Här beskriver vi en robust metod för att bestämma immuncellsidentitet och renhet genom epigenetiska signaturer som upptäcks med kvantitativ PCR (qPCR). DNA-demethylation vid en viss locus fungerar som en unik identifierare för en viss celltyp och möjliggör identifiering av CD8+, reglerande eller Th17 T-celler.
Immuncell subtyp populationer kan ha en stor effekt på effekten av T cellterapier. Nuvarande metoder, som flödecytometri, har specifika provkrav, hög provingång, är låg genomströmning, och är svåra att standardisera, som alla är skadliga för karakterisering av cellterapi produkter under sin utveckling och Tillverkning.
De analyser som beskrivs häri korrekt identifiera och kvantifiera immuncelltyper i en heterogen blandning av celler med hjälp av isolerade genomiska DNA (gDNA). DNA-metyleringsmönster avslöjas genom bisulfitomvandling, en process där unmetylerade cytosiner omvandlas till uraciler. Unmethylated DNA-regioner upptäcks genom qPCR förstärkning med grundfärger inriktning konverterade områden. En unik locus per analys mäts och fungerar som en korrekt identifierare för en viss celltyp. Analyserna är robusta och identifierar CD8+, reglerande och Th17 T-celler på ett högt genomströmningssätt. Dessa optimerade analyser kan potentiellt användas för process- och produktfrisättningstestning för cellterapiprocess.
Användningen av T-celler i cellulär immunterapi har ökat betydligt under det senaste decenniet, särskilt med tillkomsten av chimeric antigenreceptor (CAR) T cellteknik1. Medan T cell-baserade terapier har mötts med stor klinisk framgång, de är heterogena och cell egenskaper och identiteter kan variera avsevärt mellan givare2. Heterogeniteten hos T-cellspopulationer kan ha stora effekter på terapeutisk effekt och komplicera slutsatserna från kliniska prövningar. Av denna anledning är det viktigt att förstå T-cellheterogenitet under produkttillverkning och formulering för att bestämma de optimala formuleringarna av T-cells immunterapier.
I vid bemärkelse kan T-celler delas in i två grupper: CD4+ helper T-celler, som utsöndrar immunmodulerande cytokiner och CD8+ cytototoxiska T-celler, som direkt lysceller presenterar cognate antigen på stora histokompatibilitet komplex (MHC) I molekyler. CD4 + helper T-celler kan skilja sig åt en myriad av specifika undergrupper som producerar en unik uppsättning cytokiner. Vissa föreslår att ett definierat förhållande mellan CD4 + till CD8 + T-celler i slutcellprodukten maximera in vivo effekt och uthållighet, men kan komplicera celltillverkning3. Reglerande T-celler (Tregs), en delmängd av CD4 + T-celler, är immunsuppressiva och minska aktiveringen av immunceller. Reglerande T-celler har varit inblandade i medla tumörtolerans och, om det finns under CAR T cell tillverkning, kan hämma antitumor immunsvar av CAR T-celler4,5,6. Andra CD4 + delmängder såsom T helper 17 (Th17) T-celler främja tumör clearance och kan utnyttjas för att öka effekten av T-cellsterapier. Således ökar Th17 CD4 + T celler är av särskilt intresse i solid akulerade tumör inställningar där ökad produktion av interleukin 17 (IL-17) främjar antitumor immunsvar5,7,8,9. Förstå vikten av Th17 celler i tumör svar har föranlett mer utredning av strategier för att generera dessa celler in vitro7,9. Därför är metoder för att upptäcka dessa T-cellunderuppsättningar avgörande för att optimera T-cellterapier och bör vara robusta, enkla, skalbara och reproducerbara.
Flödecytometri är den vanligaste metoden för att bestämma identiteten på en immuncell. Flödescytometri kräver dock levande, intakta celler som måste analyseras samma dag som de skördas. För intracellulära cytokinfärgning (ICS) krävs proteinutsöndringenför att behålla cytokiner i T-cellerna. Emellertid, olika hämmare föreningar har differentiella effekter på utsöndringen av specifika cytokiner, tvingar användare att skapa specialiserade cocktails för detektion av cytokin av intresse10,11. Dessutom är trohet flödet cytometri beroende av antikroppar kloner som binder specifikt och potent till sitt mål. Användningen av olika antikroppskloner kan orsaka varierande resultat och leda till oprecisa slutsatser, vilket gör metoden svår att standardisera12. Vidare kan analys av data som samlas in via flödecytometri, och därmed slutsatser från uppgifterna, variera kraftigt mellan användare baserat på hur grindar na ärinställda 13,14. Av dessa skäl är flödet cytometri inte idealisk för exakt kvalitetskontroll under cellterapi utveckling.
Bedömningen av genomisk metylering vid specifika genloki är en alternativ metod för att bestämma cellidentitet. Motiven för användning av DNA-metylering för att identifiera specifika celltyper har beskrivits i flera artiklar och bygger på specifika metyleringsmönster som finns i en viss cellpopulation15,16,17. I målceller innehåller vissa platser unmetylerade nukleotider, medan dessa platser i icke-målceller metyleras. Detta mönster kan detekteras genom bisulfitkonvertering, en process som uteslutande omvandlar unmethylated cytosin nukleotider (C) till uracil (U). Primers och sonder kan utformas mot de konverterade platserna, sedan förstärkas och upptäckas genom qPCR16.
Analysen som beskrivs häri mäter frekvensen av immuncellsubtyper inom heterogena populationer genom att kvantifiera antalet specifika unmethylated loci jämfört med en hushållning gen. Kopior av de unmethylated reglerande beståndsdelarna för CD8 B genen mäts i CD8-analysen, FoxP3 i Treg, och IL-17 i Th17 i denna analys. Dessa loki identifierades genom att isolera den specifika cellpopulationen av intresse (t.ex. CD8+ T-celler) och utför bisulfitsekvensering för att identifiera loki som är unmethylated i endast den celltyp15. Primers och sonder utvecklas mot unikt unmethylated loci och prover analyseras via qPCR. En standardkurva med kända kopieringsnummer skapas från utspädningar av en hög kopieringsnummerstandardplasmid, vilket möjliggör konvertering av ett Ct-värde till ett avskriftsnummer.
För att utvärdera analysens prestanda krävs kontrollprover, inklusive en referensgDNA och en kalibratorplasmid. Referensgenomikmaterialet är ett poolat blodprov från flera givare med kända immuncellfrekvenser och används för en kvalitetskontroll (QC) analys prestandakontroll. Kalibratorprovet är en syntetiserad plasmid som innehåller CD8-, FoxP3- och GAPDH-gensekvenserna i ett equimolar-förhållande. Det används som ett mått på bisulfitomvandlingseffektiviteten, eftersom bisulfitomvandlingar inom olika genomiska regioner kommer att variera i effektivitet. Förhållandet mellan målet och GAPDH inom kalibratorn är 1, men på grund av skillnader i bisulfitomvandlingseffektiviteten kan förhållandet variera. Denna kalibreringsfaktor tillämpas på CD8- och Treg-analyserna. FoxP3, genen som används i Treg analysen, ligger på X-kromosomen. Eftersom denna analys åtgärder endast unmetylerade kopior av FoxP3, och endast en kopia av FoxP3 är unmethylated i Tregs, denna analys är kön agnostiker och kan användas med både manliga och kvinnliga prover18. Th17-analysen använder inte ett kalibratorprov eller GAPDH som hushållningsgen. I stället inkluderas en annan primer-uppsättning som riktar sig mot metylerade lokier som finns i icke-Th17-celler och det totala antalet celler återspeglas av summan av de metylerade och unmetylerade kopiorna av IL-17. De data som erhållits från qPCR ingår i en förinställd analysmall som utför kvalitetskontrollkontroller på data och beräknar procentandelen av målcellen i startpopulationen. Detta ger automatiserad och opartisk dataanalys, vilket tar bort användarens subjektivitet och förbättrar standardiseringsfunktionerna.
Denna analys använder gDNA, som kan isoleras av en leukaferes förfarande med odlade eller fasta celler, eller frysta cellpellets. Det låga provkravet, flexibilitet i provutgångsmaterial, hög noggrannhet och standardiserad analys tar itu med de begränsningar som är förknippade med flödescytometri och är idealiska för kvalitetskontroll under utveckling av cellterapiprocessen.
Med tillkomsten av nya immunotherapeutics, det finns ett behov av standardiserade metoder för att upptäcka immuncell identitet och renhet. Bedömningsmetoder för process- och utgivningstestning som är robusta, validerade och skalbara återstår att fastställa och utgör en stor utmaning för kommersialiseringen av cellbaserade terapier. Medan flödet cytometri är för närvarande den vanligaste metoden för immuncell fenotypning, hög provkvalitet och krav kvantitet gör det svårt för regelbunden användning. Genomförandet av flödescytometri i en god tillverkningssed särbehandling (GMP) är begränsad av operatörsberoende strategier för att gating strategier och kravet på referensstandarder för varje markör som används13,14. Även automatiserad gating har visat sig förbättra analysen robusthet, är det ännu inte en väletablerad kvalitetskontroll strategi. Medan genuttryckprofilering kan också användas för att karakterisera cellterapi produktidentitet och renhet, data är semikvantitativa och arbetsintensiva. Dessutom är RNA och mikroRNA relativt mindre stabila än DNA och kan bidra till bristen på robusta och reproducerbara resultat. Således, med hjälp av epigenetiska DNA metylering status av en specifik locus ger en stabil, lätt att utföra, robust och skalbar metod för att identifiera och kvantifiera en cell typ av intresse.
Detektion av metyleringsmönster till fenotypceller bygger på tre kritiska steg: För det första kräver analysen användning av gDNA, som isoleras enligt de beskrivna metoderna. Dna av hög kvalitet krävs och om den inte används kan bisulfitkonvertering påverkas23,24. Om DNA av låg kvalitet erhålls rekommenderas ytterligare rening för att säkerställa analysens tillförlitlighet. För det andra krävs framgångsrik bisulfitomvandling av den ometylerade cytosintill uracil. Det mest kritiska steget i bisulfitkonvertering är DNA-denaturering23,25. Hög temperatur denaturering med ammoniumbisulfit, i motsats till natriumbisulfit, ökar omvandlingen effektivitet och konsistens och är den rekommenderade processen för dessa analyser25,26. Användarna måste se till att reaktionen inträffar vid 80 °C och att provblandning sker ofta. Av dessa skäl rekommenderas en digital termomixer (se Materialtabell). För det tredje måste korrekt rörteknik följas under qPCR-preparatet. Tre tekniska replikat krävs under qPCR reaktion för att följa den minsta informationen för publicering av kvantitativa realtid PCR experiment (MIQE) riktlinjer27. Införandet av mer tekniska replikat är acceptabelt men inte nödvändigt. Felaktig rörteknik och/eller inte inklusive tekniska replikat kommer att leda till otillförlitliga qPCR-resultat.
Om de kritiska stegen följs och önskade resultat fortfarande inte erhålls kan flera kontroller inom analysen användas för att identifiera problemet. Korrekt bisulfit konvertering är det viktigaste steget i denna analys. Felaktig bisulfitkonvertering skulle markeras med en misslyckad kalibreringsfaktor och/eller referensvärden som beräknas av analysmallen. Om bisulfitkonverteringen utfördes felaktigt (t.ex. om reaktionen utfördes på RT) skulle det inte bli någon förstärkning under qPCR. Dessutom skulle ingen förstärkning ses om ett fel gjordes under qPCR reaktionsberedningen (t.ex. om qPCR-huvudmixen inte lades till). Dessa två frågor kan separeras genom att undersöka standardproverna. Förstärkning i standardproverna, men inte referens, kalibrator och försöksprover, skulle tyda på att bisulfitkonverteringen inte utfördes korrekt. Ingen förstärkning i något av proverna skulle tyda på att qPCR inte utfördes korrekt.
Även om denna analys tar upp det stränga provkravet och analysvariabilitet en koppling till andra fenotypningsmetoder, flödar cytometri specifikt, finns det begränsningar som måste noteras. Den här analysen riktar sig till en enda locus som används som en unik identifierare för målcellen, som förbjuder den multiplexade analys som ofta utförs med flödescytometri. Detta gör det svårt att identifiera komplexa celltyper som Th17. Användningen av metyleringsmönster vid en enda locus har dock visat sig vara en korrekt fenotypisk markör för flera celler och har använts i flera kliniska prövningar15,16. Detta gäller särskilt i Tregs där bedöma FOXP3 metylering signaturer är en korrekt och entydig metod för att upptäcka sanna Tregs från transiently FOXP3 uttrycker celler28. Förlusten av multiplexiserad analys kompenseras av noggrannheten i loci förhördes. Framtida iterationer av analysen kan omfatta flera qPCR färgämnen och squenchers för att möjliggöra detektion av flera loci i en qPCR reaktion.
Denna analys kan användas som en alternativ metod för flöde cytometri för att bestämma cell fenotyp och identitet. Det bör noteras att denna analys inte ger de exakta värden som flöde cytometri gör (figur 1-3). Detta beror delvis på variationerna i dataanalys i samband med flödecytometri. Beroende på gating strategi, resultat från flödet cytometri kan variera avsevärt. Detta är särskilt fallet när du använder komplexa färgning protokoll för att titta på intracellulära mål, såsom IL-17, där variationskoefficienten (CV) kan vara så hög som 15%14. Mellan flera användare hade analysen som presenterades konsekvent ett CV på <15%, vilket stödde analysens robusthet och förbättrade standardiseringsfunktioner. De största skillnaderna mellan epigenetiska och flöde cytometri-baserade fenotypning ses när cell stimulering krävs(figur 3). Upptäckten av Th17 celler via flöde cytometri utfördes med hjälp av ett gemensamt protokoll för T cell stimulering och intracellulära cytokin färgning29,30,31. Skillnaderna i Th17 fenotypning mellan epigenetisk mätning och flöde cytometri kan bero på kinetik av IL-17 produktion. Medan metylering signaturer är stadig, proteinproduktion tar tid och måste finnas i tillräckliga mängder som skall detekteras av fluorescerande antikroppar20,32. Den 6 h inkubation med protein transporthämmare och cell stimulering cocktail kan behöva förlängas för att se nivån av Th17 celler upptäcks via epigenetiska-baserade fenotypning metoder. Fler studier behövs för att fastställa den exakta orsaken till att värdena inte matchar och bestämmer den mest exakta fenotypningsmetoden.
I detta betänkande beskriver vi hur man identifierar och kvantifierar immuncelltyper i en heterogen blandning av celler på ett enkelt och robust sätt. Analyserna är utformade och optimerade för potentiell användning för process- och frisättningstestning av cellbaserade terapier. De beskrivna assays uppfyller kravet på högkvalificerade råvaror som ska användas i cellterapi applikationer. Genom att ta itu med bristerna i flödet cytometri och andra molekylära metoder såsom stabilitet, provkrav, tidigare stimulering, cellulära permeabilisering för intracellulär färgning och subjektivitet av dataanalys, de beskrivna analyserna är i linje med målen kommersialisering av cellbaserade terapier.
The authors have nothing to disclose.
Projektet finansierades av Thermo Fisher Scientific Intramural grant.
2.0 ml Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 22363344 | |
Analysis template for CD8 assay | Click Here | ||
Analysis template for Th17 assay | Click Here | ||
Analysis template for Treg assay | Click Here | ||
Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer, blue/red/violet6/yellow | Thermo Fisher Scientific | A29004 | |
CTS PureQuant CD8+ T-Cell Assay | Thermo Fisher Scientific | A43674 | |
CTS PureQuant Th17 Assay | Thermo Fisher Scientific | A43676 | |
CTS PureQuant Treg Assay | Thermo Fisher Scientific | A43675 | |
Dynabeads SILANE Genomic DNA Kit | Thermo Fisher Scientific | 37012D | Used for genomic DNA isolation and purification after bisulfite conversion. Contains elution buffer to dilute samples. |
DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Used as a magnetic rack during DNA isolation and purification |
eBioscience Essential Human T cell Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42923 | |
eBioscience Essential Human Th1/Th17 Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42927 | |
eBioscience Essential Human Treg Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42925 | |
Eppendorf SmartBlock 2 mL | Eppendorf | 5362000035 | |
Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | Recommended sample mixer |
NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND 1000 | |
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Applied Biosystems | AM12450 | |
QuantStudio 12S Flex | Applied Biosystems | 4470661 | |
TE, pH 8.0, RNase-free | Thermo Fisher Scientific | AM9849 | |
Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | H2KT17113 |