Summary
Her beskriver vi en robust metode for å bestemme immuncelleidentitet og renhet gjennom epigenetiske signaturer oppdaget ved hjelp av kvantitativ PCR (qPCR). DNA-demethylation på et bestemt locus fungerer som en unik identifikator for en bestemt celletype og tillater identifisering av CD8 +, regulatoriske eller Th17 T-celler.
Abstract
Populasjonsfrekvenser for immuncellesubtype kan ha stor effekt på effekten av T-cellebehandling. Nåværende metoder, som flytcytometri, har spesifikke prøvekrav, høy prøveinngang, er lav gjennomstrømning, og er vanskelige å standardisere, som alle er skadelige for karakterisering av celleterapiprodukter under utvikling og Produksjon.
Analysene som er beskrevet her nøyaktig identifisere og kvantifisere immuncelletyper i en heterogen blanding av celler ved hjelp av isolert genomisk DNA (gDNA). DNA metylering mønstre avsløres gjennom bisulfite konvertering, en prosess der unmethylated cytosines konverteres til uracils. Ikke-metylert DNA-regioner oppdages gjennom qPCR-forsterkning ved hjelp av primere rettet mot konverterte områder. En unik locus per analyse måles og fungerer som en nøyaktig identifikator for en bestemt celletype. Assene er robuste og identifiserer CD8+, regulatoriske og Th17 T-celler på en høy gjennomstrømning. Disse optimaliserte analyser kan potensielt brukes til prosess- og produktfrigjøringstesting for celleterapiprosess.
Introduction
Bruken av T-celler i cellulær immunterapi har økt betydelig det siste tiåret, spesielt med bruk av kimerisk antigenreseptor (CAR) T celleteknologi1. Mens T cellebaserte terapier har blitt møtt med stor klinisk suksess, er de heterogene og celleegenskaper og identiteter kan variere betydelig mellom donorer2. Heterogeniteten til T-cellepopulasjoner kan ha store konsekvenser for terapeutisk effekt og komplisere konklusjoner fra kliniske studier. Av denne grunn er det avgjørende å forstå T-celleheterogenitet under produktproduksjon og formulering for å bestemme de optimale formuleringene av T-celleimmunterapier.
I bred forstand kan T-celler deles inn i to grupper: CD4+ hjelper T-celler, som skiller ut immunmodulerende cytokiner, og CD8 + cytotoksiske T-celler, som direkte lyser celler som presenterer cognate antigenet på store histokompatibilitetskompleks (MHC) I molekyler. CD4+ hjelper T-celler kan skille seg inn i et mylder av bestemte undergrupper som produserer et unikt sett med cytokiner. Noen antyder at et definert forhold mellom CD4 + til CD8 + T-celler i sluttcelleproduktet maksimerer in vivo effekt og utholdenhet, men kan komplisere celleproduksjon3. Regulatoriske T-celler (Tregs), et delsett av CD4+ T-celler, er immunsuppressive og reduserer aktiveringen av immunceller. Regulatoriske T-celler har vært innblandet i mediering av tumortoleranse, og hvis de finnes under BIL T-celleproduksjon, kan hemme antitumorimmunresponsen til CAR T-celler4,5,6. Andre CD4+ undergrupper som T hjelper 17 (Th17) T-celler fremme tumorclearance og kan utnyttes for å øke effekten av T celle terapier. Dermed er økende Th17 CD4+ T-celler av spesiell interesse for solide tumorinnstillinger der økt produksjon av interleukin 17 (IL-17) fremmer antitumor immunrespons5,7,8,9. Forstå betydningen av Th17 celler i tumor respons har bedt mer undersøkelse i strategier for å generere disse cellene in vitro7,9. Derfor er metoder for å oppdage disse T-celleundersettene avgjørende for å optimalisere T-celleterapi og bør være robuste, enkle, skalerbare og reproduserbare.
Flow cytometri er den vanligste metoden for å bestemme identiteten til en immuncelle. Flytcytometri krever imidlertid levende, intakte celler som må analyseres samme dag som de høstes. For intracellulær cytokinfarging (ICS) er proteinsekresjonshemming nødvendig for å beholde cytokiner i T-cellene. Imidlertid har forskjellige inhibitorforbindelser differensialeffekter på sekresjonen av spesifikke cytokiner, og tvinger brukerne til å lage spesialiserte cocktailer for påvisning av cytokin av interesse10,11. I tillegg er troskapen til flow cytometri avhengig av antistoffkloner som binder seg spesielt og potent til målet. Bruk av forskjellige antistoffkloner kan forårsake varierende resultater og føre til upresise konklusjoner, noe som gjør metoden vanskelig å standardisere12. Videre kan analyse av data samlet inn via flytcytometri, og dermed konklusjoner hentet fra dataene, variere sterkt mellom brukere basert på hvordan portene er satt13,14. Av disse grunnene er flow cytometri ikke ideell for presis kvalitetskontroll under celleterapiutvikling.
Vurderingen av genomisk metylering ved spesifikke genloci er en alternativ metode for å bestemme celleidentitet. Begrunnelsen for bruk av DNA-metylering for å identifisere bestemte celletyper er beskrevet i flere artikler og er avhengig av spesifikke metyleringsmønstre til stede i en gitt cellepopulasjon15,16,17. I målceller inneholder visse nettsteder umetylerte nukleotider, mens i ikke-målceller er disse nettstedene metylert. Dette mønsteret kan oppdages gjennom bisulfitekonvertering, en prosess som utelukkende konverterer umetylerte cytosinkjerner (C) til uracil (U). Primere og sonder kan utformes mot de konverterte nettstedene, deretter forsterket og oppdages gjennom qPCR16.
Analysen som er beskrevet hermåler, måler hyppigheten av undertyper av immuncelle i heterogene populasjoner ved å kvantifisere antall spesifikke umetylerte loci sammenlignet med et rengjøringsgen. Kopier av de umetylerte regulatoriske elementene for CD8 B-genet måles i CD8-analysen, FoxP3 i Treg og IL-17 i Th17 i denne analysen. Disse loci ble identifisert ved å isolere den spesifikke cellepopulasjonen av interesse (f.eks CD8 + T-celler) og utføre bisulfittsekvensering for å identifisere loci som er unmethylated i bare den celletypen15. Primers og sonder er utviklet mot unikt unmethylated loci og prøver analyseres via qPCR. En standard kurve med kjente kopinumre opprettes fra fortynninger av et høyt kopinummer standard plasmid, noe som gjør det mulig å omvende en Ct-verdi til et transkripsjonskopinummer.
For å evaluere analysenytelse er det nødvendig med kontrollprøver, inkludert en referanse gDNA og en kalibratorplasmid. Referansegenomisk materiale er en samlet blodprøve fra flere donorer med kjente immuncellefrekvenser og brukes til kvalitetskontroll (QC) analyseytelseskontroll. Kalibratorprøven er en syntetisert plasmid som inneholder CD8-, FoxP3- og GAPDH-gensekvensene i et ekmolært forhold. Den brukes som et mål på bisulfittkonverteringseffektiviteten, fordi bisulfittkonverteringer innenfor ulike genomiske regioner vil variere i effektivitet. Forholdet mellom målet og GAPDH i kalibratoren er 1, men på grunn av forskjeller i bisulfittkonverteringseffektiviteten kan forholdet variere. Denne kalibreringsfaktoren brukes på CD8- og Treg-analysene. FoxP3, genet som brukes i Treg-analysen, ligger på X-kromosomet. Fordi denne analysen måler bare umetylerte kopier av FoxP3, og bare en kopi av FoxP3 er unmethylated i Tregs, er denne analysen sex agnostisk og kan brukes med både mannlige og kvinnelige prøver18. Th17-analysen bruker ikke en kalibratorprøve eller GAPDH som rengjøringsgen. I stedet er en annen primer satt rettet mot metylert loci tilstede i ikke-Th17 celler inkludert og det totale antall celler gjenspeiles av summen av metylerte og unmethylated kopier av IL-17. Dataene som er hentet fra qPCR, angis i en forhåndsinnstilt analysemal som utfører kvalitetskontrollkontroller på dataene og beregner prosentandelen av målcellen i den første populasjonen. Dette gir automatisert og objektiv dataanalyse, og fjerner dermed brukersubjektivitet og forbedrer standardiseringsfunksjonene.
Denne analysen bruker gDNA, som kan isoleres av en leukaperseprosedyre ved hjelp av kultiverte eller faste celler, eller frosne cellepellets. Det lave prøvekravet, fleksibiliteten i prøvestartmateriale, høy nøyaktighet og standardisert analyse tar for seg begrensningene forbundet med flytcytometri og er ideelle for kvalitetskontrollformål under celleterapiprosessutvikling.
Protocol
Alle menneskelige prøver ble hentet fra en kommersiell kilde etter deres retningslinjer for menneskelig forskningsetikk.
1. Genomisk DNA-isolasjon
MERK: Genomisk DNA-isolasjon utføres ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig sett (se Materialtabell)fra eventuelle hematopoetiske celler, for eksempel perifere blodmononukleære celler (PBMCer), renset T-celler eller andre hematopoetiske celletyper. I dette eksperimentet ble perifere blodmononukleære celler (PBMCer) og T-celler fra tre forskjellige menneskelige donorer brukt.
- Legg 1-2 x 106 hematopoetiske celler i et konisk rør og sentrifuge på 400 x g i 10 min.
- Aspirer supernatanten helt.
- Tilsett 350 μL lysis/bindingsbuffer til prøven og inkubator i 10 min ved 55 °C.
- Tilsett 50 μL proteinase K (20 mg/ml) til 350 μL cellesuspensjon og virvel i 30 s.
- Tilsett 50 μL DNA bindende paramagnetiske perler og 400 μL av 100% isopropanol og inkuber i 3 min ved romtemperatur (RT).
- Plasser røret på et magnetisk stativ i 2 min og fjern supernatanten, pass på at du ikke forstyrrer perlene. DNA-et er bundet til de magnetiske perlene på dette trinnet.
- Tilsett 950 μL vaskebuffer 1. Vortex i 30 s og gjenta trinn 1,6.
- Gjenta trinn 1.7.
- Tilsett 950 μL vaskebuffer 2. Vortex i 30 s og gjenta trinn 1,6.
- Tilsett 100 μL elutionbuffer og virvel i 2 min. Plasser røret på et magnetisk stativ i 1 min og overfør supernatanten som inneholder gDNA til et nytt rør.
- Bruk 1 μL av gDNA isolert fra hematopoetiske celler for å måle renheten til gDNA ved å bruke et fluorimeter ved å få OD ved 260 nm, 280 nm og 230 nm. Kontroller at forholdet mellom optisk tetthet (OD-forhold) ved 260 og 280 nm er mellom 1,7-2,0 og OD-forholdet ved 260 og 230 nm er mellom 1,5-2,4.
2. Prøveforberedelse
- Forvarm en termomikser til 56 °C.
- Etikett 2 ml rør for alle prøver, kalibrator og referansemateriale.
- Fortynn prøvene og kalibratoren med elutionbufferen (tilgjengelig med settet som brukes til trinn 1) ved RT.
- For alle eksperimentelle prøver, fortynn gDNA til et totalt volum på 142 μL. For eksempel fortynn4 μL gDNA ved 100 ng/μL i 138 μL elutionbuffer.
MERK: 400-1200 ng av gDNA kan brukes til analysen. - Fortynn 75 μL av kalibratoren til et totalt volum på 142 μL.
- Kontroller referansekonsentrasjonen med et spektrofotometer ved hjelp av TE (pH = 8,0) som et tomt.
- Fortynn 1000-1200 ng av referansen gDNA til et totalt volum på 142 μL. For eksempel fortynn10 μL referanse gDNA ved 100 ng/μL i 132 μL elutionbuffer.
- For alle eksperimentelle prøver, fortynn gDNA til et totalt volum på 142 μL. For eksempel fortynn4 μL gDNA ved 100 ng/μL i 138 μL elutionbuffer.
- Inkuber rørene ved 56 °C i 5 min ved 900 o/min i en termomikser. Spinn kort ned rørene for å samle prøvene.
3. Konvertering av Bisulfite
MERK: Kontroller at inkubasjonstidene under bisulfittkonverteringen følger de anbefalte tidene. Overinkubasjon eller inkubasjon vil påvirke resultatene av analysen.
- Sett en termomikser til 80 °C.
- Tilsett 270 μL ammoniumbisulfitt og 90 μL tetrahydrofurfuryl alkohol (THFA) til alle rørene. Vortex å blande helt og kort spinne ned prøvene for å samle væsken nederst.
- Inkuber rørene i en termomikser ved 80 °C i 45 min ved 900 o/min. Hvis du bruker en varmeblokk, vortex rørene i 1-2 s hver 4,5 min under inkubasjon.
- Kort spinn ned prøvene og la avkjøles til RT i 3-5 min før du fortsetter med trinn 4 eller 5. Det endelige volumet skal være ~ 500 μL.
4. CD8 og Treg analyser
- DNA-rensing etter bisulfittkonvertering
MERK: Dette trinnet utføres ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig DNA-rensesett (se Materialtabell)på bisulfittkonvertert DNA. Kontroller at reagensene varmes opp til RT før bruk.- Før du starter rensingen, lag en homogen blanding av DNA-isolasjonparamagnetiske perler ved å virvle i 30 s. Tilsett etanol og isopropanol til vaskebufferne, etter volumene som er oppført på flaskene, og sett en varmeblokk til 65 °C.
- Ved RT tilsett 870 μL lysis/bindingsbuffer og 105 μL DNA-bindende paramagnetiske perler til hvert rør fra trinn 3,4. Vortex å blande helt og kort spinne ned rørene.
- Tilsett 570 μL 2-propanol og vortex for å blande helt.
- Inkuber rørene ved RT i 7 min ved 50 o/min i en termomikser eller en standard roterende mikser.
- Spinn kort ned rørene. Plasser rørene på magnetstativet og inkuber i 5 min.
- Med prøvene fortsatt på magnetstativet, fjern supernatanten uten å forstyrre perlene.
MERK: DNA-et er bundet til perlene. - Fjern rørene fra magnetstativet og tilsett 900 μL vaskebuffer 1. Vortex rørene for å fullstendig resuspendere perlene og deretter kort spinne ned rørene.
- Returner rørene til magnetstativet og inkuber i 3 min.
- Med prøvene fortsatt på magnetstativet, fjern supernatanten uten å forstyrre perlene.
- Gjenta vaskene (4.1.7-4.1.9), én gang med vaskebuffer 1, deretter to ganger med vaskebuffer 2.
- Etter å ha fjernet supernatanten, spinn kort ned rørene og gå tilbake til magnetstativet i 3 min.
- Fjern all restvaskbuffer 2 og fjern rørene fra magnetstativet.
- Tørk perlene med rørlokkene åpne ved 65 °C i 15 min.
- Tilsett 60 μL elutionbuffer til hvert rør og inkubator ved RT i 7 min ved 1400 o/min. Alternativt, vortex i moderat hastighet ved hjelp av en skumadapter.
- Spinn kort ned rørene og plasser på magnetstativet i 2 min.
- Overfør 55 μL av eluattil et nytt rør uten å forstyrre perlene. Eluatet inneholder det bisulfittkonverterte DNA-et. Måling av DNA-konsentrasjonen er ikke nødvendig.
- Konfigurere og kjøre qPCR
- Slå på qPCR-maskinen og datamaskinen som driver programvaren.
- På programvaren brukergrensesnittet opprette et nytt eksperiment og velge hvilken blokk som brukes til å kjøre eksperimentet.
- Velg Standardkurve som eksperimenttype.
- Hvis det er aktuelt, velger du hvilken deteksjonskjemi du vil bruke. Denne analysen bruker TaqMan-reagensene. Ellers velger du ROX som passiv referanse.
- Hvis det er aktuelt, velger du egenskapene til instrumentet som kjører som Standard.
- Definer eksperimentell design ved å tilordne mål (f.eks. GAPDH eller CD8 med FAM som reporter), og en ikke-fluorescerende quencher.
- Tilordne eksempelnavn for standarder, eksempler og kontroller.
- Deretter tilordner du hver brønnposisjon i henhold til qPCR-platen. Hver brønn krever et mål, for eksempel CD8 eller GAPDH, og et eksempelnavn. Hver prøve kjøres i triplicate og må reflekteres på plateoppsettet for instrumentet.
- Tilordne hver standard oppgavestandarden, og angi de endelige kopinumrene i henhold til tabell 1.
- Tilordne eksempler, kalibrator og referanse til oppgaven Ukjent.
- Angi brønner for ingen malkontroll som NTC eller N.
- Forbered seriefortynningene av lambda-DNA (10 ng/μL) som skal brukes som standard (se tabell 1).
- Forbered qPCR master mix cocktails, en for målet celletype og en for GAPDH (se tabell 2). Kjør alle prøvene, standardene og NTC-kontrollen i triplicate.
MERK: GAPDH brukes til å kvantifisere det totale antallceller og kjøres parallelt med målforsterkningen. Kopier av umetylerte regulatoriske elementer for CD8 B-genet måles i CD8-analysen, FoxP3 i Treg og IL-17 i Th17. - Bruk en 96 brønnplate for qPCR. Last 3 μL mal DNA inn i brønnene først. Deretter legger du 7 μL av hovedblandingen.
- Forsegle platen med en qPCR-film og spinn kort ned platen før du plasserer den i qPCR-instrumentet.
- Kjør qPCR som vist i tabell 3.
- Når du er fullført, eksporterer du qPCR-dataene som en TXT- eller XLSX-fil.
- Analyser dataene ved hjelp av analysemaler for CD8-analysen og Treg-analysen (se Materialtabell) for å beregne Ct-gjennomsnittet, Ct-standardavviket og Kopieringsnummeret.
| Første plasmid kopi nummer/3 μL | Volum | Fortynnings-DNA [1] | Endelig kopinummer per 3 μL | Etiketten |
| 31250 | 1000 μL | - | 31250 | Std # 1 |
| 31250 | 200 μL | 800 μL | 6250 | Std # 2 |
| 6250 | 200 μL | 800 μL | 1250 | Std # 3 |
| 1250 | 200 μL | 800 μL | 250 | Std # 4 |
| 250 | 200 μL | 800 μL | 50 | Std # 5 |
| 1250 | 30 μL | 1200 μL | 30 | STD # 6 [2] |
| [1] 10 ng/μL Lambda DNA i TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) | ||||
| [2] Bruk STD#3 til å klargjøre STD#6 | ||||
Tabell 1: Utarbeidelse av standard fortynninger. En 4-log fortynning standarder som strekker seg over 31250-30 eksemplarer ble utarbeidet i henhold til bordet ved hjelp av TE / lambda DNA som fortynningsstoff. De samme standard fortynningene ble brukt for både CD8 og GAPDH. Standardene ble lagret ved -20 °C.
| Reagenser | Beløpet |
| Lambda DNA (50 ng/μL i TE, pH8.0) | 1 μL |
| TaqMan analyse | 0,5 μL |
| Vann, Kjernefri | 0,5 μL |
| Master Mix | 5 μL (5 μL) |
| Totalt | 7 μL (7 μL) |
Tabell 2: Utarbeidelse av qPCR-cocktail. Forbered qPCR-mesterblandingen i to separate rør, en hver for CD8 og GAPDH, unntatt mal-DNA i henhold til tabellen.
| Trinn | Tid | Temp | Sykluser |
| Pre-inkubasjon | 35 min. | 95°C | 1X (andre) |
| Forsterkning | 15 sek | 95°C | 50X (andre) |
| 1 min. | 61°C | ||
| Cooldown | 5 sek | 42°C | 1X (andre) |
Tabell 3: qPCR kjøre parametere for CD8 og Treg analyse. QPCR ble kjørt i henhold til parameterne som er angitt i tabellen.
5. Th17 analyse
- DNA-rensing etter bisulfittkonvertering
- Utfør rensetrinnene som beskrevet i avsnitt 4.1.
- For å elute prøvene, tilsett 25 μL elutionbuffer til hvert rør og inkuber ved RT i 7 min ved 1400 rpm. Alternativt, vortex i moderat hastighet ved hjelp av en skumadapter.
- Spinn kort ned rørene og legg på et magnetisk stativ i 2 min.
- Overfør 20 μL av eluattil et nytt rør uten å forstyrre perlene. Eluatet inneholder det bisulfittkonverterte DNA-et.
- DNA preamplification
MERK: DNA preamplification anbefales for lav overflod mål for nøyaktig kvantifisering via qPCR19. Th17 metyleringanalysen ble designet for å kreve forampofasjon av denne grunn.- Overfør 2 μL bisulfitt-konvertert DNA til PCR-striperørene. Lag et NTC-rør med 2 μL vann.
- Opprett preamplification master mix for alle eksempler (se tabell 4).
- Tilsett 23 μL av masterblandingen til hvert rør. Cap rørene, vortex, og kort spinne ned rørene.
- Kjør preamplification protokollen på en termocycler ved hjelp av et oppvarmet lokk. (Tabell 5). Etter at løpet er fullført, kort spinne ned rørene.
- Overfør 2 μL av forsterket DNA til nye rør og tilsett 78 μL vann, fortynning av prøvene 1:40.
- qPCR satt opp og kjøre
- Følg avsnitt 4.2 for å konfigurere og kjøre qPCR.
- Analyser data ved hjelp av analysemalen for Th17-analysen (se Materialtabell) for å beregne Ct-gjennomsnitt, Ct-standardavvik og Kopieringsnummer.
| Reagens | Beløpet |
| Vann, Kjernefri | 9,5 μL |
| Hot Start PCR Master Mix | 12,5 μL |
| Th17 PCR Primer | 1 μL |
| Totalt | 23 μL (23 μL) |
Tabell 4: Forforsterker DNA-et for Th17-analysen. Den pre-amplification reaksjon stammiksen ble utarbeidet i henhold til bordet.
| Trinn | Tid | Temp | Sykluser |
| Pre-inkubasjon | 35 min. | 95°C | 1X (andre) |
| Denaturasjon | 1 min. | 95°C | 12 x (12 x) |
| Annealing | 45 sek | 55°C | |
| Langansering | 30 sek | 72°C | |
| Endelig forlengelse | 10 min. | 72°C | 1X (andre) |
| Holde | Ubestemt | 4°C (4°C) |
Tabell 5: Preamplify Th17 DNA. Th17 DNA ble pre-forsterket i 12 sykluser før selve qPCR.
Representative Results
Alle tre metyleringsanalyser begynner med en inngang av gDNA og resulterer i en prosentandel av CD8 + T-celler, Treg eller Th17 celler i hele cellepopulasjonen. Dataene som ble generert fra qPCR etter bisulfitekonvertering ble analysert ved hjelp av den angitte analysemalen. Denne malen brukte standardkurvene som er hentet fra standardeksemplene, til å estimere kopieringsnummeret til målene og totalt antall celletellinger i testprøvene. Prosentcelletypen ble deretter beregnet ved hjelp av formlene som er integrert i analysemalene. Figur 1 viser representative data fra CD8+-analysen, hentet fra å analysere både perifere blodmonukleære celler (PBMCer) og T-celler fra tre forskjellige donorer ved hjelp av både flow cytometri og den beskrevne metyleringsanalysen. Trendene mellom de to metodene på tvers av alle donorer i begge celletypene var like. Figur 2 viser representative data fra Treg-analysen. Tre rensede Treg-donorer ble analysert ved hjelp av både metyleringsbasert qPCR og flow cytometri, og resultatene ble plottet på grafen som ble vist. Resultatene for begge metodene var relativt like. Men i alle tilfeller flyt cytometri ga høyere verdier. Figur 3 viser sammenligningen av Th17-celler som oppdages via flow cytometri og metylering. I denne grafen er det stimulerte og ustimulerede forhold for de eksperimentelle metodene. Celler krever stimulering med PMA og ionomycin og behandling med en proteintransporthemmer for å øke mengden IL-17A tilstede i hver celle, slik at den kan oppdages via flow cytometri20. Metyleringsstatus kan oppdages uavhengig av stimuleringsstatusen. Flow cytometri ga lavere nivåer av Th17 celler sammenlignet med metylering. Følsomheten og spesifisiteten til analysen ble demonstrert av grensen for tomme verdier (LOB), registreringsgrensen (LOD) og grense for antall (LOQ) verdier som vises i tabell 6.
Figur 1: Sammenligning av flow og metylering av CD8+-prosenter for både PBMCer og T-celler for tre forskjellige givere. PBMCer og T-celler fra tre forskjellige donorer ble besagt for prosentandelen av CD8 + T-celler i hele populasjonen ved hjelp av enten flytcytometri eller metylering. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Flow og metylering sammenligning av Treg prosenter for renset Treg for tre forskjellige givere. Rensede Treg-celler ble besagt for prosentandelen tregceller i hele populasjonen ved hjelp av enten flytcytometri eller metylering. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Sammenligning av strømnings- og metylering av Th17 prosenter for stimulerte og ustimulerte eksperimentelle grupper. Stimulerte og ustimulerte T-celler ble analysert ved hjelp av både flytcytometri og metylering. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
| Analysen | Lob | Lod | LoQ (andre) |
| CD8 (CD8) | 0 | 19 | 52 |
| Gapdh (andre) | 0 | 7 | 21 |
| FoxP3 (andre) | 0 | 3 | 12 |
| Th17 TpG | 0 | 35 | 73 |
| Th17 CpG | 0 | 38 | 73 |
Tabell 6: LoB, LoD, LoQ av kopinumre for metyleringsbaserte analyser. Følsomhet og spesifisitet av analysen er beskrevet av LoB, LoD, og LoQ verdier oppnådd av MIQE retningslinjer21,22. Generelt kan så få som 40 eksemplarer oppdages nøyaktig av disse assays.
Discussion
Med bruk av nye immunterapeutiske midler er det behov for standardiserte metoder for å oppdage immuncelleidentitet og renhet. Vurderingsmetoder for prosess- og utgivelsestesting som er robuste, validerte og skalerbare, gjenstår å etablere og utgjøre en stor utfordring for kommersialiseringen av cellebaserte terapier. Mens flyt cytometri er for tiden den vanligste metoden for immuncelle fenotyping, høy prøvekvalitet og kvantitetskrav gjør det vanskelig for regelmessig bruk. Videre er implementering av flytcytometri i et godt produksjonspraksismiljø (GMP) begrenset av operatøravhengige gatingstrategier og kravet om referansestandarder for hver markør som brukes13,14. Selv om automatisert gating har vist seg å forbedre analyserobustheten, er det ennå ikke en veletablert kvalitetskontrollstrategi. Mens genuttrykkprofilering også kan brukes til å karakterisere celleterapi produktidentitet og renhet, dataene er semikvantitative og arbeidskrevende. I tillegg er RNA og microRNA relativt mindre stabile enn DNA og kan bidra til mangel på robuste og reproduserbare resultater. Dermed gir bruk av den epigenetiske DNA-metyleringsstatusen til en bestemt locus en stabil, lett å utføre, robust og skalerbar metode for å identifisere og kvantifisere en celletype av interesse.
Påvisning av metyleringsmønstre til fenotypeceller er avhengig av tre kritiske trinn: For det første krever analysen bruk av gDNA, som er isolert i henhold til de beskrevne metodene. Dna av høy kvalitet er nødvendig, og hvis den ikke brukes, kan bisulfittkonvertering bli påvirket23,24. Hvis DNA av lav kvalitet oppnås, anbefales ytterligere rensing for å sikre analysens pålitelighet. For det andre er vellykket bisulfittkonvertering av den umetylerte cytosin til uracil nødvendig. Det mest kritiske trinnet i bisulfittkonvertering er DNA-denaturering23,25. Høy temperatur denaturering ved hjelp av ammonium bisulfitt, i motsetning til natriumbisulfitt, øker konverteringseffektiviteten og konsistensen og er den anbefalte prosessen for disse analysene25,26. Brukere må sørge for at reaksjonen skjer ved 80 °C og at prøveblanding gjøres ofte. Av disse grunnene anbefales en digital termomikser (se Tabell over materialer). Tredje, riktig pipettering teknikk må følges under qPCR forberedelse. Tre tekniske replikaer er nødvendig under qPCR-reaksjonen for å følge minimumsinformasjonen for publisering av kvantitative PCR-eksperimenter (MIQE) retningslinjer(27). Inkludering av mer tekniske replikaser er akseptabelt, men ikke nødvendig. Feil pipetteringsteknikk og/eller ikke inkludert tekniske replikater vil føre til upålitelige qPCR-resultater.
Hvis de kritiske trinnene følges og ønskede resultater fortsatt ikke oppnås, kan flere kontroller i analysen utnyttes til å finne problemet. Riktig bisulfite konvertering er det mest avgjørende trinnet i denne analysen. Feil bisulfitekonvertering vil bli fremhevet av en mislykket kalibreringsfaktor og/eller referanseverdier beregnet av analysemalen. Hvis bisulfitekonverteringen ble utført feil (f.eks. hvis reaksjonen ble utført ved RT), ville det ikke være noen forsterkning under qPCR. Det ville heller ikke bli sett noen forsterkning hvis det ble gjort en feil under qPCR-reaksjonspreparatet (f.eks. hvis qPCR-mesterblandingen ikke ble lagt til). Disse to problemene kan skilles ved å undersøke standardprøvene. Forsterkning i standardprøvene, men ikke referansen, kalibratoren og eksperimentelle prøver, ville indikere at bisulfittkonverteringen ikke ble utført riktig. Ingen forsterkning i noen av prøvene vil indikere at qPCR ikke ble utført riktig.
Selv om denne analysen adresserer det strenge prøvekravet og analysevariasjonen forbundet med andre fenotypingsmetoder, spesielt flytcytometri, er det begrensninger som må noteres. Denne analysen retter seg mot ett enkelt locus som brukes som en unik identifikator for målcellen, som forbyr multipleksert analyse som vanligvis utføres med flytcytometri. Dette gjør det vanskelig å identifisere komplekse celletyper som Th17. Imidlertid har bruk av metyleringsmønstre på en enkelt locus vist seg å være en nøyaktig fenotypisk markør for flere celler og har blitt brukt i flere kliniske studier15,16. Dette gjelder spesielt i Tregs hvor vurdering av FOXP3 metyleringsignaturer er en nøyaktig og entydig metode for å oppdage sanne Tregs fra forbigående FOXP3 som uttrykker celler28. Tapet av multipleksert analyse kompenseres av nøyaktigheten av loci avhørt. Fremtidige iterasjoner av analysen kan omfatte flere qPCR fargestoffer og slukkere for å tillate påvisning av flere loci i en qPCR reaksjon.
Denne analysen kan brukes som en alternativ metode for flytcytometri i å bestemme celle fenotype og identitet. Det bør bemerkes at denne analysen ikke gir de eksakte verdiene som flyter cytometri gjør (Tall 1-3). Dette skyldes delvis variasjonen i dataanalyse forbundet med flytcytometri. Avhengig av gating strategi, resultatene fra flyt cytometri kan variere betydelig. Dette er spesielt tilfelle når du bruker komplekse farging protokoller for å se på intracellulære mål, for eksempel IL-17, hvor koeffisienten av variasjon (CV) kan være så høyt som 15%14. Mellom flere brukere hadde analysen som presenteres konsekvent en CV på <15%, som støttet robustheten til analysen og forbedrede standardiseringsfunksjoner. De største forskjellene mellom epigenetisk og flow cytometribasert fenotyping ses når cellestimulering er nødvendig (figur 3). Påvisning av Th17 celler via flyt cytometri ble oppnådd ved hjelp av en felles protokoll for T cellestimulering og intracellulær cytokin flekker29,30,31. Forskjellene sett i Th17 fenotyping mellom epigenetisk måling og flyt cytometri kan skyldes kinetikken til IL-17 produksjon. Mens metyleringsignaturer er stabile, tar proteinproduksjonen tid og må være tilstede i tilstrekkelige mengder som skal oppdages av fluorescerende antistoffer20,32. 6 h inkubasjon med proteintransporthemmer og cellestimuleringscocktail må kanskje utvides for å se nivået av Th17-celler oppdaget via epigenetiskbaserte fenotypingsmetoder. Flere studier er nødvendig for å bestemme den nøyaktige grunnen til at verdiene ikke samsvarer og bestemme den mest nøyaktige fenotyping metoden.
I denne rapporten beskriver vi hvordan vi identifiserer og kvantifiserer immuncelletyper i en heterogen blanding av celler på en enkel og robust måte. Assays er designet og optimalisert for potensiell bruk for in-process og release testing av cellebaserte terapeutiske midler. De beskrevne analysene oppfyller kravet om høyt kvalifiserte råvarer som skal brukes i celleterapiapplikasjoner. Ved å ta opp manglene ved flytcytometri og andre molekylære metoder som stabilitet, prøvekrav, tidligere stimulering, cellulær permeabilisering for intracellulær farging og subjektivitet av dataanalyse, er de beskrevne analysene i tråd med mål om kommersialisering av cellebaserte terapier.
Disclosures
Suman K. Pradhan, Jerry Guzman, Carl Dargitz, Landon og Uma Lakshmipathy er ansatt av Thermo Fisher Scientific. Sven Olek, Bjoern Samans og Ulrich Hoffmueller er en av grunnleggerne og ansatte i selskapet Epiontis. Ingen skrivehjelp ble benyttet i produksjonen av dette manuskriptet.
Acknowledgments
Prosjektet ble finansiert av Thermo Fisher Scientific Intramural stipend.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0 ml Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 22363344 | |
| Analysis template for CD8 assay | Click Here | ||
| Analysis template for Th17 assay | Click Here | ||
| Analysis template for Treg assay | Click Here | ||
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer, blue/red/violet6/yellow | Thermo Fisher Scientific | A29004 | |
| CTS PureQuant CD8+ T-Cell Assay | Thermo Fisher Scientific | A43674 | |
| CTS PureQuant Th17 Assay | Thermo Fisher Scientific | A43676 | |
| CTS PureQuant Treg Assay | Thermo Fisher Scientific | A43675 | |
| Dynabeads SILANE Genomic DNA Kit | Thermo Fisher Scientific | 37012D | Used for genomic DNA isolation and purification after bisulfite conversion. Contains elution buffer to dilute samples. |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Used as a magnetic rack during DNA isolation and purification |
| eBioscience Essential Human T cell Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42923 | |
| eBioscience Essential Human Th1/Th17 Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42927 | |
| eBioscience Essential Human Treg Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42925 | |
| Eppendorf SmartBlock 2 mL | Eppendorf | 5362000035 | |
| Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | Recommended sample mixer |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND 1000 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Applied Biosystems | AM12450 | |
| QuantStudio 12S Flex | Applied Biosystems | 4470661 | |
| TE, pH 8.0, RNase-free | Thermo Fisher Scientific | AM9849 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | H2KT17113 |
References
- Hartmann, J., Schüßler-Lenz, M., Bondanza, A., Buchholz, C. J. Clinical development of CAR T cells-challenges and opportunities in translating innovative treatment concepts. EMBO Molecular Medicine. 9, 1183-1197 (2017).
- Graham, C., Jozwik, A., Pepper, A., Benjamin, R. Allogeneic CAR-T Cells: More than Ease of Access? Cells. 7, E155 (2018).
- Turtle, C. J., et al. CD19 CAR-T cells of defined CD4+:CD8+ composition in adult B cell ALL patients. Journal of Clinical Investigation. 126, 2123-2138 (2016).
- Akalin, I., et al. Effects of Chimeric Antigen Receptor (CAR) Expression on Regulatory T Cells. Molecular Therapy. 17, S25 (2009).
- Knochelmann, H. M., et al. CAR T Cells in Solid Tumors: Blueprints for Building Effective Therapies. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Chen, M. L., et al. Regulatory T cells suppress tumor-specific CD8 T cell cytotoxicity through TGF-β signals in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102, 419-424 (2005).
- Muranski, P., et al. Tumor-specific Th17-polarized cells eradicate large established melanoma. Blood. 112, 362-373 (2008).
- Majchrzak, K., et al. Exploiting IL-17-producing CD4+ and CD8+ T cells to improve cancer immunotherapy in the clinic. Cancer Immunology, Immunotherapy. 65, 247-259 (2016).
- Guedan, S., et al. ICOS-based chimeric antigen receptors program bipolar TH17/TH1 cells. Blood. 124, 1070-1080 (2014).
- Vicetti Miguel, R. D., Maryak, S. A., Cherpes, T. L. Brefeldin A, but not monensin, enables flow cytometric detection of interleukin-4 within peripheral T cells responding to ex vivo stimulation with Chlamydia trachomatis. Journal of Immunological Methods. 384, 191-195 (2012).
- Lovelace, P., Maecker, H. T. Multiparameter Intracellular Cytokine Staining. Methods in Molecular Biology. 699, 165-178 (2011).
- Presicce, P., Moreno-Fernandez, M. E., Lages, C. S., Orsborn, K. I., Chougnet, C. A. Association of two clones allows for optimal detection of human FOXP3. Cytometry A. 77, 571-579 (2010).
- Pachón, G., Caragol, I., Petriz, J. Subjectivity and flow cytometric variability. Nature Reviews Immunology. 12, 396 (2012).
- Westera, L., et al. Centrally Determined Standardization of Flow Cytometry Methods Reduces Interlaboratory Variation in a Prospective Multicenter Study. Clinical and Translational Gastroenterology. 8, e126 (2017).
- Baron, U., et al. Epigenetic immune cell counting in human blood samples for immunodiagnostics. Science Translational Medicine. 10, (2018).
- Kleen, T. O., Yuan, J. Quantitative real-time PCR assisted cell counting (qPACC) for epigenetic - based immune cell quantification in blood and tissue. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 46 (2015).
- Rapko, S., et al. DNA methylation analysis as novel tool for quality control in regenerative medicine. Tissue Engineering. 13, 2271-2280 (2007).
- Wieczorek, G., et al. Quantitative DNA Methylation Analysis of FOXP3 as a New Method for Counting Regulatory T Cells in Peripheral Blood and Solid Tissue. Cancer Research. 69, 599-608 (2009).
- Andersson, D., et al. Properties of targeted preamplification in DNA and cDNA quantification. Expert Review of Molecular Diagnosis. 15, 1085-1100 (2015).
- Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 159, 197-207 (1993).
- Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of Blank, Limit of Detection and Limit of Quantitation. Clinical Biochemistry Reviews. 29, S49-S52 (2008).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55, 611-622 (2009).
- Li, Y., Tollefsbol, T. O. DNA methylation detection: Bisulfite genomic sequencing analysis. Methods in Molecular Biology. 791, 11-21 (2011).
- Warnecke, P. M., et al. Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing. Methods. 27, 101-107 (2002).
- Genereux, D. P., Johnson, W. C., Burden, A. F., Stöger, R., Laird, C. D. Errors in the bisulfite conversion of DNA: modulating inappropriate- and failed-conversion frequencies. Nucleic Acids Research. 36, e150 (2008).
- Darst, R. P., Pardo, C. E., Ai, L., Brown, K. D., Kladde, M. P. Bisulfite Sequencing of DNA. Current Protocols in Molecular Biology. 91, 7.9.1-7.9.7 (2010).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50, S1-S5 (2010).
- Baron, U., et al. DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. European Journal of Immunology. 37, 2378-2389 (2007).
- Yao, Z., et al. Human IL-17: a novel cytokine derived from T cells. Journal of Immunology. 155, 5483-5486 (1995).
- Lockhart, E., Green, A. M., Flynn, J. L. IL-17 production is dominated by gammadelta T cells rather than CD4 T cells during Mycobacterium tuberculosis infection. Journal of Immunology. 177, 4662-4669 (2006).
- Liang, S. C., et al. Interleukin (IL)-22 and IL-17 are coexpressed by Th17 cells and cooperatively enhance expression of antimicrobial peptides. Journal of Experimental Medicine. 203, 2271-2279 (2006).
- Olsen, I., Sollid, L. M. Pitfalls in determining the cytokine profile of human T cells. Journal of Immunological Methods. 390, 106-112 (2013).
