Her beskriver vi en robust metode for å bestemme immuncelleidentitet og renhet gjennom epigenetiske signaturer oppdaget ved hjelp av kvantitativ PCR (qPCR). DNA-demethylation på et bestemt locus fungerer som en unik identifikator for en bestemt celletype og tillater identifisering av CD8 +, regulatoriske eller Th17 T-celler.
Populasjonsfrekvenser for immuncellesubtype kan ha stor effekt på effekten av T-cellebehandling. Nåværende metoder, som flytcytometri, har spesifikke prøvekrav, høy prøveinngang, er lav gjennomstrømning, og er vanskelige å standardisere, som alle er skadelige for karakterisering av celleterapiprodukter under utvikling og Produksjon.
Analysene som er beskrevet her nøyaktig identifisere og kvantifisere immuncelletyper i en heterogen blanding av celler ved hjelp av isolert genomisk DNA (gDNA). DNA metylering mønstre avsløres gjennom bisulfite konvertering, en prosess der unmethylated cytosines konverteres til uracils. Ikke-metylert DNA-regioner oppdages gjennom qPCR-forsterkning ved hjelp av primere rettet mot konverterte områder. En unik locus per analyse måles og fungerer som en nøyaktig identifikator for en bestemt celletype. Assene er robuste og identifiserer CD8+, regulatoriske og Th17 T-celler på en høy gjennomstrømning. Disse optimaliserte analyser kan potensielt brukes til prosess- og produktfrigjøringstesting for celleterapiprosess.
Bruken av T-celler i cellulær immunterapi har økt betydelig det siste tiåret, spesielt med bruk av kimerisk antigenreseptor (CAR) T celleteknologi1. Mens T cellebaserte terapier har blitt møtt med stor klinisk suksess, er de heterogene og celleegenskaper og identiteter kan variere betydelig mellom donorer2. Heterogeniteten til T-cellepopulasjoner kan ha store konsekvenser for terapeutisk effekt og komplisere konklusjoner fra kliniske studier. Av denne grunn er det avgjørende å forstå T-celleheterogenitet under produktproduksjon og formulering for å bestemme de optimale formuleringene av T-celleimmunterapier.
I bred forstand kan T-celler deles inn i to grupper: CD4+ hjelper T-celler, som skiller ut immunmodulerende cytokiner, og CD8 + cytotoksiske T-celler, som direkte lyser celler som presenterer cognate antigenet på store histokompatibilitetskompleks (MHC) I molekyler. CD4+ hjelper T-celler kan skille seg inn i et mylder av bestemte undergrupper som produserer et unikt sett med cytokiner. Noen antyder at et definert forhold mellom CD4 + til CD8 + T-celler i sluttcelleproduktet maksimerer in vivo effekt og utholdenhet, men kan komplisere celleproduksjon3. Regulatoriske T-celler (Tregs), et delsett av CD4+ T-celler, er immunsuppressive og reduserer aktiveringen av immunceller. Regulatoriske T-celler har vært innblandet i mediering av tumortoleranse, og hvis de finnes under BIL T-celleproduksjon, kan hemme antitumorimmunresponsen til CAR T-celler4,5,6. Andre CD4+ undergrupper som T hjelper 17 (Th17) T-celler fremme tumorclearance og kan utnyttes for å øke effekten av T celle terapier. Dermed er økende Th17 CD4+ T-celler av spesiell interesse for solide tumorinnstillinger der økt produksjon av interleukin 17 (IL-17) fremmer antitumor immunrespons5,7,8,9. Forstå betydningen av Th17 celler i tumor respons har bedt mer undersøkelse i strategier for å generere disse cellene in vitro7,9. Derfor er metoder for å oppdage disse T-celleundersettene avgjørende for å optimalisere T-celleterapi og bør være robuste, enkle, skalerbare og reproduserbare.
Flow cytometri er den vanligste metoden for å bestemme identiteten til en immuncelle. Flytcytometri krever imidlertid levende, intakte celler som må analyseres samme dag som de høstes. For intracellulær cytokinfarging (ICS) er proteinsekresjonshemming nødvendig for å beholde cytokiner i T-cellene. Imidlertid har forskjellige inhibitorforbindelser differensialeffekter på sekresjonen av spesifikke cytokiner, og tvinger brukerne til å lage spesialiserte cocktailer for påvisning av cytokin av interesse10,11. I tillegg er troskapen til flow cytometri avhengig av antistoffkloner som binder seg spesielt og potent til målet. Bruk av forskjellige antistoffkloner kan forårsake varierende resultater og føre til upresise konklusjoner, noe som gjør metoden vanskelig å standardisere12. Videre kan analyse av data samlet inn via flytcytometri, og dermed konklusjoner hentet fra dataene, variere sterkt mellom brukere basert på hvordan portene er satt13,14. Av disse grunnene er flow cytometri ikke ideell for presis kvalitetskontroll under celleterapiutvikling.
Vurderingen av genomisk metylering ved spesifikke genloci er en alternativ metode for å bestemme celleidentitet. Begrunnelsen for bruk av DNA-metylering for å identifisere bestemte celletyper er beskrevet i flere artikler og er avhengig av spesifikke metyleringsmønstre til stede i en gitt cellepopulasjon15,16,17. I målceller inneholder visse nettsteder umetylerte nukleotider, mens i ikke-målceller er disse nettstedene metylert. Dette mønsteret kan oppdages gjennom bisulfitekonvertering, en prosess som utelukkende konverterer umetylerte cytosinkjerner (C) til uracil (U). Primere og sonder kan utformes mot de konverterte nettstedene, deretter forsterket og oppdages gjennom qPCR16.
Analysen som er beskrevet hermåler, måler hyppigheten av undertyper av immuncelle i heterogene populasjoner ved å kvantifisere antall spesifikke umetylerte loci sammenlignet med et rengjøringsgen. Kopier av de umetylerte regulatoriske elementene for CD8 B-genet måles i CD8-analysen, FoxP3 i Treg og IL-17 i Th17 i denne analysen. Disse loci ble identifisert ved å isolere den spesifikke cellepopulasjonen av interesse (f.eks CD8 + T-celler) og utføre bisulfittsekvensering for å identifisere loci som er unmethylated i bare den celletypen15. Primers og sonder er utviklet mot unikt unmethylated loci og prøver analyseres via qPCR. En standard kurve med kjente kopinumre opprettes fra fortynninger av et høyt kopinummer standard plasmid, noe som gjør det mulig å omvende en Ct-verdi til et transkripsjonskopinummer.
For å evaluere analysenytelse er det nødvendig med kontrollprøver, inkludert en referanse gDNA og en kalibratorplasmid. Referansegenomisk materiale er en samlet blodprøve fra flere donorer med kjente immuncellefrekvenser og brukes til kvalitetskontroll (QC) analyseytelseskontroll. Kalibratorprøven er en syntetisert plasmid som inneholder CD8-, FoxP3- og GAPDH-gensekvensene i et ekmolært forhold. Den brukes som et mål på bisulfittkonverteringseffektiviteten, fordi bisulfittkonverteringer innenfor ulike genomiske regioner vil variere i effektivitet. Forholdet mellom målet og GAPDH i kalibratoren er 1, men på grunn av forskjeller i bisulfittkonverteringseffektiviteten kan forholdet variere. Denne kalibreringsfaktoren brukes på CD8- og Treg-analysene. FoxP3, genet som brukes i Treg-analysen, ligger på X-kromosomet. Fordi denne analysen måler bare umetylerte kopier av FoxP3, og bare en kopi av FoxP3 er unmethylated i Tregs, er denne analysen sex agnostisk og kan brukes med både mannlige og kvinnelige prøver18. Th17-analysen bruker ikke en kalibratorprøve eller GAPDH som rengjøringsgen. I stedet er en annen primer satt rettet mot metylert loci tilstede i ikke-Th17 celler inkludert og det totale antall celler gjenspeiles av summen av metylerte og unmethylated kopier av IL-17. Dataene som er hentet fra qPCR, angis i en forhåndsinnstilt analysemal som utfører kvalitetskontrollkontroller på dataene og beregner prosentandelen av målcellen i den første populasjonen. Dette gir automatisert og objektiv dataanalyse, og fjerner dermed brukersubjektivitet og forbedrer standardiseringsfunksjonene.
Denne analysen bruker gDNA, som kan isoleres av en leukaperseprosedyre ved hjelp av kultiverte eller faste celler, eller frosne cellepellets. Det lave prøvekravet, fleksibiliteten i prøvestartmateriale, høy nøyaktighet og standardisert analyse tar for seg begrensningene forbundet med flytcytometri og er ideelle for kvalitetskontrollformål under celleterapiprosessutvikling.
Med bruk av nye immunterapeutiske midler er det behov for standardiserte metoder for å oppdage immuncelleidentitet og renhet. Vurderingsmetoder for prosess- og utgivelsestesting som er robuste, validerte og skalerbare, gjenstår å etablere og utgjøre en stor utfordring for kommersialiseringen av cellebaserte terapier. Mens flyt cytometri er for tiden den vanligste metoden for immuncelle fenotyping, høy prøvekvalitet og kvantitetskrav gjør det vanskelig for regelmessig bruk. Videre er implementering av flytcytometri i et godt produksjonspraksismiljø (GMP) begrenset av operatøravhengige gatingstrategier og kravet om referansestandarder for hver markør som brukes13,14. Selv om automatisert gating har vist seg å forbedre analyserobustheten, er det ennå ikke en veletablert kvalitetskontrollstrategi. Mens genuttrykkprofilering også kan brukes til å karakterisere celleterapi produktidentitet og renhet, dataene er semikvantitative og arbeidskrevende. I tillegg er RNA og microRNA relativt mindre stabile enn DNA og kan bidra til mangel på robuste og reproduserbare resultater. Dermed gir bruk av den epigenetiske DNA-metyleringsstatusen til en bestemt locus en stabil, lett å utføre, robust og skalerbar metode for å identifisere og kvantifisere en celletype av interesse.
Påvisning av metyleringsmønstre til fenotypeceller er avhengig av tre kritiske trinn: For det første krever analysen bruk av gDNA, som er isolert i henhold til de beskrevne metodene. Dna av høy kvalitet er nødvendig, og hvis den ikke brukes, kan bisulfittkonvertering bli påvirket23,24. Hvis DNA av lav kvalitet oppnås, anbefales ytterligere rensing for å sikre analysens pålitelighet. For det andre er vellykket bisulfittkonvertering av den umetylerte cytosin til uracil nødvendig. Det mest kritiske trinnet i bisulfittkonvertering er DNA-denaturering23,25. Høy temperatur denaturering ved hjelp av ammonium bisulfitt, i motsetning til natriumbisulfitt, øker konverteringseffektiviteten og konsistensen og er den anbefalte prosessen for disse analysene25,26. Brukere må sørge for at reaksjonen skjer ved 80 °C og at prøveblanding gjøres ofte. Av disse grunnene anbefales en digital termomikser (se Tabell over materialer). Tredje, riktig pipettering teknikk må følges under qPCR forberedelse. Tre tekniske replikaer er nødvendig under qPCR-reaksjonen for å følge minimumsinformasjonen for publisering av kvantitative PCR-eksperimenter (MIQE) retningslinjer(27). Inkludering av mer tekniske replikaser er akseptabelt, men ikke nødvendig. Feil pipetteringsteknikk og/eller ikke inkludert tekniske replikater vil føre til upålitelige qPCR-resultater.
Hvis de kritiske trinnene følges og ønskede resultater fortsatt ikke oppnås, kan flere kontroller i analysen utnyttes til å finne problemet. Riktig bisulfite konvertering er det mest avgjørende trinnet i denne analysen. Feil bisulfitekonvertering vil bli fremhevet av en mislykket kalibreringsfaktor og/eller referanseverdier beregnet av analysemalen. Hvis bisulfitekonverteringen ble utført feil (f.eks. hvis reaksjonen ble utført ved RT), ville det ikke være noen forsterkning under qPCR. Det ville heller ikke bli sett noen forsterkning hvis det ble gjort en feil under qPCR-reaksjonspreparatet (f.eks. hvis qPCR-mesterblandingen ikke ble lagt til). Disse to problemene kan skilles ved å undersøke standardprøvene. Forsterkning i standardprøvene, men ikke referansen, kalibratoren og eksperimentelle prøver, ville indikere at bisulfittkonverteringen ikke ble utført riktig. Ingen forsterkning i noen av prøvene vil indikere at qPCR ikke ble utført riktig.
Selv om denne analysen adresserer det strenge prøvekravet og analysevariasjonen forbundet med andre fenotypingsmetoder, spesielt flytcytometri, er det begrensninger som må noteres. Denne analysen retter seg mot ett enkelt locus som brukes som en unik identifikator for målcellen, som forbyr multipleksert analyse som vanligvis utføres med flytcytometri. Dette gjør det vanskelig å identifisere komplekse celletyper som Th17. Imidlertid har bruk av metyleringsmønstre på en enkelt locus vist seg å være en nøyaktig fenotypisk markør for flere celler og har blitt brukt i flere kliniske studier15,16. Dette gjelder spesielt i Tregs hvor vurdering av FOXP3 metyleringsignaturer er en nøyaktig og entydig metode for å oppdage sanne Tregs fra forbigående FOXP3 som uttrykker celler28. Tapet av multipleksert analyse kompenseres av nøyaktigheten av loci avhørt. Fremtidige iterasjoner av analysen kan omfatte flere qPCR fargestoffer og slukkere for å tillate påvisning av flere loci i en qPCR reaksjon.
Denne analysen kan brukes som en alternativ metode for flytcytometri i å bestemme celle fenotype og identitet. Det bør bemerkes at denne analysen ikke gir de eksakte verdiene som flyter cytometri gjør (Tall 1-3). Dette skyldes delvis variasjonen i dataanalyse forbundet med flytcytometri. Avhengig av gating strategi, resultatene fra flyt cytometri kan variere betydelig. Dette er spesielt tilfelle når du bruker komplekse farging protokoller for å se på intracellulære mål, for eksempel IL-17, hvor koeffisienten av variasjon (CV) kan være så høyt som 15%14. Mellom flere brukere hadde analysen som presenteres konsekvent en CV på <15%, som støttet robustheten til analysen og forbedrede standardiseringsfunksjoner. De største forskjellene mellom epigenetisk og flow cytometribasert fenotyping ses når cellestimulering er nødvendig (figur 3). Påvisning av Th17 celler via flyt cytometri ble oppnådd ved hjelp av en felles protokoll for T cellestimulering og intracellulær cytokin flekker29,30,31. Forskjellene sett i Th17 fenotyping mellom epigenetisk måling og flyt cytometri kan skyldes kinetikken til IL-17 produksjon. Mens metyleringsignaturer er stabile, tar proteinproduksjonen tid og må være tilstede i tilstrekkelige mengder som skal oppdages av fluorescerende antistoffer20,32. 6 h inkubasjon med proteintransporthemmer og cellestimuleringscocktail må kanskje utvides for å se nivået av Th17-celler oppdaget via epigenetiskbaserte fenotypingsmetoder. Flere studier er nødvendig for å bestemme den nøyaktige grunnen til at verdiene ikke samsvarer og bestemme den mest nøyaktige fenotyping metoden.
I denne rapporten beskriver vi hvordan vi identifiserer og kvantifiserer immuncelletyper i en heterogen blanding av celler på en enkel og robust måte. Assays er designet og optimalisert for potensiell bruk for in-process og release testing av cellebaserte terapeutiske midler. De beskrevne analysene oppfyller kravet om høyt kvalifiserte råvarer som skal brukes i celleterapiapplikasjoner. Ved å ta opp manglene ved flytcytometri og andre molekylære metoder som stabilitet, prøvekrav, tidligere stimulering, cellulær permeabilisering for intracellulær farging og subjektivitet av dataanalyse, er de beskrevne analysene i tråd med mål om kommersialisering av cellebaserte terapier.
The authors have nothing to disclose.
Prosjektet ble finansiert av Thermo Fisher Scientific Intramural stipend.
2.0 ml Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 22363344 | |
Analysis template for CD8 assay | Click Here | ||
Analysis template for Th17 assay | Click Here | ||
Analysis template for Treg assay | Click Here | ||
Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer, blue/red/violet6/yellow | Thermo Fisher Scientific | A29004 | |
CTS PureQuant CD8+ T-Cell Assay | Thermo Fisher Scientific | A43674 | |
CTS PureQuant Th17 Assay | Thermo Fisher Scientific | A43676 | |
CTS PureQuant Treg Assay | Thermo Fisher Scientific | A43675 | |
Dynabeads SILANE Genomic DNA Kit | Thermo Fisher Scientific | 37012D | Used for genomic DNA isolation and purification after bisulfite conversion. Contains elution buffer to dilute samples. |
DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Used as a magnetic rack during DNA isolation and purification |
eBioscience Essential Human T cell Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42923 | |
eBioscience Essential Human Th1/Th17 Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42927 | |
eBioscience Essential Human Treg Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42925 | |
Eppendorf SmartBlock 2 mL | Eppendorf | 5362000035 | |
Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | Recommended sample mixer |
NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND 1000 | |
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Applied Biosystems | AM12450 | |
QuantStudio 12S Flex | Applied Biosystems | 4470661 | |
TE, pH 8.0, RNase-free | Thermo Fisher Scientific | AM9849 | |
Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | H2KT17113 |