Summary
Qui descriviamo un metodo robusto per determinare l'identità e la purezza delle cellule immunitarie attraverso firme epigenetiche rilevate utilizzando la PCR quantitativa (qPCR). La demetilazione del DNA in un locus specifico funge da identificatore univoco per un particolare tipo di cellula e consente l'identificazione delle cellule T CD8, normative o Th17.
Abstract
Le frequenze della popolazione di sottotipi di cellule immunitarie possono avere un grande effetto sull'efficacia delle terapie con cellule T. I metodi attuali, come la citometria di flusso, hanno requisiti di campionamento specifici, un elevato input di campione, hanno una bassa produttività e sono difficili da standardizzare, che sono tutti dannosi per la caratterizzazione dei prodotti di terapia cellulare durante il loro sviluppo e Produzione.
I test descritti qui identificano e quantificano accuratamente i tipi di cellule immunitarie in una miscela eterogenea di cellule che utilizzano DNA genomico isolato (gDNA). I modelli di metilazione del DNA si rivelano attraverso la conversione bisulfita, un processo in cui le citosine non metilate vengono convertite in uracili. Le regioni del DNA non metilato vengono rilevate attraverso l'amplificazione qPCR utilizzando primer che prendono di mira le aree convertite. Un locus univoco per analisi viene misurato e funge da identificatore accurato per un tipo di cella specifico. I test sono robusti e identificano le cellule CD8, regulatory e Th17 T in modo ad alta produttività. Questi saggi ottimizzati possono essere potenzialmente utilizzati per i test di rilascio in-process e di prodotto per il processo di terapia cellulare.
Introduction
L'uso di cellule T nell'immunoterapia cellulare è aumentato in modo significativo nell'ultimo decennio, soprattutto con l'avvento del recettore dell'antigene chimerico (CAR) della tecnologia delle cellule T1. Mentre le terapie basate sulle cellule T sono state soddisfatte con grande successo clinico, sono eterogenee e le caratteristiche e le identità delle cellule possono variare in modo significativo tra i donatori2. L'eterogeneità delle popolazioni di cellule T può avere un impatto importante sull'efficacia terapeutica e complicare le conclusioni dagli studi clinici. Per questo motivo, è fondamentale comprendere l'eterogeneità delle cellule T durante la produzione e la formulazione del prodotto per determinare le formulazioni ottimali delle immunoterapie a cellule T.
In senso lato, le cellule T possono essere divise in due gruppi: le cellule T helper CD4, che secernono citochine immunomodulatori, e le cellule T citotossiche CD8, che lisizzano direttamente le cellule che presentano l'antigene cognato sulle principali molecole del complesso di istocompatibilità (MHC) I. Le cellule T helper CD4 possono differenziarsi in una miriade di sottoinsiemi specifici che producono un insieme univoco di citochine. Alcuni suggeriscono che un rapporto definito tra le cellule T CD4 e CD8 nel prodotto cellulare finale massimizza l'efficacia e la persistenza in vivo, ma potrebbe complicare la produzione cellulare3. Le cellule T regolatorie (Tregs), un sottoinsieme di cellule T CD4, sono immunosoppressive e diminuiscono l'attivazione delle cellule immunitarie. Le cellule T regolatorie sono state implicate nella mediazione della tolleranza tumorale e, se presenti durante la produzione di cellule T CAR, possono inibire la risposta immunitaria antitumorale delle cellule T CAR4,5,6. Altri sottoinsiemi di CD4, come le cellule T helper 17 (Th17) T promuovono la clearance tumorale e possono essere sfruttate per aumentare l'efficacia delle terapie con cellule T. Così, aumentando le cellule T Th17 CD4 è di particolare interesse per le impostazioni tumorali solide dove l'aumento della produzione di interleula 17 (IL-17) promuove la risposta immunitaria antitumorale5,7,8,9. Comprendere l'importanza delle cellule Th17 nelle risposte tumorali ha spinto ulteriori indagini sulle strategie per generare queste cellule in vitro7,9. Pertanto, i metodi per rilevare questi sottoinsiemi di cellule T sono fondamentali per ottimizzare le terapie con cellule T e dovrebbero essere robusti, facili, scalabili e riproducibili.
La citometria di flusso è il metodo più comune per determinare l'identità di una cellula immunitaria. Tuttavia, la citometria di flusso richiede cellule vive e intatte che devono essere analizzate lo stesso giorno in cui vengono raccolte. Per la colorazione citochina intracellulare (ICS), l'inibizione della secrezione proteica è necessaria per trattenere le citochine all'interno delle cellule T. Tuttavia, diversi composti inibitori hanno effetti differenziali sulla secrezione di citochine specifiche, costringendo gli utenti a creare cocktail specializzati per il rilevamento della citochina di interesse10,11. Inoltre, la fedeltà della citometria di flusso si basa su cloni di anticorpi che si legano specificamente e potentemente al loro obiettivo. L'uso di diversi cloni di anticorpi può causare risultati variabili e portare a conclusioni imprecise, rendendo il metodo difficile da standardizzare12. Inoltre, l'analisi dei dati raccolti tramite la citometria di flusso, e quindi le conclusioni tratte dai dati, possono variare notevolmente tra gli utenti in base a come i cancelli sono impostati13,14. Per questi motivi, la citometria di flusso non è ideale per un controllo di qualità preciso durante lo sviluppo della terapia cellulare.
La valutazione della metilazione genomica in specifici loci genici è un metodo alternativo per determinare l'identità cellulare. La logica per l'utilizzo della metilazione del DNA per identificare tipi di cellule specifici è stata descritta in più articoli e si basa su specifici modelli di metilazione presenti in una determinata popolazione cellulare15,16,17. Nelle cellule bersaglio, alcuni siti contengono nucleotidi non metilati, mentre nelle cellule non bersaglio questi siti sono metilati. Questo modello può essere rilevato attraverso la conversione bisulfita, un processo che converte esclusivamente nucleotidi citosini non metilati (C) in uracil (U). Primer e sonde possono essere progettati contro i siti convertiti, quindi amplificati e rilevati attraverso qPCR16.
Il saggio qui descritto misura la frequenza dei sottotipi di cellule immunitarie all'interno di popolazioni eterogenee quantificando il numero di loci unmetilati specifici rispetto a un gene di pulizia. Copie degli elementi regolatori non metilati per il gene CD8 B sono misurate nel test CD8, FoxP3 a Treg e IL-17 in Th17 in questo test. Questi loci sono stati identificati isolando la popolazione cellulare specifica di interesse (ad esempio, cellule T CD8) ed eseguendo il sequenziamento bisulfite per identificare i loci che non sono metilati solo in quella cellula di tipo15. Primer e sonde sono sviluppati contro i loci straordinariamente non metilati e i campioni vengono analizzati tramite qPCR. Una curva standard di numeri di copia noti viene creata da diluizioni di un plasmide standard con numero di copia elevato, consentendo la conversione di un valore Ct in un numero di copia della trascrizione.
Per valutare le prestazioni del test, sono necessari campioni di controllo, tra cui un gDNA di riferimento e un plasmide calibratore. Il materiale genomico di riferimento è un campione di sangue raggruppato da donatori multipli con frequenze note di cellule immunitarie e viene utilizzato per un controllo delle prestazioni di analisi di controllo di qualità (QC). Il campione di calibratore è un plasmide sintetizzato che contiene le sequenze geniche CD8, FoxP3 e GAPDH in un rapporto equimolare. Viene utilizzato come misura dell'efficienza di conversione bisulfita, perché le conversioni bisulfite all'interno di diverse regioni genomiche varieranno in efficienza. Il rapporto tra l'obiettivo e GAPDH all'interno del calibratore è 1, ma a causa delle differenze di efficienza di conversione bisulfite, il rapporto può variare. Questo fattore di calibrazione viene applicato ai saggi CD8 e Treg. FoxP3, il gene usato nel saggio Treg, si trova sul cromosoma X. Poiché questo test misura solo copie non metilate di FoxP3, e solo una copia di FoxP3 è non metilata in Tregs, questo test è indipendente dal sesso e può essere utilizzato con campioni sia maschili che femminili18. L'analizzatore Th17 non utilizza un campione di calibratore o GAPDH come gene di pulizia. Invece, è incluso un altro set di primer che si rivolge ai loci metilati presenti nelle cellule non Th17 e il numero totale di cellule è riflesso dalla somma delle copie metilate e non metilate di IL-17. I dati ottenuti dal qPCR vengono inseriti in un modello di analisi preimpostato che esegue controlli di qualità sui dati e calcola la percentuale della cella di destinazione all'interno della popolazione iniziale. Ciò fornisce un'analisi dei dati automatizzata e imparziale, rimuovendo così la soggettività dell'utente e migliorando le capacità di standardizzazione.
Questo saggio utilizza gDNA, che può essere isolato da una procedura di leukapheresis utilizzando celle coltivate o fisse, o pellet cellulari congelati. Il basso fabbisogno di campioni, la flessibilità nel materiale di partenza del campione, l'alta precisione e l'analisi standardizzata affrontano i limiti associati alla citometria di flusso e sono ideali per scopi di controllo della qualità durante lo sviluppo del processo di terapia cellulare.
Protocol
Tutti i campioni umani sono stati ottenuti da una fonte commerciale seguendo le loro linee guida per l'etica della ricerca umana.
1. Isolamento del DNA genomico
NOTA: L'isolamento del DNA genomico viene eseguito utilizzando un kit disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali)da qualsiasi cellula ematopoietica, come le cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC), le cellule T purificate o qualsiasi altro tipo di cellula ematopoietica. In questo esperimento sono state utilizzate cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) e cellule T di tre diversi donatori umani.
- Mettere 1-2 x 106 cellule ematopoietiche in un tubo conico e centrifugare a 400 x g per 10 min.
- Aspirare completamente il super-attuoso.
- Aggiungere 350 l di lis-buffer di legame al campione e incubare per 10 min a 55 gradi centigradi.
- Aggiungere 50 l di proteine assi K (20 mg/mL) a 350 - L di sospensione cellulare e vortice per 30 s.
- Aggiungere 50 l di perline paramagnetiche leganti al DNA e 400 l un di 100% isopropanolo e incubare per 3 min a temperatura ambiente (RT).
- Posizionare il tubo su un rack magnetico per 2 min e rimuovere il supernatante, facendo attenzione a non disturbare le perline. Il DNA è legato alle perle magnetiche in questo passaggio.
- Aggiungere 950 l di lavaggio tampone 1. Vortice per 30 s e ripetere il passo 1.6.
- Ripetere il passaggio 1.7.
- Aggiungere 950 l di lavaggio tampone 2. Vortice per 30 s e ripetere il passo 1.6.
- Aggiungere 100 l di tampone di eluizione e vortice per 2 min. Posizionare il tubo su un supporto magnetico per 1 min e trasferire il supernatante contenente il gDNA in un nuovo tubo.
- Utilizzare 1 l di gDNA isolato dalle cellule ematopoietiche per misurare la purezza del gDNA mediante spettrofotometria utilizzando un fluorimetro ottenendo l'OD a 260 nm, 280 nm e 230 nm. Assicurarsi che il rapporto di densità ottica (rapporto OD) a 260 e 280 nm sia compreso tra 1,7-2,0 e che il rapporto OD sia compreso tra 1,5 e 2.4.
2. Preparazione del campione
- Preriscaldare un termomiscelatore a 56 gradi centigradi.
- Etichettare i tubi da 2 mL per tutti i campioni, il calibratore e il materiale di riferimento.
- Diluire i campioni e calibrare con il tampone di eluizione (disponibile con il kit utilizzato per il passaggio 1) a RT.
- Per tutti i campioni sperimentali, diluire il gDNA ad un volume totale di 142. Ad esempio, diluire 4 ol di gDNA a 100 ng/L in 138 l di buffer di eluizione.
NOTA: 400-1.200 ng di gDNA può essere utilizzato per il saggio. - Diluire 75 l del calibratore per un volume totale di 142.
- Controllare la concentrazione di gDNA di riferimento con uno spettrofotometro, utilizzando TE (pH - 8.0) come uno spazio vuoto.
- Diluire 1.000-1.200 ng del gDNA di riferimento per un volume totale di 142 L. Ad esempio, diluire 10 - L di gDNA di riferimento a 100 ng/L in 132 l di buffer di eluizione.
- Per tutti i campioni sperimentali, diluire il gDNA ad un volume totale di 142. Ad esempio, diluire 4 ol di gDNA a 100 ng/L in 138 l di buffer di eluizione.
- Incubare i tubi a 56 gradi centigradi per 5 min a 900 giri/m in un termomixer. Ruotare brevemente i tubi per raccogliere i campioni.
3. Conversione Bisulfite
NOTA: Assicurarsi che i tempi di incubazione durante la conversione bisulfite seguano i tempi consigliati. L'eccessiva incubazione o la sotto-incubazione influenzeranno i risultati del saggio.
- Impostare un termomixer a 80 gradi centigradi.
- Aggiungere 270 -L di bisulfite di ammonio e 90 -L di alcool tetraidrofurfuryl (THFA) a tutti i tubi. Vortice per mescolare completamente e brevemente verso il basso i campioni per raccogliere il liquido sul fondo.
- Incubare i tubi in un termomixer a 80 gradi centigradi per 45 min a 900 giri/m. Se si utilizza un blocco di calore, vortice i tubi per 1-2 s ogni 4,5 min durante l'incubazione.
- Ruotare brevemente i campioni e lasciare raffreddare a RT per 3-5 min prima di continuare con il passaggio 4 o 5. Il volume finale dovrebbe essere di 500 dollari l.
4. I saggi CD8 e Treg
- Purificazione del DNA dopo la conversione bisulfite
NOTA: questo passaggio viene eseguito utilizzando un kit di purificazione del DNA disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali)sul DNA convertito bisulfite. Assicurarsi che i reagenti siano riscaldati a RT prima dell'uso.- Prima di iniziare la purificazione, creare una miscela omogenea delle perle paramagnetiche di isolamento del DNA vortice per 30 s. Aggiungere etanolo e isopropanolo ai buffer di lavaggio, seguendo i volumi elencati sulle bottiglie, e impostare un blocco di calore a 65 gradi centigradi.
- A RT, aggiungere l'870 l di buffer di lisi/legante e 105 l di perline paramagnetiche leganti al DNA per ogni tubo dal punto 3.4. Vortice per mescolare completamente e brevemente verso il basso i tubi.
- Aggiungere 570 l di 2 propanol e vortice per mescolare completamente.
- Incubare i tubi a RT per 7 min a 50 rpm in un termomixer o un miscelatore rotante standard.
- Ruotare brevemente i tubi. Posizionare i tubi sul rack magnetico e incubare per 5 min.
- Con i campioni ancora sul rack magnetico, rimuovere il supernatante senza disturbare le perline.
NOTA: Il DNA è legato alle perline. - Togliere i tubi dal rack magnetico e aggiungere 900 l of wash buffer 1. Vorticare i tubi per risospendere completamente le perline e poi girare brevemente verso il basso i tubi.
- Riportare i tubi al rack magnetico e incubare per 3 min.
- Con i campioni ancora sul rack magnetico, rimuovere il supernatante senza disturbare le perline.
- Ripetere i lavaggi (4.1.7-4.1.9), una volta con il buffer di lavaggio 1, quindi due volte con il buffer di lavaggio 2.
- Dopo aver rimosso il supernatante, ruotare brevemente verso il basso i tubi e tornare al rack magnetico per 3 min.
- Rimuovere tutto il buffer di lavaggio residuo 2 e rimuovere i tubi dal rack magnetico.
- Asciugare le perline con i coperchi del tubo aperti a 65 gradi centigradi per 15 min.
- Aggiungere 60 l di tampone di eluizione ad ogni tubo e incubare a RT per 7 min a 1.400 rpm. In alternativa, il vortice a velocità moderata utilizzando un adattatore in schiuma.
- Ruotare brevemente i tubi e posizionarli sul rack magnetico per 2 min.
- Trasferire 55 -L di eluate in un nuovo tubo senza disturbare le perline. L'eluato contiene il DNA convertito bisulfite. Non è richiesta la misurazione della concentrazione del DNA.
- Configurare ed eseguire qPCR
- Accendere la macchina qPCR e il computer che gestisce il suo software.
- Nell'interfaccia utente del software creare un nuovo esperimento e selezionare il blocco da utilizzare per eseguire l'esperimento.
- Selezionare Curva standard come tipo di esperimento.
- Se applicabile, selezionare la chimica di rilevamento che si desidera utilizzare. Questo test utilizza i reagenti TaqMan. In caso contrario, selezionare ROX come riferimento passivo.
- Se applicabile, selezionare le proprietà dello strumento con cui è standard.
- Definisci il tuo progetto sperimentale assegnando obiettivi (ad esempio, GAPDH o CD8 con FAM come reporter) e un quencher non fluorescente.
- Assegnare nomi di esempio per gli standard, gli esempi e i controlli.
- Successivamente, assegnare ogni posizione del pozzo in base alla piastra qPCR. Ogni pozzo richiede un obiettivo, ad esempio CD8 o GAPDH, e un nome di esempio. Ogni campione viene eseguito in triplice copia e deve essere riflesso sul layout della piastra per lo strumento.
- Assegnare a ogni standard lo Standard dell'attività E specificare i numeri di copia finali in base alla Tabella 1.
- Assegnare campioni, calibratore e fare riferimento all'attività Sconosciuto.
- Designare i pozzi per nessun controllo del modello come NTC o N.
- Preparare le diluizioni seriali del DNA lambda (10 ng/L) da utilizzare come standard (vedere la tabella 1).
- Preparare i cocktail qPCR master mix, uno per il tipo di cella di destinazione e uno per GAPDH (vedere la tabella 2). Eseguire tutti i campioni, gli standard e il controllo NTC in triplice copia.
NOTA: GAPDH viene utilizzato per quantificare il numero totale di cellule e viene eseguito in parallelo con l'amplificazione di destinazione. Copie di elementi regolatori non metilati per il gene CD8 B sono misurate nel test CD8, FoxP3 a Treg e IL-17 in Th17. - Utilizzare un 96 pozzetto per qPCR. Caricare 3 - L di DNA modello nei pozzi prima. Successivamente, caricare 7 - L del mix master.
- Sigillare la piastra con una pellicola qPCR e ruotare brevemente la piastra prima di posizionarla nello strumento qPCR.
- Eseguire qPCR come illustrato nella tabella 3.
- Al termine dell'esecuzione, esportare i dati qPCR come file .txt o .xlsx.
- Analizzare i dati utilizzando i modelli di analisi per l'analisi CD8 e il saggio Treg (vedere Tabella dei materiali) per calcolare la media Ct, la deviazione standard ct e il numero di copia.
| Numero di copia del plasmide iniziale/3 -L | Volume | DNA diluente [1] | Numero di copia finale per 3 - L | Etichetta |
| 31250 | 1000 lL | - | 31250 | STD 1 (stD) |
| 31250 | 200 l | 800 ll | 6250 | StD 2 (stD) |
| 6250 | 200 l | 800 ll | 1250 | STD 3 |
| 1250 | 200 l | 800 ll | 250 | STD 4 (STD) |
| 250 | 200 l | 800 ll | 50 | StD 5 |
| 1250 | 30 ll | 1200 lL | 30 | STD 6 [2] |
| [1] 10 dna lambda ng/l in TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) | ||||
| [2] Utilizzare STD 3 per preparare STD | ||||
Tabella 1: Preparazione delle diluizioni standard. Secondo la tabella, che usa TE/lambda DNA come diluente, sono stati preparati standard di diluizione di 4 log che coprono 31250-30 copie. Le stesse diluizioni standard sono state utilizzate sia per CD8 che per GAPDH. Gli standard sono stati immagazzinati a -20 gradi centigradi.
| Reagenti | Quantità |
| DNA lambda (50 ng/L in TE, pH8.0) | 1 ll |
| Test di apalto di TaqMan | 0,5 l l |
| Acqua senza nucle | 0,5 l l |
| Master Mix | 5 ll |
| Totale | 7 l'uomo |
Tabella 2: Preparazione del cocktail qPCR. Preparare il master mix qPCR in due tubi separati, uno per CD8 e GAPDH, escludendo il DNA del modello secondo la tabella.
| Passo | Tempo | Temp | Cicli |
| Pre-incubazione | 35 min | 95 gradi centigradi | 1X |
| Amplificazione | 15 sec | 95 gradi centigradi | 50X (in questo stato del minì |
| 1 min | 61gradi centigradi | ||
| Ricarica | 5 sec | 42oC | 1X |
Tabella 3: qPCR esegue i parametri per il test CD8 e Treg. Il qPCR è stato eseguito in base ai parametri specificati nella tabella.
5. Th17 assay
- Purificazione del DNA dopo la conversione bisulfite
- Eseguire i passaggi di purificazione come descritto nella sezione 4.1.
- Per eluire i campioni, aggiungere 25 l di tampone di eluizione a ciascun tubo e incubare a RT per 7 min a 1.400 giri/m. In alternativa, il vortice a velocità moderata utilizzando un adattatore in schiuma.
- Ruotare brevemente i tubi e posizionarli su un rack magnetico per 2 min.
- Trasferire 20 l di eluate in un nuovo tubo senza disturbare le perline. L'eluato contiene il DNA convertito bisulfite.
- Preamplificazione del DNA
NOTA: la preamplificazione del DNA è consigliata per i bersagli a bassa abbondanza per una quantificazione accurata tramite qPCR19. Il saggio di metilazione Th17 è stato progettato per richiedere la preamplificazione per questo motivo.- Trasferire 2 -L di DNA convertito bisulfite nei tubi a strisce PCR. Creare un tubo NTC con 2 o più l'acqua.
- Create la combinazione di master di preamplificazione per tutti i campioni (vedere la tabella 4).
- Aggiungere 23 -L del mix master ad ogni tubo. Far rotolare i tubi, vortice, e ruotare brevemente verso il basso i tubi.
- Eseguire il protocollo di preamplificazione su un termociclore utilizzando un coperchio riscaldato. (Tabella 5). Una volta completata la corsa, ruotare brevemente verso il basso i tubi.
- Trasferire 2 - L del DNA amplificato su nuovi tubi e aggiungere 78 l di acqua, diluindo i campioni 1:40.
- qPCR configurare ed eseguire
- Seguire la sezione 4.2 per configurare ed eseguire il qPCR.
- Analizzare i dati utilizzando il modello di analisi per l'analisi Th17 (vedere Tabella dei materiali) per calcolare la media Ct, la deviazione standard Ct e il numero di copia.
| Reagente | Quantità |
| Acqua senza nucle | 9,5 l l |
| Hot Start PCR Master Mix | 12,5 ll |
| Th17 PCR Primer | 1 ll |
| Totale | 23 ll |
Tabella 4: Amplificare il DNA per il saggio Th17. Il master mix di reazione pre-amplificazione è stato preparato secondo la tabella.
| Passo | Tempo | Temp | Cicli |
| Pre-incubazione | 35 min | 95 gradi centigradi | 1X |
| Denaturazione | 1 min | 95 gradi centigradi | 12X (in modo |
| Ricottura | 45 sec | 55gradi centigradi | |
| Allungamento | 30 sec | 72 gradi centigradi | |
| Allungamento finale | 10 min | 72 gradi centigradi | 1X |
| Tenere | Indefinito | 4 gradi centigradi |
Tabella 5: Preamplificatore Th17 DNA. Il DNA Th17 è stato pre-amplificato per 12 cicli prima del qPCR effettivo.
Representative Results
Tutti e tre i saggi di metilazione iniziano con un input di gDNA e generano una percentuale di cellule T CD8, Treg o Th17 all'interno dell'intera popolazione cellulare. I dati generati dal qPCR dopo la conversione bisulfite sono stati analizzati utilizzando il modello di analisi fornito. Questo modello ha utilizzato le curve standard ottenute dai campioni standard per stimare il numero di copie degli obiettivi e il numero totale di celle nei campioni di prova. Il tipo di cella percentuale è stato quindi calcolato utilizzando le formule integrate nei modelli di analisi. La figura 1 mostra i dati rappresentativi dell'analisi del CD8, ottenuti analizzando sia le cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) che le cellule T di tre diversi donatori che utilizzano sia la citometria del flusso che il test di metilazione descritto. Le tendenze tra i due metodi in tutti i donatori in entrambi i tipi di cellule erano simili. Figura 2 mostra i dati rappresentativi dal saggio Treg. Tre donatori Treg purificati sono stati analizzati utilizzando sia qPCR basata sulla metilazione che citometria di flusso e i risultati sono stati tracciati sul grafico mostrato. I risultati per entrambi i metodi sono stati relativamente simili. Tuttavia, in tutti i casi la citometria di flusso ha prodotto valori più elevati. La figura 3 mostra il confronto delle cellule Th17 rilevate tramite citometria di flusso e metilazione. In questo grafico, ci sono condizioni stimolate e non stimolate per i metodi sperimentali. Le cellule richiedono stimolazione con PMA e ionomycina e trattamento con un inibitore del trasporto di proteine per aumentare la quantità di IL-17A presente all'interno di ogni cellula in modo che possa essere rilevato tramite citometria di flusso20. Lo stato di metilazione può essere rilevato indipendentemente dallo stato di stimolazione. La citometria di flusso ha prodotto livelli più bassi di cellule Th17 rispetto alla metilazione. La sensibilità e la specificità dell'analisi sono state dimostrate dal limite di valori LOB (blank), limit of detection (LOD) e limit of quantitation (LOQ) riportati nella tabella 6.
Figura 1: confronto tra flusso e metilazione delle percentuali di CD8 per le cellule PBMC e T per tre diversi donatori. I PBMC e le cellule T di tre diversi donatori sono stati tesi per la percentuale di cellule T CD8 in tutta la popolazione che utilizzano citometria di flusso o metilazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Confronto tra flusso e metilazione delle percentuali di Treg per Treg purificato per tre diversi donatori. Le cellule di Treg purificate sono state puntuate per la percentuale di cellule di Treg nell'intera popolazione usando citometria di flusso o metilazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Confronto tra flusso e metilazione delle percentuali di Th17 per i gruppi sperimentali stimolati e non stimolati. Le cellule T stimolate e non stimolate sono state analizzate usando sia la citometria del flusso che la metilazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Analisi | Lob | Lod | LoQ |
| CD8 (in questo caso) | 0 | 19 | 52 |
| Gapdh | 0 | 7 | 21 |
| FoxP3 | 0 | 3 | 12 |
| Th17 TpG | 0 | 35 | 73 |
| Th17 CpG | 0 | 38 | 73 |
Tabella 6: LoB, LoD, LoQ dei numeri di copia per i saggi basati sulla metilazione. Sensibilità e specificità del saggio è dettagliato dai valori LoB, LoD e LoQ ottenuti dalle linee guida MIQE21,22. In generale, fino a 40 copie possono essere rilevate con precisione da questi saggi.
Discussion
Con l'avvento di nuove immunoterapie, vi è la necessità di metodi standardizzati per rilevare l'identità e la purezza delle cellule immunitarie. I metodi di valutazione per i test in-process e di rilascio che sono robusti, convalidati e scalabili rimangono da stabilire e rappresentano una grande sfida per la commercializzazione delle terapie basate sulle cellule. Mentre la citometria del flusso è attualmente il metodo più comune per la fenotipizzazione delle cellule immunitarie, l'elevata qualità del campione e i requisiti di quantità rendono difficile l'uso regolare. Inoltre, l'implementazione della citometria di flusso in un ambiente di buone pratiche di produzione (GMP) è limitata dalle strategie di gating dipendenti dall'operatore e dal requisito degli standard di riferimento per ogni marcatore utilizzato13,14. Anche se il gating automatizzato ha dimostrato di migliorare la robustezza di analisi, non è ancora una strategia di controllo della qualità consolidata. Mentre la profilazione dell'espressione genica può anche essere utilizzata per caratterizzare l'identità e la purezza del prodotto di terapia cellulare, i dati sono semiquantitativi e laboriosi. Inoltre, l'RNA e il microRNA sono relativamente meno stabili del DNA e possono contribuire alla mancanza di risultati robusti e riproducibili. Pertanto, l'utilizzo dello stato di metilazione del DNA epigenetico di un locus specifico fornisce un metodo stabile, facile da eseguire, robusto e scalabile per identificare e quantificare un tipo di cellula di interesse.
Il rilevamento di modelli di metilazione nelle cellule fenotipiche si basa su tre fasi critiche: in primo luogo, il saggio richiede l'uso di gDNA, che è isolato secondo i metodi descritti. È necessario il DNA di alta qualità e, se non utilizzato, la conversione bisulfita può essereinfluenzata 23,24. Se si ottiene DNA di bassa qualità, si raccomanda un'ulteriore purificazione per garantire l'affidabilità del saggio. In secondo luogo, è necessaria la conversione bisulfita di successo della citosina non metilata in uracil. Il passo più critico nella conversione bisulfita è la denaturazione del DNA23,25. La denaturazione ad alta temperatura con l'ammoniaca bisulfite, al contrario del bisulfite di sodio, aumenta l'efficienza e la consistenza della conversione ed è il processo raccomandato per questi saggi25,26. Gli utenti devono assicurarsi che la reazione si verifichi a 80 gradi centigradi e che la miscelazione del campione venga eseguita frequentemente. Per questi motivi, si consiglia un termomixer digitale (vedere Tabella dei materiali). In terzo luogo, la tecnica di pipettaggio corretta deve essere seguita durante la preparazione qPCR. Durante la reazione qPCR sono necessarie tre repliche tecniche per aderire alle informazioni minime per la pubblicazione delle linee guida MIQE (Quantitative Real-Time PCR experiments)27. L'inclusione di repliche più tecniche è accettabile ma non necessaria. La tecnica di pipettaggio impropria e/o non includendo repliche tecniche porterà a risultati qPCR inaffidabili.
Se i passaggi critici vengono seguiti e i risultati desiderati non vengono ancora ottenuti, è possibile utilizzare più controlli all'interno dell'analisi per individuare il problema. Una corretta conversione bisulfita è il passo più cruciale in questo saggio. La conversione bisulfita non corretta potrebbe essere evidenziata da un fattore di calibrazione non riuscito e/o dai valori di riferimento calcolati dal modello di analisi. Se la conversione bisulfite è stata eseguita in modo non corretto (ad esempio, se la reazione è stata effettuata a RT), non ci sarebbe alcuna amplificazione durante qPCR. Inoltre, non si vedrebbe alcun errore se si verificasse un errore durante la preparazione della reazione qPCR (ad esempio, se il master mix qPCR non fosse stato aggiunto). Questi due problemi possono essere separati esaminando i campioni standard. L'amplificazione nei campioni standard, ma non il riferimento, il calibratore e i campioni sperimentali, indicherebbe che la conversione bisulfite non è stata eseguita correttamente. Nessuna amplificazione in nessuno dei campioni indicherebbe che il qPCR non è stato eseguito correttamente.
Mentre questo analisi affronta il rigoroso requisito del campione e la variabilità dell'analisi associata ad altri metodi di fenotipizzazione, in particolare la citometria di flusso, ci sono limitazioni che devono essere notate. Questo saggio è destinato a un singolo locus utilizzato come identificatore univoco per la cella di destinazione, che proibisce l'analisi multiplexed comunemente eseguita con citometria di flusso. Questo rende difficile identificare tipi di cellule complesse come Th17. Tuttavia, l'uso di modelli di metilazione in un singolo locus ha dimostrato di essere un marcatore fenotipipico accurato di più cellule ed è stato utilizzato in più studi clinici15,16. Ciò è vero soprattutto in Tregs, dove la valutazione delle firme di metilazione FOXP3 è un metodo accurato e inequivocabile per rilevare i veri Treg dalle cellule di espressione transitoria di FOXP328. La perdita dell'analisi multiplex è compensata dalla precisione dei loci interrogati. Le iterazioni future del saggio potrebbero includere più coloranti qPCR e quenchers per consentire il rilevamento di loci multipli in una reazione qPCR.
Questo test può essere utilizzato come metodo alternativo per la citometria di flusso nel determinare il fenotipo e l'identità delle cellule. Va notato che questo saggio non produce i valori esatti che la citometria del flusso fa(Figura 1-3). Ciò è dovuto in parte alla variabilità dell'analisi dei dati associata alla citometria di flusso. A seconda della strategia di gating, i risultati della citometria di flusso possono variare in modo significativo. Ciò è particolarmente vero quando si utilizzano protocolli di colorazione complessi per esaminare obiettivi intracellulari, come IL-17, dove il coefficiente di variazione (CV) può essere alto come 15%14. Tra più utenti, il saggio presentato aveva costantemente un CV di <15%, che supportava la robustezza dell'analisi e migliori capacità di standardizzazione. Le maggiori differenze tra la fenotipizzazione epigenetica e quella a flusso si osserva quando è richiesta la stimolazione cellulare (Figura 3). La rilevazione delle cellule Th17 tramite citometria di flusso è stata effettuata utilizzando un protocollo comune per la stimolazione delle cellule T e la colorazione citochina intracellulare29,30,31. Le differenze osservate nella fenotipizzazione Th17 tra la misurazione epigenetica e la citometria di flusso potrebbero essere dovute alla cinetica della produzione di IL-17. Mentre le firme di metilazione sono costanti, la produzione di proteine richiede tempo e deve essere presente in quantità sufficienti per essere rilevata dagli anticorpi fluorescenti20,32. L'incubazione di 6 h con inibitore del trasporto proteico e cocktail di stimolazione cellulare potrebbe essere necessario estendere per vedere il livello di cellule Th17 rilevato tramite metodi di fenotipizzazione a base epigenetica. Sono necessari ulteriori studi per determinare il motivo preciso per cui i valori non corrispondono e determinare il metodo di fenotipizzazione più accurato.
In questa relazione, in dettaglio come identificare e quantificare i tipi di cellule immunitarie in una miscela eterogenea di cellule in modo semplice e robusto. I test sono progettati e ottimizzati per un potenziale utilizzo per test in-process e rilascio di terapie basate sulle cellule. I saggi descritti soddisfano il requisito per le materie prime altamente qualificate da utilizzare nelle applicazioni di terapia cellulare. Affrontando le carenze della citometria di flusso e di altri metodi molecolari come stabilità, requisiti di campionamento, stimolazione preventiva, permeabilizzazione cellulare per la colorazione intracellulare e soggettività dell'analisi dei dati, i saggi descritti sono in linea con l'obiettivo della commercializzazione di terapie basate sulle cellule.
Disclosures
Suman K. Pradhan, Jerry Guzman, Carl Dargitz, Mark Landon e Uma Lakshmipathy sono impiegati da Thermo Fisher Scientific. Sven Olek, Bjoern Samans e Ulrich Hoffmueller sono rispettivamente fondatori e dipendenti della società Epiontis. Nessuna assistenza di scrittura è stata utilizzata nella produzione di questo manoscritto.
Acknowledgments
Il progetto è stato finanziato dalla sovvenzione intramurale scientifica Thermo Fisher.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0 ml Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 22363344 | |
| Analysis template for CD8 assay | Click Here | ||
| Analysis template for Th17 assay | Click Here | ||
| Analysis template for Treg assay | Click Here | ||
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer, blue/red/violet6/yellow | Thermo Fisher Scientific | A29004 | |
| CTS PureQuant CD8+ T-Cell Assay | Thermo Fisher Scientific | A43674 | |
| CTS PureQuant Th17 Assay | Thermo Fisher Scientific | A43676 | |
| CTS PureQuant Treg Assay | Thermo Fisher Scientific | A43675 | |
| Dynabeads SILANE Genomic DNA Kit | Thermo Fisher Scientific | 37012D | Used for genomic DNA isolation and purification after bisulfite conversion. Contains elution buffer to dilute samples. |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Used as a magnetic rack during DNA isolation and purification |
| eBioscience Essential Human T cell Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42923 | |
| eBioscience Essential Human Th1/Th17 Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42927 | |
| eBioscience Essential Human Treg Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42925 | |
| Eppendorf SmartBlock 2 mL | Eppendorf | 5362000035 | |
| Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | Recommended sample mixer |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND 1000 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Applied Biosystems | AM12450 | |
| QuantStudio 12S Flex | Applied Biosystems | 4470661 | |
| TE, pH 8.0, RNase-free | Thermo Fisher Scientific | AM9849 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | H2KT17113 |
References
- Hartmann, J., Schüßler-Lenz, M., Bondanza, A., Buchholz, C. J. Clinical development of CAR T cells-challenges and opportunities in translating innovative treatment concepts. EMBO Molecular Medicine. 9, 1183-1197 (2017).
- Graham, C., Jozwik, A., Pepper, A., Benjamin, R. Allogeneic CAR-T Cells: More than Ease of Access? Cells. 7, E155 (2018).
- Turtle, C. J., et al. CD19 CAR-T cells of defined CD4+:CD8+ composition in adult B cell ALL patients. Journal of Clinical Investigation. 126, 2123-2138 (2016).
- Akalin, I., et al. Effects of Chimeric Antigen Receptor (CAR) Expression on Regulatory T Cells. Molecular Therapy. 17, S25 (2009).
- Knochelmann, H. M., et al. CAR T Cells in Solid Tumors: Blueprints for Building Effective Therapies. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Chen, M. L., et al. Regulatory T cells suppress tumor-specific CD8 T cell cytotoxicity through TGF-β signals in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102, 419-424 (2005).
- Muranski, P., et al. Tumor-specific Th17-polarized cells eradicate large established melanoma. Blood. 112, 362-373 (2008).
- Majchrzak, K., et al. Exploiting IL-17-producing CD4+ and CD8+ T cells to improve cancer immunotherapy in the clinic. Cancer Immunology, Immunotherapy. 65, 247-259 (2016).
- Guedan, S., et al. ICOS-based chimeric antigen receptors program bipolar TH17/TH1 cells. Blood. 124, 1070-1080 (2014).
- Vicetti Miguel, R. D., Maryak, S. A., Cherpes, T. L. Brefeldin A, but not monensin, enables flow cytometric detection of interleukin-4 within peripheral T cells responding to ex vivo stimulation with Chlamydia trachomatis. Journal of Immunological Methods. 384, 191-195 (2012).
- Lovelace, P., Maecker, H. T. Multiparameter Intracellular Cytokine Staining. Methods in Molecular Biology. 699, 165-178 (2011).
- Presicce, P., Moreno-Fernandez, M. E., Lages, C. S., Orsborn, K. I., Chougnet, C. A. Association of two clones allows for optimal detection of human FOXP3. Cytometry A. 77, 571-579 (2010).
- Pachón, G., Caragol, I., Petriz, J. Subjectivity and flow cytometric variability. Nature Reviews Immunology. 12, 396 (2012).
- Westera, L., et al. Centrally Determined Standardization of Flow Cytometry Methods Reduces Interlaboratory Variation in a Prospective Multicenter Study. Clinical and Translational Gastroenterology. 8, e126 (2017).
- Baron, U., et al. Epigenetic immune cell counting in human blood samples for immunodiagnostics. Science Translational Medicine. 10, (2018).
- Kleen, T. O., Yuan, J. Quantitative real-time PCR assisted cell counting (qPACC) for epigenetic - based immune cell quantification in blood and tissue. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 46 (2015).
- Rapko, S., et al. DNA methylation analysis as novel tool for quality control in regenerative medicine. Tissue Engineering. 13, 2271-2280 (2007).
- Wieczorek, G., et al. Quantitative DNA Methylation Analysis of FOXP3 as a New Method for Counting Regulatory T Cells in Peripheral Blood and Solid Tissue. Cancer Research. 69, 599-608 (2009).
- Andersson, D., et al. Properties of targeted preamplification in DNA and cDNA quantification. Expert Review of Molecular Diagnosis. 15, 1085-1100 (2015).
- Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 159, 197-207 (1993).
- Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of Blank, Limit of Detection and Limit of Quantitation. Clinical Biochemistry Reviews. 29, S49-S52 (2008).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55, 611-622 (2009).
- Li, Y., Tollefsbol, T. O. DNA methylation detection: Bisulfite genomic sequencing analysis. Methods in Molecular Biology. 791, 11-21 (2011).
- Warnecke, P. M., et al. Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing. Methods. 27, 101-107 (2002).
- Genereux, D. P., Johnson, W. C., Burden, A. F., Stöger, R., Laird, C. D. Errors in the bisulfite conversion of DNA: modulating inappropriate- and failed-conversion frequencies. Nucleic Acids Research. 36, e150 (2008).
- Darst, R. P., Pardo, C. E., Ai, L., Brown, K. D., Kladde, M. P. Bisulfite Sequencing of DNA. Current Protocols in Molecular Biology. 91, 7.9.1-7.9.7 (2010).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50, S1-S5 (2010).
- Baron, U., et al. DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. European Journal of Immunology. 37, 2378-2389 (2007).
- Yao, Z., et al. Human IL-17: a novel cytokine derived from T cells. Journal of Immunology. 155, 5483-5486 (1995).
- Lockhart, E., Green, A. M., Flynn, J. L. IL-17 production is dominated by gammadelta T cells rather than CD4 T cells during Mycobacterium tuberculosis infection. Journal of Immunology. 177, 4662-4669 (2006).
- Liang, S. C., et al. Interleukin (IL)-22 and IL-17 are coexpressed by Th17 cells and cooperatively enhance expression of antimicrobial peptides. Journal of Experimental Medicine. 203, 2271-2279 (2006).
- Olsen, I., Sollid, L. M. Pitfalls in determining the cytokine profile of human T cells. Journal of Immunological Methods. 390, 106-112 (2013).
