वितीय लोकस मापा जाता है और एक विशिष्ट सेल प्रकार के लिए एक सटीक पहचानकर्ता के रूप में कार्य करता है। परख मजबूत हैं और सीडी 8 +, नियामक, और Th17 टी कोशिकाओं को उच्च थ्रूपुट तरीके से पहचानते हैं। इन अनुकूलित रूपों संभावित रूप से सेल थेरेपी प्रक्रिया के लिए इन-प्रोसेस और उत्पाद रिलीज परीक्षण के लिए उपयोग किया जा सकता है।

Introduction

सेलुलर इम्यूनोथेरेपी में टी कोशिकाओं का उपयोग पिछले दशक में काफी बढ़ गया है, विशेष रूप से चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर) टी सेल प्रौद्योगिकी1के आगमन के साथ । जबकि टी सेल आधारित चिकित्सा महान नैदानिक सफलता के साथ मुलाकात की गई है, वे विषम और सेल विशेषताओं और पहचान दानदाताओं2के बीच काफी भिंन हो सकते हैं । टी सेल आबादी की विषमता चिकित्सीय प्रभावकारिता पर प्रमुख प्रभाव हो सकता है और नैदानिक परीक्षणों से निष्कर्ष जटिल हो सकता है । इस कारण से, टी सेल इम्यूनोथेरपी के इष्टतम योगों को निर्धारित करने के लिए उत्पाद विनिर्माण और निर्माण के दौरान टी सेल विषमता को समझना महत्वपूर्ण है।

एक व्यापक अर्थ में, टी कोशिकाओं को दो समूहों में विभाजित किया जा सकता है: सीडी4 + सहायक टी कोशिकाएं, जो इम्यूनोमोडुलेटरी साइटोकिन्स, और सीडी8 + साइटोटॉक्सिक टी कोशिकाओं को स्रावित करती हैं, जो सीधे प्रमुख हिस्टोअनुकूली परिसर (एमएचसी) मैं अणुओं पर कॉग्नेट एंटीजन पेश करने वाली कोशिकाओं को लाय करती हैं। सीडी 4 + सहायक टी कोशिकाएं विशिष्ट सबसेट के असंख्य में अंतर कर सकती हैं जो साइटोकिन्स का एक अनूठा सेट पैदा करते हैं। कुछ सुझाव देते हैं कि अंतिम सेल उत्पाद में सीडी 8 + टी कोशिकाओं को सीडी 4 + का एक परिभाषित अनुपात वीवो प्रभावकारिता और दृढ़ता में अधिकतम करता है लेकिन सेल विनिर्माण3को जटिल बना सकता है। नियामक टी कोशिकाएं (ट्रेग्स), सीडी 4 + टी कोशिकाओं का सबसेट, इम्यूनोसप्रेसिव हैं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की सक्रियता को कम करते हैं। नियामक टी कोशिकाओं ट्यूमर सहिष्णुता मध्यस्थता में फंसाया गया है और, अगर कार टी सेल विनिर्माण के दौरान मौजूद है, कार टी कोशिकाओं4,5,6की एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बाधित कर सकते हैं । टी हेल्पर 17 (Th17) टी कोशिकाओं जैसे अन्य CD4 + सबसेट ट्यूमर निकासी को बढ़ावा देते हैं और टी सेल उपचारों की प्रभावकारिता बढ़ाने के लिए लीवरेज किया जा सकता है। इस प्रकार, Th17 CD4 + टी कोशिकाओं में वृद्धि ठोस ट्यूमर सेटिंग्स में विशेष रुचि है जहां इंटरल्यूकिन 17 (आईएल-17) के उत्पादन में वृद्धि एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया5,7,8,9को बढ़ावा देती है। ट्यूमर प्रतिक्रियाओं में Th17 कोशिकाओं के महत्व को समझने के लिए रणनीतियों में अधिक जांच के लिए इन कोशिकाओं को विट्रो7,9में उत्पन्न करने के लिए प्रेरित किया है । इसलिए, इन टी सेल सबसेट का पता लगाने के तरीके टी सेल उपचारों को अनुकूलित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं और मजबूत, आसान, स्केलेबल और प्रजनन योग्य होना चाहिए।

प्रतिरक्षा कोशिका की पहचान निर्धारित करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री सबसे आम तरीका है। हालांकि, प्रवाह साइटोमेट्री को लाइव, अक्षुण्ण कोशिकाओं की आवश्यकता होती है जिन्हें उसी दिन विश्लेषण किया जाना चाहिए जब उन्हें काटा जाता है। इंट्रासेलर साइटोकिन धुंधला (आईसीएस) के लिए, टी कोशिकाओं के भीतर साइटोकिनको बनाए रखने के लिए प्रोटीन स्राव अवरोध की आवश्यकता होती है। हालांकि, विभिन्न अवरोधक यौगिकों में विशिष्ट साइटोकिनके स्राव पर अंतर प्रभाव पड़ता है, जो उपयोगकर्ताओं को ब्याज10,11के साइटोकिन का पता लगाने के लिए विशेष कॉकटेल बनाने के लिए मजबूर करते हैं। इसके अतिरिक्त, प्रवाह साइटोमेट्री की निष्ठा एंटीबॉडी क्लोन पर निर्भर करती है जो विशेष रूप से और शक्तिशाली रूप से अपने लक्ष्य के लिए बाध्य करती है। विभिन्न एंटीबॉडी क्लोन का उपयोग अलग-अलग परिणाम पैदा कर सकता है और सटीक निष्कर्ष निकाल सकता है, जिससे विधि को12का मानकीकरण करना मुश्किल हो जाता है। इसके अलावा, प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से एकत्र किए गए डेटा का विश्लेषण, और इस प्रकार डेटा से तैयार किए गए निष्कर्ष, उपयोगकर्ताओं के बीच बहुत भिन्न हो सकते हैं कि गेट्स13,14कैसे सेट किए जाते हैं। इन कारणों से, सेल थेरेपी विकास के दौरान सटीक गुणवत्ता नियंत्रण के लिए प्रवाह साइटोमेट्री आदर्श नहीं है।

विशिष्ट जीन लोकी पर जीनोमिक मिथाइलेशन का आकलन सेल पहचान निर्धारित करने का एक वैकल्पिक तरीका है। विशिष्ट कोशिका प्रकारों की पहचान करने के लिए डीएनए मिथाइलेशन का उपयोग करने का औचित्य कई लेखों में वर्णित किया गया है और यह किसी दिए गए कोशिका जनसंख्या15,16,17में मौजूद विशिष्ट मिथाइलेशन पैटर्न पर निर्भर करता है । लक्ष्य कोशिकाओं में, कुछ साइटों में अमेथीटेड न्यूक्लियोटाइड्स होते हैं, जबकि गैर-लक्षित कोशिकाओं में ये साइटें मिथाइलेटेड होती हैं। इस पैटर्न का पता बाइसुल्फेट रूपांतरण के माध्यम से लगाया जा सकता है, एक प्रक्रिया जो विशेष रूप से अनमेथिलेटेड साइटोसाइन न्यूक्लियोटाइड्स (सी) को यूरासिल (यू) में परिवर्तित करती है। प्राइमर्स और जांच को परिवर्तित साइटों के खिलाफ डिजाइन किया जा सकता है, फिर क्यूपीसीआर16के माध्यम से परिलक्षित और पता लगाया जा सकता है।

यहां वर्णित परख एक हाउसकीपिंग जीन की तुलना में विशिष्ट अमेथीटेड लोकी की संख्या को निर्धारित करके विषम आबादी के भीतर प्रतिरक्षा कोशिका उपप्रकारों की आवृत्ति को मापता है । सीडी 8 बी जीन के लिए अमेथिलेटेड नियामक तत्वों की प्रतियां सीडी8 परख, ट्रेग में FoxP3, और इस परख में Th17 में आईएल-17 में मापा जाता है । इन लोकी की पहचान विशिष्ट कोशिका जनसंख्या ब्याज (जैसे, सीडी8 + टी कोशिकाओं) को अलग करके की गई थी और केवल उस सेल प्रकार15में अनमेथिलेटेड लोकी की पहचान करने के लिए बाइसुल्फेट अनुक्रमण का प्रदर्शन किया गया था। प्राइमर्स और जांच विशिष्ट रूप से अमेथाइलेटेड लोकी के खिलाफ विकसित किए जाते हैं और क्यूपीसीआर के माध्यम से नमूनों का विश्लेषण किया जाता है। ज्ञात कॉपी नंबरों का एक मानक वक्र उच्च कॉपी संख्या मानक प्लाज्मिड के कमजोर होने से बनाया गया है, जिससे सीटी मूल्य को ट्रांसक्रिप्ट कॉपी नंबर में बदलने की अनुमति होती है।

परख प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए, नियंत्रण नमूनों की आवश्यकता होती है, जिसमें एक संदर्भ जीडीएनए और एक कैलिब्रेटर प्लाज्मिड शामिल है। संदर्भ जीनोमिक सामग्री ज्ञात प्रतिरक्षा कोशिका आवृत्तियों के साथ कई दाताओं से एक पूल रक्त नमूना है और एक गुणवत्ता नियंत्रण (QC) परख प्रदर्शन की जांच के लिए प्रयोग किया जाता है । कैलिब्रेटर नमूना एक संश्लेषित प्लाज्मिड है जिसमें समतुल्य अनुपात में सीडी8, फॉक्सपी 3 और गगध जीन दृश्य शामिल हैं। इसका उपयोग बाइसुल्फेट रूपांतरण दक्षता के उपाय के रूप में किया जाता है, क्योंकि विभिन्न जीनोमिक क्षेत्रों के भीतर बाइसुल्फेट रूपांतरण दक्षता में भिन्न होंगे। अंशांकन के भीतर GAPDH के लिए लक्ष्य का अनुपात 1 है, लेकिन bisulfite रूपांतरण दक्षता के मतभेदों के कारण, अनुपात भिन्न हो सकते हैं । यह अंशांकन कारक सीडी 8 और ट्रेग परखों पर लागू होता है। FoxP3, Treg परख में इस्तेमाल जीन, एक्स गुणसूत्र पर स्थित है । क्योंकि यह परख केवल FoxP3 की अमेथीकृत प्रतियां उपाय है, और FoxP3 की केवल एक प्रति Tregs में unmethylated है, इस परख सेक्स नास्तिक है और दोनों पुरुष और महिला नमूनों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है18। Th17 परख एक हाउसकीपिंग जीन के रूप में एक अंशांकन नमूना या GAPDH का उपयोग नहीं करता है । इसके बजाय, गैर-Th17 कोशिकाओं में मौजूद मेथिलेटेड लोकी को लक्षित करने वाला एक और प्राइमर सेट शामिल है और कोशिकाओं की कुल संख्या आईएल-17 की मिथाइलेटेड और अमेथीटेड प्रतियों के योग से परिलक्षित होती है। क्यूपीसीआर से प्राप्त डेटा को प्रीसेट विश्लेषण टेम्पलेट में दर्ज किया जाता है जो डेटा पर गुणवत्ता नियंत्रण जांच करता है और शुरुआती आबादी के भीतर लक्ष्य सेल के प्रतिशत की गणना करता है। यह स्वचालित और निष्पक्ष डेटा विश्लेषण प्रदान करता है, जिससे उपयोगकर्ता व्यक्तिपरकता को हटाया जा सके और मानकीकरण क्षमताओं में सुधार हो।

यह परख जीडीएनए का उपयोग करती है, जिसे सुसंस्कृत या निश्चित कोशिकाओं, या जमे हुए सेल छर्रों का उपयोग करके ल्यूकापेरेसिस प्रक्रिया द्वारा अलग किया जा सकता है। कम नमूना आवश्यकता, नमूना शुरू सामग्री में लचीलापन, उच्च सटीकता, और मानकीकृत विश्लेषण प्रवाह साइटोमेट्री से जुड़ी सीमाओं को संबोधित करते हैं और सेल थेरेपी प्रक्रिया विकास के दौरान गुणवत्ता नियंत्रण उद्देश्यों के लिए आदर्श हैं।

Protocol

मानव अनुसंधान नैतिकता के लिए उनके दिशा-निर्देशों का पालन करते हुए एक वाणिज्यिक स्रोत से सभी मानव नमूने प्राप्त किए गए थे ।

1. जीनोमिक डीएनए अलगाव

नोट: जीनोमिक डीएनए अलगाव किसी भी हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके किया जाता है, जैसे परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाएं (पीबीएमसी), शुद्ध टी कोशिकाएं, या कोई अन्य हेमेटोपोइटिक सेल प्रकार। इस प्रयोग में तीन अलग-अलग मानव रक्तदाताओं से परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) और टी कोशिकाओं का इस्तेमाल किया गया।

  1. एक शंकुई ट्यूब में 1-2 x 106 हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं को रखें और 10 मिन के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें।
  2. अलौकिक पूरी तरह से एस्पिरेट।
  3. नमूने में लाइसिस/बाइंडिंग बफर का 350 माइक्रोन जोड़ें और 55 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. 30 एस के लिए सेल निलंबन और भंवर के ३५० μL के लिए प्रोटीन के ५० μL जोड़ें ।
  5. डीएनए बाध्यकारी पैरामैग्नेटिक मोतियों के 50 μL और 100% आइसोप्रोपेनॉल के 400 माइक्रोन जोड़ें और कमरे के तापमान (आरटी) पर 3 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. ट्यूब को 2 मिन के लिए मैग्नेटिक रैक पर रखें और माला को परेशान न करने का ध्यान रखते हुए सुपरनेटेंट को हटा दें। डीएनए इस कदम पर चुंबकीय मोतियों के लिए बाध्य है ।
  7. वॉश बफर 1 के 950 माइक्रोन जोड़ें। 30 एस के लिए भंवर और दोहराने कदम 1.6.
  8. दोहराएं चरण 1.7।
  9. वॉश बफर 2 के 950 माइक्रोन जोड़ें। 30 एस के लिए भंवर और दोहराने कदम 1.6.
  10. 2 मिन के लिए 100 माइक्रोन बफर और भंवर डालें। 1 मिन के लिए मैग्नेटिक स्टैंड पर ट्यूब रखें और जीडीएनए युक्त सुपरनेट को एक नई ट्यूब में ट्रांसफर करें।
  11. 260 एनएम, 280 एनएम और 230 एनएम पर ओडी प्राप्त करके फ्लोरीमीटर का उपयोग करके फ्लोरोफोटोमेट्री द्वारा जीडीएनए की शुद्धता को मापने के लिए हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं से अलग किए गए जीडीएनए के 1 μL का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि 260 और 280 एनएम पर ऑप्टिकल डेंसिटी (ओडी अनुपात) का अनुपात 1.7-2.0 के बीच है और 260 और 230 एनएम पर ओडी अनुपात 1.5-2.4 के बीच है।

2. नमूना तैयारी

  1. थर्मोमिक्सर को 56 डिग्री सेल्सियस तक प्रीहीट करें।
  2. सभी नमूनों, अंशांकन, और संदर्भ सामग्री के लिए लेबल 2 mL ट्यूब।
  3. आरटी में एल्यूटियन बफर (चरण 1 के लिए उपयोग की जाने वाली किट के साथ उपलब्ध) के साथ नमूनों और अंशांकन को पतला करें।
    1. सभी प्रायोगिक नमूनों के लिए, जीडीएनए को 142 माइक्रोन की कुल मात्रा में पतला करें। उदाहरण के लिए, 100 एनजी/माइक्रोन पर जीडीएनए के 4 माइक्रोन को एल्यूटॉन बफर के 138 माइक्रोन में पतला करें।
      नोट: जीडीएनए के 400-1,200 एनजी परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    2. कैलिब्रेटर के 75 माइक्रोन को 142 माइक्रोन की कुल मात्रा में पतला करें।
    3. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ संदर्भ जीडीएनए एकाग्रता की जांच करें, एक खाली के रूप में TE (पीएच = 8.0) का उपयोग कर।
    4. संदर्भ जीडीएनए के 1,000-1,200 एनजी को 142 माइक्रोन की कुल मात्रा में पतला करें। उदाहरण के लिए, 100 एनजी/μL पर संदर्भ जीडीएनए के 10 μl को कमजोर करें।
  4. एक थर्मोमिक्सर में 900 आरपीएम पर 5 मिन के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों को इनक्यूबेट करें। नमूने एकत्र करने के लिए ट्यूबों को संक्षेप में स्पिन करें।

3. बिसुल्फेट रूपांतरण

नोट: सुनिश्चित करें कि बिसुल्फेट रूपांतरण के दौरान ऊष्मायन समय अनुशंसित समय का पालन करें। ओवर-इनक्यूबेशन या अंडर-इनविटेशन परख के परिणामों को प्रभावित करेगा।

  1. थर्मोमिक्सर को 80 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें।
  2. सभी ट्यूबों में अमोनियम बाइसुल्फेट के 270 माइक्रोन और टेट्राहाइड्रोफ्यूरफ्यूरिज़ल अल्कोहल (टीएचएफए) के 90 माइक्रोन जोड़ें। भंवर पूरी तरह से मिश्रण करने के लिए और संक्षेप में नीचे तरल इकट्ठा करने के लिए नमूनों नीचे स्पिन ।
  3. ट्यूबों को थर्मोमिक्सर में 80 डिग्री सेल्सियस पर 45 डिग्री सेल्सियस पर 900 आरपीएम पर 45 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। यदि एक हीट ब्लॉक का उपयोग कर, 1-2 एस हर ४.५ इंच के लिए ट्यूबों भंवर ऊष्मायन के दौरान ।
  4. संक्षेप में नीचे नमूनों स्पिन और चरण 4 या 5 के साथ जारी रखने से पहले 3-5 मिन के लिए आरटी को शांत करने के लिए अनुमति देते हैं । अंतिम मात्रा ~ 500 μL होनी चाहिए।

4. सीडी 8 और ट्रेग परख

  1. बाइसुल्फेट रूपांतरण के बाद डीएनए शुद्धि
    नोट: यह कदम बिसुल्फेट-परिवर्तित डीएनए पर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए शुद्धिकरण किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके किया जाता है। सुनिश्चित करें कि अभिकर्मकों को उपयोग से पहले आरटी में गर्म किया जाता है।
    1. शुद्धि शुरू करने से पहले, 30 एस के लिए भंवर द्वारा डीएनए आइसोलेशन पैरामैग्नेटिक मोतियों का एक सजातीय मिश्रण बनाएं। बोतलों पर सूचीबद्ध मात्रा ओं का पालन करते हुए वॉश बफर में इथेनॉल और आइसोप्रोपेनॉल जोड़ें, और 65 डिग्री सेल्सियस तक हीट ब्लॉक सेट करें।
    2. आरटी में, चरण ३.४ से प्रत्येक ट्यूब में lysis/बाध्यकारी बफर के ८७० μL और डीएनए बाध्यकारी पैरामैग्नेटिक मोतियों के १०५ μL जोड़ें । भंवर पूरी तरह से मिश्रण करने के लिए और संक्षेप में ट्यूबों नीचे स्पिन ।
    3. पूरी तरह से मिलाने के लिए 2-प्रोपेनॉल और भंवर के 570 माइक्रोन जोड़ें।
    4. एक थर्मोमिक्सर या एक मानक घूर्णन मिक्सर में 50 आरपीएम पर 7 मिन के लिए आरटी पर ट्यूबों इनक्यूबेट।
    5. संक्षेप में ट्यूबों को स्पिन करें। ट्यूबों को चुंबकीय रैक पर रखें और 5 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
    6. नमूनों के साथ अभी भी चुंबकीय रैक पर, मोती परेशान किए बिना अधिनेत हटा दें।
      नोट: डीएनए मोतियों के लिए बाध्य है ।
    7. चुंबकीय रैक से ट्यूबों को हटा दें और वॉश बफर 1 के 900 माइक्रोन जोड़ें। मोतियों को पूरी तरह से फिर से निलंबित करने के लिए ट्यूबों को भंवर करें और फिर संक्षेप में ट्यूबों को स्पिन करें।
    8. ट्यूबों को चुंबकीय रैक पर वापस करें और 3 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
    9. नमूनों के साथ अभी भी चुंबकीय रैक पर, मोती परेशान किए बिना अधिनेत हटा दें।
    10. वॉश (4.1.7-4.1.9) दोहराएं, एक बार वॉश बफर 1 के साथ, फिर धोने बफर 2 के साथ दो बार।
    11. अधिनेता को हटाने के बाद, संक्षेप में ट्यूबों को स्पिन करें और 3 मिन के लिए चुंबकीय रैक पर लौटें।
    12. सभी अवशिष्ट धोने बफर 2 निकालें और चुंबकीय रैक से ट्यूबों को हटा दें।
    13. ट्यूब के ढक्कन के साथ मोतियों को 15 मिन के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर खुला सुखालें।
    14. प्रत्येक ट्यूब के लिए elution बफर के ६० μL जोड़ें और १,४०० आरपीएम पर 7 मिन के लिए आरटी पर इनक्यूबेट । वैकल्पिक रूप से, फोम एडाप्टर का उपयोग करके मध्यम गति से भंवर।
    15. संक्षेप में ट्यूबों को स्पिन करें और 2 मिन के लिए चुंबकीय रैक पर रखें।
    16. मोतियों को परेशान किए बिना एक नई ट्यूब पर एल्यूट के 55 माइक्रोन स्थानांतरित करें। एल्यूएट में बाइसुल्फेट-कन्वर्ट डीएनए होता है। डीएनए एकाग्रता को मापने की आवश्यकता नहीं है।
  2. क्यूपीसीआर की स्थापना और संचालन करें
    1. क्यूपीसीआर मशीन और उसके सॉफ्टवेयर को संचालित करने वाले कंप्यूटर को चालू करें।
    2. सॉफ्टवेयर यूजर इंटरफेस पर एक नया प्रयोग बनाएं और चुनें कि प्रयोग को चलाने के लिए किस ब्लॉक का इस्तेमाल किया जा रहा है।
    3. प्रयोग के प्रकार के रूप में मानक वक्र का चयन करें।
    4. यदि लागू हो, तो चुनें कि आप किस डिटेक्शन केमिस्ट्री का उपयोग करना चाहते हैं। यह परख TaqMan अभिकर्मकोंका उपयोग करता है । अन्यथा, निष्क्रिय संदर्भ के रूप में रॉक्स का चयन करें।
    5. यदि लागू हो, तो मानकके रूप में चलने वाले उपकरण के गुणों का चयन करें।
    6. लक्ष्य (जैसे, गैपडीएच या सीडी 8 को एफएएम के साथ रिपोर्टर के रूप में) और एक गैर-फ्लोरोसेंट क्वेंचर के साथ अपने प्रायोगिक डिजाइन को परिभाषित करें।
    7. मानकों, नमूनों और नियंत्रणों के लिए नमूना नाम आवंटित करें।
    8. इसके बाद, क्यूपीसीआर प्लेट के अनुसार प्रत्येक अच्छी स्थिति आवंटित करें। प्रत्येक अच्छी तरह से इस तरह के CD8 या GAPDH, और एक नमूना नाम के रूप में एक लक्ष्य की आवश्यकता है । प्रत्येक नमूना ट्रिपलेट में चलाया जाता है और साधन के लिए प्लेट लेआउट पर प्रतिबिंबित किया जाना चाहिए।
    9. प्रत्येक मानक को कार्य मानक असाइन करें और तालिका 1के अनुसार अंतिम कॉपी नंबर निर्दिष्ट करें।
    10. नमूने, अंशांकन आवंटित करें, और कार्य अज्ञातसंदर्भ।
    11. एनटीसी या एनके रूप में कोई टेम्पलेट नियंत्रण के लिए कुओं को नामित करें।
    12. मानक के रूप में इस्तेमाल किए जाने वाले लैम्ब्डा डीएनए (10 एनजी/माइक्रोन) के धारावाहिक कमजोरियां तैयार करें (तालिका 1देखें)।
    13. क्यूपीसीआर मास्टर मिक्स कॉकटेल तैयार करें, लक्ष्य सेल प्रकार के लिए एक और गगध के लिए एक (तालिका 2देखें)। ट्रिपलेट में सभी नमूने, मानक और एनटीसी नियंत्रण चलाएं।
      नोट: GAPDH कोशिकाओं की कुल संख्या की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है और लक्ष्य प्रवर्धन के साथ समानांतर में चलाया जाता है । सीडी 8 बी जीन के लिए अमेथिलेटेड नियामक तत्वों की प्रतियां सीडी8 परख, ट्रेग में FoxP3, और Th17 में आईएल-17 में मापा जाता है ।
    14. क्यूपीसीआर के लिए 96 वेल प्लेट का इस्तेमाल करें। पहले कुओं में टेम्पलेट डीएनए के 3 μL लोड। इसके बाद, मास्टर मिश्रण के 7 μL लोड करें।
    15. एक क्यूपीसीआर फिल्म के साथ प्लेट को सील करें और क्यूपीसीआर इंस्ट्रूमेंट में रखने से पहले प्लेट को संक्षेप में स्पिन करें।
    16. तालिका 3 में दिखाए गए क्यूपीसीआर को चलाएं।
    17. रन पूरा होने के बाद क्यूपीसीआर डेटा को .txt या.xlsx फ़ाइल के रूप में निर्यात करें।
    18. सीटी औसत, सीटी मानक विचलन और कॉपी नंबर की गणना करने के लिए सीडी 8 परख और ट्रेग परख (सामग्री की तालिकादेखें) के लिए विश्लेषण टेम्पलेट्स का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करें।
प्रारंभिक प्लाज्मिड कॉपी नंबर/3 माइक्रोन आयतन दिल्लुएंट डीएनए [1] अंतिम कॉपी नंबर प्रति 3 माइक्रोन लेबल
31250 1000 माइक्रोन - 31250 एसटीडी #1
31250 200 माइक्रोन 800 माइक्रोन 6250 एसटीडी #2
6250 200 माइक्रोन 800 माइक्रोन 1250 एसटीडी #3
1250 200 माइक्रोन 800 माइक्रोन 250 एसटीडी #4
250 200 माइक्रोन 800 माइक्रोन 50 एसटीडी #5
1250 30 माइक्रोन 1200 माइक्रोन 30 एसटीडी #6 [2]
[1] टीई में 10 एनजी/μL लैम्ब्डा डीएनए (10 mM Tris, 1 mM EDTA, पीएच 8.0)
[2] एसटीडी #6 तैयार करने के लिए एसटीडी #3 का उपयोग करें

तालिका 1: मानक कमजोर होने की तैयारी। 31250-30 प्रतियां फैले एक 4 लॉग कमजोर पड़ने मानकों को डिल्यूंट के रूप में TE/lambda डीएनए का उपयोग कर मेज के अनुसार तैयार किया गया । सीडी 8 और गगध दोनों के लिए एक ही मानक कमजोरियों का उपयोग किया गया था। मानकों को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया गया था।

अभिकर्मकों राशि
लैम्ब्डा डीएनए (टीई में 50 एनजी/माइक्रोन, पीएच8.0) 1 μL
TaqMan परख 0.5 माइक्रोन
पानी, Nuclease मुक्त 0.5 माइक्रोन
मास्टर मिक्स 5 माइक्रोन
कुल 7 माइक्रोन

तालिका 2: क्यूपीसीआर कॉकटेल की तैयारी। टेबल के अनुसार टेम्पलेट डीएनए को छोड़कर दो अलग-अलग ट्यूब, सीडी8 और गगध के लिए एक-एक में क्यूपीसीआर मास्टर मिक्स तैयार करें।

चरण समय Temp चक्र
पूर्व ऊष्मायन 35 मिन 95 डिग्री सेल्सियस 1X
प्रवर्धन 15 सेकंड 95 डिग्री सेल्सियस 50X
1 मिन 61 डिग्री सेल्सियस
Cooldown 5 सेकंड 42 डिग्री सेल्सियस 1X

तालिका 3: क्यूपीसीआर सीडी 8 और ट्रेग परख के लिए पैरामीटर चलाती है। क्यूपीसीआर को टेबल में निर्दिष्ट मापदंडों के अनुसार चलाया गया था।

5. Th17 परख

  1. बाइसुल्फेट रूपांतरण के बाद डीएनए शुद्धि
    1. धारा 4.1 में वर्णित शुद्धि चरणों का प्रदर्शन करें।
    2. नमूनों को एल्यूट करने के लिए, प्रत्येक ट्यूब में एल्यूशन बफर के 25 माइक्रोन जोड़ें और 1,400 आरपीएम पर 7 मिन के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें। वैकल्पिक रूप से, फोम एडाप्टर का उपयोग करके मध्यम गति से भंवर।
    3. संक्षेप में ट्यूबों को स्पिन करें और 2 मिन के लिए चुंबकीय रैक पर रखें।
    4. मोतियों को परेशान किए बिना एक नई ट्यूब में एल्यूट के 20 μL स्थानांतरित करें। एल्यूएट में बाइसुल्फेट-कन्वर्ट डीएनए होता है।
  2. डीएनए प्रीएम्पलीफिकेशन
    नोट: क्यूपीसीआर19के माध्यम से सटीक मात्रा के लिए कम बहुतायत लक्ष्यों के लिए डीएनए प्रीएम्पलीकरण की सिफारिश की जाती है । Th17 मिथाइलेशन परख इस कारण के लिए preamplification की आवश्यकता के लिए डिज़ाइन किया गया था ।
    1. बाइसुल्फेट-परिवर्तित डीएनए के 2 माइक्रोन को पीसीआर स्ट्रिप ट्यूब में स्थानांतरित करें। 2 माइक्रोन पानी के साथ एक एनटीसी ट्यूब बनाएं।
    2. सभी नमूनों के लिए प्रीएम्पलीफिकेशन मास्टर मिक्स बनाएं (टेबल 4देखें)।
    3. प्रत्येक ट्यूब में मास्टर मिक्स के 23 माइक्रोन जोड़ें। ट्यूब, भंवर कैप, और संक्षेप में ट्यूबों नीचे स्पिन ।
    4. गर्म ढक्कन का उपयोग करके थर्मोसाइकिलर पर प्रीएम्पलीकरण प्रोटोकॉल चलाएं। (तालिका5)। रन पूरा होने के बाद, संक्षेप में ट्यूबों को स्पिन करें।
    5. नई ट्यूबों के लिए प्रवर्धित डीएनए के 2 μL हस्तांतरण और पानी के ७८ μL जोड़ें, नमूनों को कमजोर 1:40 ।
  3. क्यूपीसीआर की स्थापना और रन
    1. क्यूपीसीआर की स्थापना और संचालन के लिए धारा 4.2 का पालन करें।
  4. सीटी औसत, सीटी मानक विचलन और कॉपी नंबर की गणना करने के लिए Th17 परख (सामग्री की तालिकादेखें) के लिए विश्लेषण टेम्पलेट का उपयोग करडेटा का विश्लेषण करें।
अभिकर्मक राशि
पानी, Nuclease मुक्त 9.5 माइक्रोन
हॉट स्टार्ट पीसीआर मास्टर मिक्स 12.5 माइक्रोन
Th17 पीसीआर प्राइमर 1 μL
कुल 23 माइक्रोन

तालिका 4: Th17 परख के लिए डीएनए को पूर्व बढ़ाना। प्री-प्रवर्धन रिएक्शन मास्टर मिक्स टेबल के हिसाब से तैयार किया गया था।

चरण समय Temp चक्र
पूर्व ऊष्मायन 35 मिन 95 डिग्री सेल्सियस 1X
डेनेटुरिशन 1 मिन 95 डिग्री सेल्सियस 12X
एनियलिंग 45 सेकंड 55 डिग्री सेल्सियस
बढ़ाव 30 सेकंड 72 डिग्री सेल्सियस
अंतिम विस्तार 10 मिन 72 डिग्री सेल्सियस 1X
पकड़ अनिश्चित 4 डिग्री सेल्सियस

तालिका 5: Th17 डीएनए Preamplify । Th17 डीएनए वास्तविक qPCR से पहले 12 चक्रों के लिए पूर्व परिलक्षित किया गया था ।

Representative Results

सभी तीन मिथाइलेशन परख पूरे सेल आबादी के भीतर सीडी 8 + टी कोशिकाओं, ट्रेग या Th17 कोशिकाओं के प्रतिशत में gDNA के इनपुट के साथ शुरू होते हैं। बाइसुल्फेट रूपांतरण के बाद क्यूपीसीआर से उत्पन्न डेटा का विश्लेषण प्रदान किए गए विश्लेषण टेम्पलेट का उपयोग करके किया गया था। इस टेम्पलेट ने मानक नमूनों से प्राप्त मानक घटता का उपयोग लक्ष्यों की प्रतिलिपि संख्या और परीक्षण नमूनों में कुल सेल की गिनती का अनुमान लगाने के लिए किया । प्रतिशत सेल प्रकार तो विश्लेषण टेम्पलेट्स में एकीकृत फार्मूले का उपयोग कर गणना की गई थी । चित्रा 1 सीडी8 + परख से प्रतिनिधि डेटा दिखाता है, जो तीन विभिन्न दानदाताओं से परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) और टी कोशिकाओं दोनों प्रवाह साइटोमेट्री और वर्णित मिथाइलेशन परख का उपयोग करके विश्लेषण करने से प्राप्त होता है। दोनों सेल प्रकार में सभी दाताओं में दो तरीकों के बीच रुझान समान थे । चित्रा 2 ट्रेग परख से प्रतिनिधि डेटा दिखाता है। तीन शुद्ध ट्रेग दाताओं दोनों मिथाइलेशन आधारित qPCR और प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग कर विश्लेषण किया गया और परिणाम दिखाए गए ग्राफ पर साजिश रची गई । दोनों तरीकों के परिणाम अपेक्षाकृत समान थे। हालांकि, सभी मामलों में प्रवाह साइटोमेट्री उच्च मूल्यों मिले। चित्रा 3 प्रवाह साइटोमेट्री और मिथाइलेशन के माध्यम से पता चला Th17 कोशिकाओं की तुलना से पता चलता है । इस ग्राफ में, प्रयोगात्मक तरीकों के लिए उत्तेजित और अउत्तेजित स्थितियां हैं। कोशिकाओं को प्रत्येक कोशिका के भीतर मौजूद आईएल-17ए की मात्रा बढ़ाने के लिए प्रोटीन परिवहन अवरोधक के साथ पीएमए और आयनमाइसिन और उपचार के साथ उत्तेजना की आवश्यकता होती है ताकि प्रवाह साइटोमेट्री20के माध्यम से इसका पता लगाया जा सके। उत्तेजना की स्थिति की परवाह किए बिना मिथाइलेशन स्थिति का पता लगाया जा सकता है। मिथाइलेशन की तुलना में फ्लो साइटोमेट्री ने Th17 कोशिकाओं के निचले स्तर को प्राप्त किया। परख की संवेदनशीलता और विशिष्टता को खाली (एलओबी) की सीमा, पता लगाने की सीमा (एलओडी) और तालिका 6में प्रदर्शित परिमाणन (LOQ) मूल्यों की सीमा से प्रदर्शित किया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: तीन अलग-अलग दानदाताओं के लिए पीबीएमसी और टी कोशिकाओं दोनों के लिए सीडी 8 + प्रतिशत की प्रवाह और मिथाइलेशन तुलना। तीन अलग-अलग दानदाताओं से पीबीएमसी और टी कोशिकाओं को या तो प्रवाह साइटोमेट्री या मिथाइलेशन का उपयोग करके पूरी आबादी में सीडी 8 + टी कोशिकाओं के प्रतिशत के लिए परख दिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: तीन अलग-अलग दानदाताओं के लिए शुद्ध ट्रेग के लिए ट्रेग प्रतिशत की प्रवाह और मिथाइलेशन तुलना। शुद्ध ट्रेग कोशिकाओं को या तो प्रवाह साइटोमेट्री या मिथाइलेशन का उपयोग करके पूरी आबादी में ट्रेग कोशिकाओं के प्रतिशत के लिए परायोकिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: उत्तेजित और अउत्तेजित प्रयोगात्मक समूहों के लिए Th17 प्रतिशत की प्रवाह और मिथाइलेशन तुलना। उत्तेजित और अउत्तेजित टी कोशिकाओं दोनों प्रवाह साइटोमेट्री और मिथाइलेशन का उपयोग कर विश्लेषण किया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

परख Lob LoD LoQ
सीडी8 0 19 52
गगध 0 7 21
फॉक्सपी3 0 3 12
Th17 टीपीजी 0 35 73
Th17 सीपीजी 0 38 73

तालिका 6: लोब, LoD, मिथाइलेशन आधारित परखों के लिए कॉपी नंबरों का LoQ । परख की संवेदनशीलता और विशिष्टता एलओसी, LoD और LoQ मूल्यों द्वारा विस्तृत है MIQE दिशा निर्देशों द्वारा प्राप्त21,22। सामान्य तौर पर, इन परखों से 40 प्रतियों का सही पता लगाया जा सकता है।

Discussion

नए इम्यूनोथेरप्यूटिक्स के आगमन के साथ, प्रतिरक्षा कोशिका पहचान और शुद्धता का पता लगाने के मानकीकृत तरीकों की आवश्यकता है। इन-प्रोसेस और रिलीज िंग टेस्टिंग के लिए मूल्यांकन विधियां जो मजबूत, मान्य और स्केलेबल हैं, स्थापित किए जाने और सेल-आधारित उपचारों के व्यावसायीकरण के लिए एक बड़ी चुनौती पैदा करने के लिए रहते हैं। जबकि फ्लो साइटोमेट्री वर्तमान में प्रतिरक्षा सेल फेनोटाइपिंग के लिए सबसे आम तरीका है, उच्च नमूना गुणवत्ता और मात्रा आवश्यकताओं को नियमित उपयोग के लिए मुश्किल बना देता है। इसके अलावा, एक अच्छे विनिर्माण अभ्यास (जीएमपी) वातावरण में प्रवाह साइटोमेट्री को लागू करना ऑपरेटर-निर्भर गेटिंग रणनीतियों और13,14उपयोग किए गए प्रत्येक मार्कर के लिए संदर्भ मानकों की आवश्यकता द्वारा सीमित है। हालांकि स्वचालित गेटिंग को परख मजबूती में सुधार करने के लिए दिखाया गया है, यह अभी तक एक अच्छी तरह से स्थापित गुणवत्ता नियंत्रण रणनीति नहीं है । जबकि जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग का उपयोग सेल थेरेपी उत्पाद पहचान और शुद्धता की विशेषता के लिए भी किया जा सकता है, डेटा अर्धमात्रात्मक और श्रम गहन हैं। इसके अतिरिक्त, आरएनए और माइक्रोआरएनए डीएनए की तुलना में अपेक्षाकृत कम स्थिर हैं और मजबूत और प्रजनन योग्य परिणामों की कमी में योगदान दे सकते हैं। इस प्रकार, एक विशिष्ट लोकस की एपिजेनेटिक डीएनए मिथाइलेशन स्थिति का उपयोग करने से कोशिका प्रकार की पहचान करने और मात्रा निर्धारित करने की एक स्थिर, आसान, मजबूत और स्केलेबल विधि प्रदान की जाती है।

फेनोटाइप कोशिकाओं के लिए मिथाइलेशन पैटर्न का पता लगाना तीन महत्वपूर्ण चरणों पर निर्भर करता है: सबसे पहले, परख के लिए जीडीएनए के उपयोग की आवश्यकता होती है, जो वर्णित तरीकों के अनुसार अलग-थलग है। उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए की आवश्यकता होती है और यदि उपयोग नहीं किया जाता है, तो बाइसुल्फेट रूपांतरण23,24प्रभावित हो सकता है। यदि कम गुणवत्ता वाले डीएनए प्राप्त किया जाता है, तो परख विश्वसनीयता सुनिश्चित करने के लिए आगे शुद्धिकरण की सिफारिश की जाती है। दूसरा, यूरासिल में अनमेथिलेटेड साइटोसाइन के सफल बाइसुल्फेट रूपांतरण की आवश्यकता है। बिसुल्फेट रूपांतरण में सबसे महत्वपूर्ण कदम डीएनए निंदा23,25है . सोडियम बाइसुल्फेट के विपरीत अमोनियम बाइसुल्फेट का उपयोग करके उच्च तापमान की निंदा, रूपांतरण दक्षता और स्थिरता को बढ़ाती है और इन परखों के लिए अनुशंसित प्रक्रिया25,26है। उपयोगकर्ताओं को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि प्रतिक्रिया 80 डिग्री सेल्सियस पर होती है और नमूना मिश्रण अक्सर किया जाता है। इन कारणों से, एक डिजिटल थर्मोमिक्सर की सिफारिश की जाती है (सामग्री की तालिकादेखें)। तीसरा, क्यूपीसीआर तैयारी के दौरान उचित पाइपिंग तकनीक का पालन किया जाना चाहिए। मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर प्रयोगों (MIQE) दिशानिर्देश27के प्रकाशन के लिए न्यूनतम जानकारी का पालन करने के लिए क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया के दौरान तीन तकनीकी प्रतिकृतियों की आवश्यकता होती है। अधिक तकनीकी प्रतिकृतियों को शामिल करना स्वीकार्य है लेकिन आवश्यक नहीं है । अनुचित पाइपिंग तकनीक और/या तकनीकी प्रतिकृतियों सहित नहीं अविश्वसनीय qPCR परिणाम के लिए नेतृत्व करेंगे ।

यदि महत्वपूर्ण चरणों का पालन किया जाता है और वांछित परिणाम अभी भी प्राप्त नहीं किए जाते हैं, तो परख के भीतर कई नियंत्रणों को इस मुद्दे को इंगित करने के लिए लीवरेज किया जा सकता है। उचित bisulfite रूपांतरण इस परख में सबसे महत्वपूर्ण कदम है । अनुचित बाइसुल्फेट रूपांतरण को एक असफल अंशांकन कारक और/या विश्लेषण टेम्पलेट द्वारा गणना किए गए संदर्भ मूल्यों द्वारा हाइलाइट किया जाएगा । यदि बाइसुल्फेट रूपांतरण गलत तरीके से किया गया था (उदाहरण के लिए, यदि प्रतिक्रिया आरटी पर की गई थी), तो क्यूपीसीआर के दौरान कोई प्रवर्धन नहीं होगा। इसके अलावा, यदि क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया तैयारी के दौरान कोई त्रुटि नहीं की गई थी (उदाहरण के लिए, यदि क्यूपीसीआर मास्टर मिश्रण नहीं जोड़ा गया था)। मानक नमूनों की जांच कर के इन दोनों मुद्दों को अलग किया जा सकता है। मानक नमूनों में प्रवर्धन, लेकिन संदर्भ, अंशांकन और प्रायोगिक नमूनों से संकेत नहीं मिलता कि बाइसुल्फेट रूपांतरण सही ढंग से नहीं किया गया था। किसी भी नमूने में प्रवर्धन नहीं होने से यह पता चलता है कि क्यूपीसीआर को सही ढंग से नहीं किया गया था ।

हालांकि यह परख अन्य फेनोटाइपिंग विधियों से जुड़े कड़े नमूना आवश्यकता और विश्लेषण परिवर्तनशीलता को संबोधित करता है, विशेष रूप से साइटोमेट्री प्रवाह, ऐसी सीमाएं हैं जिन्हें नोट किया जाना चाहिए। यह परख एक एकल लोकस को लक्षित करती है जिसका उपयोग लक्ष्य कोशिका के लिए एक अद्वितीय पहचानकर्ता के रूप में किया जाता है, जो मल्टीप्लेक्स विश्लेषण को प्रतिबंधित करता है जो आमतौर पर प्रवाह साइटोमेट्री के साथ किया जाता है। यह Th17 जैसे जटिल सेल प्रकारों की पहचान करना मुश्किल बनाता है। हालांकि, एक ही लोकस पर मिथाइलेशन पैटर्न का उपयोग कई कोशिकाओं का सटीक फेनोटाइपिक मार्कर दिखाया गया है और इसका उपयोग15,16कई नैदानिक परीक्षणों में किया गया है। यह विशेष रूप से ट्रेग्स में सच है जहां FOXP3 मिथाइलेशन हस्ताक्षर का आकलन क्षणिक FOXP3 से सच Tregs का पता लगाने के लिए एक सटीक और स्पष्ट तरीका हैकोशिकाओं को व्यक्त 28। मल्टीप्लेक्स विश्लेषण के नुकसान की भरपाई लोकी से पूछताछ की गई सटीकता से की जाती है । परख के भविष्य के पुनरावृत्तियों में एक क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया में कई लोकी का पता लगाने के लिए अनुमति देने के लिए कई क्यूपीसीआर रंग और बुझाने वाले शामिल हो सकते हैं।

इस परख का उपयोग सेल फेनोटाइप और पहचान निर्धारित करने में प्रवाह साइटोमेट्री के लिए एक वैकल्पिक विधि के रूप में किया जा सकता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यह परख सटीक मूल्यों है कि प्रवाह साइटोमेट्री करता है(आंकड़े 1-3)उपज नहीं है । यह प्रवाह साइटोमेट्री से जुड़े डेटा विश्लेषण की परिवर्तनशीलता के हिस्से में कारण है। गेटिंग रणनीति के आधार पर, प्रवाह साइटोमेट्री के परिणाम काफी भिन्न हो सकते हैं। आईएल-17 जैसे इंट्रासेल्युलर लक्ष्यों को देखने के लिए जटिल धुंधला प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय यह विशेष रूप से मामला है, जहां भिन्नता (सीवी) का गुणांक 15%14जितना अधिक हो सकता है। कई उपयोगकर्ताओं के बीच, परख लगातार प्रस्तुत की गई परख और 15% का सीवी था, जो परख और बेहतर मानकीकरण क्षमताओं की मजबूती का समर्थन करता है। एपिजेनेटिक और फ्लो साइटोमेट्री-आधारित फेनोटाइपिंग के बीच सबसे बड़ा अंतर तब देखा जाता है जब सेल उत्तेजना की आवश्यकता होती है(चित्रा 3)। फ्लो साइटोमेट्री के माध्यम से Th17 कोशिकाओं का पता लगाने टी सेल उत्तेजना और इंट्रासेलर साइटोकिन धुंधला29,30,31के लिए एक आम प्रोटोकॉल का उपयोग कर पूरा किया गया था । एपिजेनेटिक माप और प्रवाह साइटोमेट्री के बीच Th17 फेनोटाइपिंग में देखे गए मतभेद आईएल-17 उत्पादन के काइनेटिक्स के कारण हो सकते हैं। जबकि मिथाइलेशन हस्ताक्षर स्थिर हैं, प्रोटीन उत्पादन में समय लगता है और फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी20,32द्वारा पता लगाने के लिए पर्याप्त मात्रा में मौजूद होना चाहिए। प्रोटीन परिवहन अवरोधक और सेल उत्तेजना कॉकटेल के साथ 6 एच ऊष्मायन को एपीजेनेटिक आधारित फेनोटाइपिंग विधियों के माध्यम से पता लगाए गए Th17 कोशिकाओं के स्तर को देखने के लिए विस्तारित करने की आवश्यकता हो सकती है । सटीक कारण यह निर्धारित करने के लिए अधिक अध्ययनों की आवश्यकता होती है कि मूल्य सबसे सटीक फेनोटाइपिंग विधि का मिलान और निर्धारण क्यों नहीं करते हैं।

इस रिपोर्ट में, हम विस्तार से कैसे पहचान और एक सरल और मजबूत तरीके से कोशिकाओं के एक विषम मिश्रण में प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार की मात्रा निर्धारित करने के लिए । परखों को इन-प्रोसेस और सेल-आधारित चिकित्सा विज्ञान के रिलीज परीक्षण के लिए संभावित उपयोग के लिए डिज़ाइन और अनुकूलित किया गया है। वर्णित परखसेल थेरेपी अनुप्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले उच्च योग्य कच्चे माल की आवश्यकता को पूरा करते हैं। प्रवाह साइटोमेट्री और स्थिरता, नमूना आवश्यकताओं, पूर्व उत्तेजना, इंट्रासेलुलर धुंधला के लिए सेलुलर पार्मेबिलाइजेशन, और डेटा विश्लेषण की व्यक्तिपरकता जैसे अन्य आणविक तरीकों की कमियों को दूर करके, वर्णित परखें लाइन में हैं सेल आधारित चिकित्सा के व्यावसायीकरण के लक्ष्यों के साथ।

Disclosures

सुमन के प्रधान, जैरी गुज्मैन, कार्ल डार्गिट्ज, मार्क लैंडन और उमा लक्ष्मीपति थर्मो फिशर साइंटिफिक द्वारा नियोजित हैं । स्वेन ओलेक, बीजोर्न समन्स और उल्रिच हॉफम्यूलर क्रमशः कंपनी एपिओन्टिस के संस्थापक और कर्मचारी हैं। इस पांडुलिपि के उत्पादन में किसी लेखन सहायता का उपयोग नहीं किया गया था।

Acknowledgments

इस परियोजना को थर्मो फिशर साइंटिफिक इंट्राम्यूरल ग्रांट द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.0 ml Eppendorf Safe-Lock Tubes Eppendorf 22363344
Analysis template for CD8 assay Click Here
Analysis template for Th17 assay Click Here
Analysis template for Treg assay Click Here
Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer, blue/red/violet6/yellow Thermo Fisher Scientific A29004
CTS PureQuant CD8+ T-Cell Assay Thermo Fisher Scientific A43674
CTS PureQuant Th17 Assay Thermo Fisher Scientific A43676
CTS PureQuant Treg Assay Thermo Fisher Scientific A43675
Dynabeads SILANE Genomic DNA Kit Thermo Fisher Scientific 37012D Used for genomic DNA isolation and purification after bisulfite conversion. Contains elution buffer to dilute samples.
DynaMag-2 Magnet Thermo Fisher Scientific 12321D Used as a magnetic rack during DNA isolation and purification
eBioscience Essential Human T cell Phenotyping Kit Thermo Fisher Scientific A42923
eBioscience Essential Human Th1/Th17 Phenotyping Kit Thermo Fisher Scientific A42927
eBioscience Essential Human Treg Phenotyping Kit Thermo Fisher Scientific A42925
Eppendorf SmartBlock 2 mL Eppendorf 5362000035
Eppendorf ThermoMixer C Eppendorf 5382000023
HulaMixer Sample Mixer Thermo Fisher Scientific 15920D Recommended sample mixer
NanoDrop Thermo Fisher Scientific ND 1000
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL Applied Biosystems AM12450
QuantStudio 12S Flex Applied Biosystems 4470661
TE, pH 8.0, RNase-free Thermo Fisher Scientific AM9849
Vortex Mixer Thermo Fisher Scientific H2KT17113

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References

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