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Cancer Research

माउस ब्लैडर ट्यूमर ऑर्गेनॉइड की संस्कृति, हेरफेर और ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण

Published: January 31, 2020 doi: 10.3791/60469
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Department of Life Sciences, Pohang University of Science and Technology
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल कार्सिनोजन-प्रेरित मूत्राशय के कैंसर से प्राप्त मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनॉइड की त्रि-आयामी इन विट्रो संस्कृति स्थापित करने के लिए विस्तृत प्रयोगात्मक कदम प्रदान करता है। ट्यूमर ऑर्गेनॉइड के पासिंग, जेनेटिक इंजीनियरिंग और ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण सहित संस्कृति विधियों का वर्णन किया गया है।

Abstract

उन्नत ट्यूमर मॉडल के विकास को लंबे समय से प्रोत्साहित किया गया है क्योंकि वर्तमान कैंसर मॉडलों ने तीन आयामी (3 डी) ट्यूमर वास्तुकला की कमी और मानव कैंसर के लिए कम प्रासंगिकता जैसी सीमाएं दिखाई हैं। शोधकर्ताओं ने हाल ही में एक 3डी इन विट्रो कैंसर मॉडल विकसित किया है जिसे ट्यूमर ऑर्गेनॉइड के रूप में संदर्भित किया गया है जो संस्कृति पकवान में देशी ट्यूमर की विशेषताओं की नकल कर सकता है । यहां, प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को एक कैंसरजन-प्रेरित मूत्रमूत्र ट्यूमर से मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनॉइड की स्थापना के लिए विस्तार से वर्णित किया गया है, जिसमें संस्कृति, मार्ग और विट्रो में परिणामस्वरूप 3डी ट्यूमर ऑर्गेनॉइड के रखरखाव शामिल हैं। इसके अलावा, लेंटिवायरस-मध्यस्थता ट्रांसड्यूक्शन का उपयोग करके जेनेटिक इंजीनियरिंग के लिए स्थापित मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनॉइड लाइनों में हेरफेर करने के लिए प्रोटोकॉल वर्णित हैं, जिसमें ट्यूमर में नए आनुवंशिक तत्वों की कुशल शुरूआत के लिए अनुकूलित स्थितियां शामिल हैं ऑर्गेनोइड। अंत में, आगे के विश्लेषण के लिए मूत्राशय मूत्राशय की दीवार में मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनॉइड के ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण की प्रक्रिया रखी जाती है। इस लेख में वर्णित विधियां बेहतर चिकित्सीय विकल्पों के विकास के लिए मूत्राशय के कैंसर के लिए इन विट्रो मॉडल की स्थापना की सुविधा प्रदान कर सकती हैं।

Introduction

मूत्राशय कैंसर सबसे प्रचलित मूत्र पथ कैंसर है, लगभग १६५,००० रोगियों को सालाना मरने के साथ1। मूत्राशय के कैंसर के विभिन्न प्रकारों में, मांसपेशियों-आक्रामक यूरोथेलियल कार्सिनोमा एक आक्रामक फेनोटाइप प्रदर्शित करता है, और इसकी 5 वर्ष जीवित रहने की दर 50%2से कम है। पिछले कुछ दशकों में आक्रामक यूरोथेलियल ट्यूमर के लिए उपन्यास चिकित्सीय विकल्पों का विस्तार नहीं किया गयाहै।

कैंसर सेल लाइनों बड़े पैमाने पर दवा स्क्रीनिंग3के लिए इस्तेमाल किया गया है । हालांकि अनुकूल परिणाम कैंसर सेल लाइनों में कई दवा उंमीदवारों में देखा गया है, खराब परिणाम नैदानिक परीक्षणों में सूचित कर रहे है4। इन विट्रो दो आयामी (2 डी) संस्कृति वातावरण के लिए अनुकूलन में वृद्धि के बाद, सेल लाइनों में देशी ट्यूमर को फिर से दोहराना तेजी से मुश्किल हो गया है। पशु कैंसर मॉडल या रोगी से व्युत्पन्न ट्यूमर विद्वेष मूत्राशय कैंसर सेल लाइनों में मनाया सीमाओं को संबोधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, पशु कैंसर मॉडल समय और संसाधन गहन हैं । इसलिए, बेहतर रोग मॉडल वर्षों से मांग पर हैं और मौजूदामॉडल5की कमियों को दूर करने के लिए एक उपन्यास मॉडल प्रणाली, ऑर्गेनॉइड विकसित किया गया है ।

एक ऑर्गेनोइड एक बहुकोशिकीय 3 डी निर्माण है जो वीवो अंग में इसके अनुरूप की शारीरिक विशेषताओं को विट्रो में फिर से पेश कर सकता है। सामान्य और ट्यूमर ऑर्गेनॉइड क्रमशः5,6,प्लीरिटेंट या वयस्क स्टेम कोशिकाओं और प्राथमिक ट्यूमर कोशिकाओं से प्राप्त किए जा सकते हैं। पिछले कई वर्षों में, ट्यूमर ऑर्गेनॉइड को बड़ी संख्या में विविध ट्यूमरऊतकोंसे स्थापित किया गया है, जिसमें पेट8,9,मूत्राशय10,अग्न्याशय11,12,प्रोस्टेट13,जिगर14और स्तन15 ट्यूमर ऊतक शामिल हैं। इस तरह के ट्यूमर ऑर्गेनॉइड अपने मूल ट्यूमर की नकल करते हैं। वीवो ट्यूमर ऊतकों और उनके कई व्यावहारिक अनुप्रयोगों में उनकी समानता के कारण, शोधकर्ताओं ने उन्हें कैंसर रोग के अध्ययन में उपन्यास रोग मॉडल के रूप में अपनाया है।

यहां, एक कैंसरजन प्रेरित मूत्र आक्रामक मूत्रसे ट्यूमर ऑर्गेनॉइड की स्थापना के लिए प्रक्रियाओं को बाहर रखा जाता है । एन-ब्यूटिल-एन-(4-हाइड्रोक्सीब्यूटिल) नाइट्रोसामाइन (बीबीएन) का उपयोग चूहों17 में आक्रामक यूरोथेलियाल कार्सिनोमा को प्रेरित करने के लिए कार्सिनोजन के रूप में किया जाता है और ट्यूमर ऑर्गेनॉइड, जो माउस मांसपेशियों-आक्रामक मूत्राशय ट्यूमर की रोगविशेषताओं का प्रदर्शन करते हैं, बीबीएन-प्रेरित मूत्रमूत्र कैंसर16से स्थापित किए जाते हैं। ट्यूमर ऑर्गेनॉइड में आनुवंशिक रूप से हेरफेर करने की विधि मूत्राशय के कैंसर के विकास के आणविक आधार का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली विकसित करने के लिए लेंटिवायरस-मध्यस्थता ट्रांसड्यूक्शन का उपयोग करके सचित्र है। इसके अलावा, मूत्राशय के कैंसर में देशी मूत्राशय के वातावरण की भूमिका की जांच करने के लिए ऑर्गेनोइड ऑर्थोटोटोपरिक रूप से मूत्राशय में प्रत्यारोपण के लिए एक विधि वर्णित है।

Protocol

सभी प्रक्रियाओं को मंजूरी दी गई और पीओएसटेक (आईएसीयूसी नंबर: POSTECH-2019-0055) में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के दिशा निर्देशों के तहत आयोजित किया गया ।

1. मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनॉइड की विट्रो संस्कृति में

  1. मूत्राशय मूत्राशय ट्यूमर से मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गोनोइड स्थापित करें (चित्रा 1एक).
    नोट: ब्बीएन-प्रेरित माउस मूत्राशय ट्यूमर पैदा करने की प्रक्रिया शिन एट अल में उल्लिखित है।17.
    1. 6 महीने के लिए माउस विज्ञापन लिबिटम के लिए एक अंधेरे बोतल में 0.1% बीबीएन युक्त पानी प्रदान करें। एक सप्ताह में बीबीएन युक्त पानी 2x बदलें।
      नोट: 8-10 सप्ताह की उम्र में लगभग 25 ग्राम के शरीर के वजन के साथ एक C57BL/6 पुरुष माउस का उपयोग किया गया था। बीबीएन युक्त पानी को एक ही पिंजरे में पांच चूहों तक प्रशासित किया जा सकता है।
    2. 6 महीने के बाद, कार्बन डाइऑक्साइड साँस लेना का उपयोग कर माउस इच्छामृत्यु और पूरे मूत्राशय ट्यूमर को अलग। इसे 90 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
    3. बाँझ सर्जिकल कैंची का उपयोग कर गैर कैंसर भागों और परिगलित क्षेत्रों को हटा दें और मूत्राशय ट्यूमर के टुकड़े 2-3 बार ठंड 1x Dulbecco के फॉस्फेट-बफर खारा (DPBS) के साथ धोने । टुकड़ों को इकट्ठा करें और उन्हें एक नए 90 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
    4. 10 एमएम 4-(2-हाइड्रोक्सेथिल) के साथ दुल्बेकको के संशोधित न्यूनतम आवश्यक माध्यम (डीएमईएम) का 1 एमएल जोड़ें- 1- पिट्राज़िनेथेनेसल्फोनिक एसिड (एचपीईएस)।
    5. ट्यूमर ऊतक को एक निष्फल रेजर ब्लेड का उपयोग करके जितना संभव हो उतना छोटा (0.5-1 मिमी3)टुकड़ों में कीमा।
    6. 10 एमएम हेप्स, 250 μg/mL कोलेजेनेज टाइप I, 250 μg/mL कोलेजेनेज टाइप II, और 250 यू/एमएल थर्मोलिसिन के साथ डीएमईएम के 9 एमएल जोड़ें। कोशिका निलंबन में टुकड़ों को अलग करने के लिए एक इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)में एक कक्षीय शेखर पर 1.5-2 घंटे के लिए कीमा बनाया हुआ ट्यूमर ऊतक इनक्यूबेट करें। सेल निलंबन को 50 मीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट: यदि माउस से काटे गए ट्यूमर का आकार 1 सेमी3से अधिक है, तो इसे थर्मोलिन की मात्रा के साथ इलाज करें या ऊष्मायन समय बढ़ाएं।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 400 x ग्राम पर ट्यूब को अपकेंद्रित्र करें और सुपरनेटेंट को एस्पिरेट करें।
    8. किसी भी लाल रक्त कोशिकाओं को ले जाने के लिए अमोनियम-क्लोराइड-पोटेशियम (ACK) के 5 एमएल का उपयोग करके पैलेट को फिर से निलंबित करें। लाल रक्त कोशिकाओं की पूरी तरह से लिसिस तक कमरे के तापमान (आरटी) पर 3-5 न्यूनतम के लिए ट्यूब को इनक्यूबेट करें।
      नोट: यदि लाल रक्त कोशिकाओं को नहीं देखा जाता है, तो लाइसेटिंग प्रक्रिया को छोड़ दें।
    9. ट्यूब में DMEM के 20 mL जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 400 x ग्राम पर ट्यूब को अपकेंद्रित्र करें और सुपरनेटेंट को एस्पिरेट करें।
    10. एक कोशिकाओं में गोली को अलग करने के लिए 0.25% ट्राइप्सिन-ईडीटीए और 10 माइक्रोएम वाई-27632 डाइहाइड्रोक्लोराइड (वाई-27632) के 1 एमएल के साथ गोली को फिर से निलंबित करें। 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 5 मिन के लिए ट्यूब को इनक्यूबेट करें।
      नोट: एक माइक्रोस्कोप के नीचे ट्यूमर का निरीक्षण करने के लिए एक कोशिकाओं में पूर्ण वियोजन की पुष्टि । यदि कोशिकाओं का हिस्सा जारी रहता है, तो निलंबन को और अधिक पिपेट करें।
    11. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ डीएमईएम के 10 mL का उपयोग करके ट्रिपसिन को बेअसर करें। पचाया मलबे को हटाने के लिए एक नया 50 मीटर ट्यूब पर एक 100 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन फ़िल्टर करें।
    12. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 400 x ग्राम पर ट्यूब को अपकेंद्रित्र करें और सुपरनेटेंट को एस्पिरेट करें।
    13. बर्फ-ठंडे विकास कारक के 150 माइक्रोन का उपयोग करके 24 अच्छी तरह से प्लेट में एक अच्छी तरह से कोट करें तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स(सामग्री की तालिका)को कम कर के 24 अच्छी तरह से प्लेट को 30 मिन के लिए एक इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)में रखें बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स को जमना।
      नोट: गल और उपयोग से पहले जमना को रोकने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स बनाए रखने।
    14. डीएमईएम के 1 mL का उपयोग करके गोली को फिर से निलंबित करें और हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। बर्फ पर 1.5 mL माइक्रोट्यूब में 3-4 x 104 ट्यूमर कोशिकाओं को स्थानांतरित करें।
    15. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर माइक्रोट्यूब को सेंट्रलाइज करें और ध्यान से सुपरनेट को त्याग दें।
    16. पूर्वगरम ऑर्गेनॉइड मीडियम(टेबल 1)और 10 माइक्रोन वाई-27632 के 500 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और उन्हें लेपित कुएं में स्थानांतरित करें। 24 अच्छी प्लेट को इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)में रखें।
    17. अतिरिक्त मूत्राशय ट्यूमर कोशिकाओं को डीएमईएम के 1 मिलील के साथ स्टॉक किया जा सकता है जिसमें 10% एफबीएस, 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 10% डिमेथिल सल्फासऑक्साइड (डीएमएसओ) 1.5 मिलीस क्रायोवियल्स में शामिल हैं। उन्हें क्रायोवियल फ्रीजिंग कंटेनर में रखें और कंटेनर को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्थानांतरित करें। रात भर फ्रीजर में भंडारण के बाद, क्रायोवियल्स को दीर्घकालिक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।
    18. प्रीवार्म्ड ऑर्गेनॉइड मीडियम(चित्रा 1बी)के 500 माइक्रोन का उपयोग करके हर 2 दिन में माध्यम बदलें।
  2. उपसंस्कृति मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनोइड।
    नोट: मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनॉइड के पारित होने की सिफारिश की जाती है जब वे व्यास में 100-150 माइक्रोन तक पहुंचते हैं।
    1. ट्यूमर ऑर्गेनॉइड के साथ 24 वेल प्लेट में ऑर्गेनॉइड मीडियम में कोलेजेनेज/डिसपाके 500 माइक्रोन जोड़ें। तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स और माध्यम के ऊपर और नीचे पिपेट करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिन के लिए इनक्यूबेट और एक 15 मीटर ट्यूब में कोशिकाओं फसल।
      नोट: माइक्रोस्कोप के नीचे तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स से अलग ऑर्गेनॉइड की जांच करें। यदि ऑर्गेनॉइड तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स से अलग नहीं हैं, तो ऊष्मायन समय बढ़ाएं या अधिक बार पिपेट करें।
    2. प्रीवार्म्ड डीएमईएम के 5 मिलील जोड़ें, ट्यूब को 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिन के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित करें, और सुपरनेटेंट को एस्पिरेट करें।
    3. प्रीवार्म्ड 0.25% ट्राइप्सिन-ईडीटीए और 10 माइक्रोन वाई-27632 के 1 मिलील का उपयोग करके गोली को फिर से निलंबित करें। 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 5 मिन के लिए इनक्यूबेट। सख्ती से कोशिकाओं को ऊपर और नीचे पिपेट करें और 10% एफबीएस के साथ डीएमईएम के 5 mL का उपयोग करके ट्राइप्सिन को बेअसर करें।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिन के लिए 400 x ग्राम पर ट्यूब को अपकेंद्रित्र करें और सुपरनेटेंट को एस्पिरेट करें।
    5. प्रीवार्म्ड ऑर्गेनॉइड मीडियम के 1 मिलील का उपयोग करके पैलेट को फिर से निलंबित करें और एकल ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या गिनें।
    6. दोहराएं कदम 1.1.14−1.1.18।

2. लेंटिवायरस-मध्यस्थता ट्रांसड्यूक्शन का उपयोग करके मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनॉइड का आनुवंशिक हेरफेर(चित्रा 2ए)

  1. जीएफपी-व्यक्त करने वाले लेंटिवायरल कणों का उत्पादन करें।
    1. 0 दिन पर, प्लेट एचईसी 293T कोशिकाएं सेल लाइन कल्चर मीडियम में प्रति 10 सेमी सेल कल्चर प्लेट (यानी, 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ डीएमईएम) के घनत्व पर।
    2. पहले दिन, जीएफपी (8 μg), लेंटिवायरल पैकेजिंग प्लाज्मिड (पीसीएमवीआर 8.74 के 10 μg और pMD2.G के 3 μg) वाले ट्रांसफर प्लाज्मिड सहित डीएनए ट्रांसफेक्शन सॉल्यूशन तैयार करें और कम सीरम मीडियम(टेबल ऑफ मैटेरियल) का1 एमएल।
    3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार कुल प्लाज्मिड के प्रति 1 μg ट्रांसफेक्शन रिएजेंट(सामग्री की तालिका)के 3 μL जोड़ें और पाइपिंग द्वारा धीरे से मिलाएं। आरटी में 20 मिन के लिए इनक्यूबेट और 10% एफबीएस के साथ DMEM के 9 mL जोड़ें ।
    4. एचईके 293T कोशिकाओं के साथ सेल संस्कृति प्लेट में संस्कृति माध्यम Aspirate। ध्यान से एचईसी 293T कोशिकाओं पर डीएनए ट्रांसफेक्शन समाधान के 10 मिलील को स्थानांतरित करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल कल्चर इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
    5. तीसरे दिन, ट्रांसफेक्शन दक्षता निर्धारित करने के लिए एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप (488 एनएम पर उत्तेजना और 512 एनएम पर उत्सर्जन) के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें। पूरी सेल आबादी में लगभग 90%-100% कोशिकाओं को जीएफपी व्यक्त करना चाहिए।
    6. अधिष्णक (वायरस युक्त) को एकत्र करें और 0.45 माइक्रोन पोलेथरसल्फोन (पीईएस) फिल्टर के साथ सुपरनेटेंट को छानकर दें।
      नोट: कम प्रोटीन-बाध्यकारी फिल्टर जैसे पीईएस फिल्टर का उपयोग करें।
    7. वायरस को केंद्रित करने के लिए, एक झूल बाल्टी रोटर(सामग्री की तालिका)में 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए एक अल्ट्रासेंटरिफ्यूज में 98,768 x ग्राम पर वायरस अधिरत्न को केंद्रित करें और ध्यान से अतिशयोक्ति को त्याग दें।
    8. कोल्ड ऑर्गनॉइड मीडियम के 2.5 मिलील में पैलेट को फिर से सस्पेंड करें।
    9. दीर्घकालिक भंडारण के लिए, रोयोजेनिक शीशियों में लेंटिवायरल माध्यम के 250 माइक्रोन को उद्धृत करें और तरल नाइट्रोजन का उपयोग करके उन्हें स्नैप-फ्रीज करें। जमे हुए वायरल स्टॉक को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें।
  2. मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनॉइड के लेंटिवायरस-मध्यस्थता ट्रांसड्यूक्शन करें।
    1. दूसरे दिन, ट्यूमर ऑर्गेनॉइड को विभाजित करें जैसा कि लेंटिवायरस-मध्यस्थता ट्रांसड्यूक्शन से पहले ऊपर वर्णित (चरण 1.2) 12 एच।
    2. तीसरे दिन, जल्दी से एक aliquot (चरण २.१.९) एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में वायरस युक्त गल और 10 μM Y-२७६३२ और 8 μg/mL हेक्साडिमेथ्रिन ब्रोमाइड के साथ ऑर्गेनॉइड माध्यम के २५० μL जोड़ें ।
    3. 24 वेल प्लेट में ऑर्गेनॉइड मीडियम को बदलें ट्यूमर ऑर्गेनॉइड के साथ वायरस युक्त मीडियम के 500 माइक्रोन और इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)में 12-16 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. 4 दिन, ताजा ऑर्गेनॉइड माध्यम के 500 माइक्रोन के साथ माध्यम बदलें।
      नोट: 12-16 घंटे के ऊष्मायन के बाद, माध्यम को बदल दिया जाना चाहिए, क्योंकि लेंटिवायरस और हेक्साडिमेथ्रिन ब्रोमाइड युक्त माध्यम साइटोटॉक्सिक है।
    5. 6 दिन, एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप(चित्रा 2बी)के तहत ट्रांसड्यूक्शन के 3 दिन बाद ट्यूमर ऑर्गेनॉइड से जीएफपी सिग्नल की निगरानी करें।
    6. 10 दिन, मार्ग और स्टॉक ऑर्गेनॉइड 7 दिन ट्रांसड्यूक्शन के बाद के रूप में चरण १.२ में वर्णित है, आनुवंशिक रूप से संशोधित ट्यूमर ऑर्गेनॉइड लाइनों को बनाए रखने के लिए ।

3. मूत्राशय ऑर्गेनॉइड का ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण(चित्रा 3ए)

  1. ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण के लिए ब्लैडर ट्यूमर ऑर्गेनॉइड तैयार करें।
    1. प्रत्यारोपण से पहले, 5-7 दिनों के लिए मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनॉइड संस्कृति, जैसा कि ऊपर वर्णित है (चरण 1.2)।
    2. ट्यूमर ऑर्गेनॉइड के साथ 24 वेल प्लेट में ऑर्गेनॉइड मीडियम में कोलेजेनेज/डिसपाके 500 माइक्रोन जोड़ें। तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स और मध्यम ऊपर और नीचे पिपेट। 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिन के लिए इनक्यूबेट और एक 15 मीटर ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा।
    3. प्रीवार्म्ड डीएमईएम के 5 मिलील जोड़ें, ट्यूब को 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिन के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित करें, और सुपरनेटेंट को एस्पिरेट करें।
    4. डीएमईएम के 1 mL के साथ गोली को फिर से निलंबित करें और समाधान को 90 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
    5. एक माइक्रोस्कोप के नीचे, एक p200 माइक्रोपाइपेट का उपयोग करके 10-100 ट्यूमर ऑर्गेनॉइड उठाएं और उन्हें बर्फ पर माइक्रोट्यूब में इकट्ठा करें।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर ट्यूब को अपकेंद्रित करें और ध्यान से सुपरनेटेंट को त्याग दें।
    7. बर्फ पर सेल पैलेट बनाए रखें जब तक चूहों सर्जरी के लिए तैयार हैं।
  2. उपमुकोसल मूत्राशय दीवार प्रत्यारोपण
    नोट: इस प्रक्रिया को फू एट अल18द्वारा प्रकाशित प्रोटोकॉल से संशोधित किया गया है ।
    1. प्रयोग से कम से कम 1 सप्ताह पहले 8 से 10 सप्ताह पुराने पुरुष नग्न माउस (CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl) तैयार करें ताकि इसे एक नए वातावरण में acclimate की अनुमति दी जा सके । सर्जरी से पहले एनरोफ्लोक्सासिन (5 मिलीग्राम/किलो) को चमड़े के नीचे 24 घंटे इंजेक्ट करें।
    2. साबुन और पानी से बेंच की सतह को साफ करें। सर्जिकल प्रक्रिया से पहले सर्जिकल उपकरणों को ऑटोक्लेव करें और बाँझ उपकरणों का उपयोग करके सर्जरी करें।
    3. बर्फ पर 29 जी इंसुलिन सिरिंज, पिपेट टिप्स और बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स रखें। संज्ञाहरण के प्रशासन के सामने कीटोप्रोफेन (5 मिलीग्राम/किलो) को नीचे की ओर प्रशासित करें।
    4. एक प्रेरण कक्ष में 4% आइसोफ्लोरीन के साथ माउस को एनेस्थेटिज़ करें। एक बार सामान्य संज्ञाहरण हासिल होने के बाद, माउस को एक सुपीन स्थिति में रखना और 2% वाष्पीकृत आइसोफ्लोरीन के मुखौटा साँस लेना द्वारा संज्ञाहरण बनाए रखना।
      नोट: यदि एनेस्थेटाइजेशन समय 30 से अधिक है, तो कॉर्नियल सुखाने से बचने के लिए कपास झाड़ू का उपयोग करके दोनों आंखों पर आंखों का मरहम लगाएं।
    5. बाँझ धुंध के साथ पोविडोन-आयोडीन लगाएं और इसे 70% इथेनॉल के साथ मिटा दें। हर बार एक नई धुंध या एक कपास झाड़ू के साथ 3x दोहराएं।
    6. डिस्पोजेबल, बाँझ सर्जिकल पर्दे का उपयोग कर गुदा और शल्य चिकित्सा क्षेत्र को कवर करें।
    7. आवर्धन के लिए एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, बाँझ सर्जिकल कैंची के साथ त्वचा और निचले मिडलाइन पेट की मांसपेशियों की दीवार में एक छोटा ट्रांसवर्स चीरा (1.5 सेमी से छोटा) बनाएं। मूत्राशय को पेट की गुहा से बेनकाब करें और खारे से भरे सूती झाड़ू के साथ इसका समर्थन करें।
      नोट: यदि मूत्राशय मूत्र से भरा हुआ है, तो इसे थोड़ा कम करने के लिए मूत्राशय को धीरे से दबाएं।
    8. ऑर्गेनोइड पेलेट्स (स्टेप 3.1.7) को ऑर्गेनॉइड मीडियम के 80 माइक्रोन में रीसस्पेंड करें जिसमें 50% उच्च एकाग्रता वाले बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स(सामग्री की तालिका)शामिल हैं।
    9. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत 29 जी इंसुलिन सिरिंज का उपयोग कर मूत्राशय गुंबद के पूर्वकाल पहलू में ऑर्गेनॉइड निलंबन इंजेक्ट करें।
    10. एंटीबैक्टीरियल अवशोषक सीवन के साथ पेट की दीवार की भीतरी परत को बंद करें और फिर बाहरी परत को 4-0 नायलॉन सीवन के साथ बंद करें। सर्जिकल साइट को पोविडोन-आयोडीन और 70% इथेनॉल से कीटाणुरहित करें।
    11. माउस को एक अवरक्त विकिरणकर्ता 10-15 मिन के नीचे ठीक होने दें। जब तक यह चेतना और गतिशीलता प्राप्त न हो तब तक माउस की निगरानी करें।
    12. सर्जरी के एक दिन बाद माउस और एनास्टोमोटिक लीकेज की सामान्य स्थिति की जांच करें। केटोप्रोफेन (5 मिलीग्राम/किलो) को एक बार रोजाना 3 दिनों के लिए ऑपरेटिव रूप से प्रशासित करें और 10 दिनों के बाद ऑपरेटिव रूप से रोजाना एक बार एन्रोकेक्सासिन (5 मिलीग्राम/किलो) का इलाज करें ।
    13. जब चीरा साइट चंगा हो गया है (सर्जरी के बाद 10-14 दिन), टांके हटा दें। ट्यूमर ऑर्गेनॉइड इंजेक्शन के बाद 2-3 सप्ताह के लिए माउस मूत्राशय ट्यूमर के विकास की निगरानी करें।
    14. यदि मूत्राशय ट्यूमर के विकास को देखा जाता है, तो कार्बन डाइऑक्साइड साँस लेने का उपयोग करके माउस को इच्छामृत्यु दें, और पूरे मूत्राशय ट्यूमर को फसल दें। इसे कोल्ड डीपीबीएस(चित्रा 3बी)16का उपयोग करके धो लें ।
    15. मूत्राशय ट्यूमर हिस्टोलॉजी का विश्लेषण करने के लिए, हेमेटोक्सिलिन और इओसिन (एच और ई) धुंधला(चित्रा 3बी)16का उपयोग कर ऊतक के पैराफिन-एम्बेडेड अनुभाग को दाग दें।

Representative Results

माउस मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनोइड की विट्रो संस्कृति में
एक ~ 1 सेमी3 BBN प्रेरित ट्यूमर से dissociated ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या कम से कम 4 x 105 कोशिकाओं है। जब कोशिकाओं को शुरू में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, गैर कैंसर कोशिकाओं और मलबे मनाया जा सकता है । उपसंस्कृति जारी रखकर मलबे को धीरे-धीरे पतला किया गया। चित्र 1बी अलग-अलग समय बिंदुओं पर सुसंस्कृत ऑर्गेनॉइड की छवियों को दिखाता है। यदि ट्यूमर कोशिकाएं ट्यूमर ऑर्गेनॉइड नहीं बनाती हैं, तो कोशिकाएं संभावित रूप से विसोशन चरण के दौरान मर जाती हैं। ऐसे मामले में, एंजाइम के साथ ऊष्मायन समय सहित विसोशन प्रक्रियाओं को सेल व्यवहार्यता बढ़ाने के लिए समायोजित करने की आवश्यकता है।

लेंटिवायरस-मध्यस्थता आनुवंशिक हेरफेर का उपयोग करमूत्र ट्यूमर ऑर्गेनॉइड में GFP की अभिव्यक्ति
मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनॉइड ने सफल लेंटिवायरल संक्रमण(चित्रा 2बी)के साथ मजबूत जीएफपी संकेतों का प्रदर्शन किया। एकाग्रता के बाद, वायरस युक्त मीडिया के कुल 250 μL तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पर 3 x 104 एकल ट्यूमर कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए पर्याप्त था, 90% -100% संक्रमण दक्षता बनाए रखने। लेंटिवायरल ट्रांसड्यूक्शन के 3 दिन बाद ब्लैडर ट्यूमर ऑर्गेनॉइड से जीएफपी सिग्नल का पता लगाया जा सकता है। यदि फ्लोरेसेंस सिग्नल कम हैं, तो वायरल संक्रमण की दक्षता संभावित रूप से कम है। यह कम वायरल टिटर जैसे कई कारकों के कारण हो सकता है, और प्रक्रियाओं को तदनुसार समायोजित करने की आवश्यकता है।

मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनॉइड का ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण
बीबीएन-प्रेरित मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनॉइड से प्राप्त एक मूत्राशय ट्यूमर एलोग्राफ्ट चित्रा 3बी16में प्रस्तुत किया जाता है। मूत्राशय ट्यूमर एलोग्राफ्ट को ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण के 3 सप्ताह बाद काटा गया था। प्रत्यारोपित मूत्राशय ट्यूमर के हिटोलॉजी एच और ई धुंधला का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था । ट्यूमर ऑर्गेनॉइड के ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण 2-3 सप्ताह के लिए मूत्राशय ट्यूमर के रूप में विकसित कर सकते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: माउस मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनोइड की इन विट्रो संस्कृति। (A)माउस ब्लैडर ट्यूमर ऑर्गेनॉइड की स्थापना के लिए योजनाबद्ध आरेख। (ख)विभिन्न समय बिंदुओं पर मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनॉइड की संस्कृति के लिए प्रतिनिधि छवियां। माउस मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनॉइड 9 दिनों में स्थापित और सुसंस्कृत थे। स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: लेंटिवायरस-मध्यस्थता आनुवंशिक हेरफेर का उपयोग करमूत्र ट्यूमर ऑर्गेनॉइड में जीएफपी की अभिव्यक्ति। (A)लेंटिवायरल ट्रांसफेक्शन और मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनॉइड के ट्रांसड्यूक्शन का योजनाबद्ध आरेख। (ख)जीएफपी व्यक्त करने वाले मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनॉइड की प्रतिनिधि छवियां। स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनॉइड का ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण। (A)मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनॉइड के आर्थोटोपिक प्रत्यारोपण का योजनाबद्ध आरेख एक नग्न माउस के लिए। (ख)मूत्राशय और एच और ई के प्रतिनिधि छवियों चूहों ऑर्थोटोटोपिक रूप से मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनॉइड के साथ प्रत्यारोपित से वर्गों दाग । बीच पैनलों में बॉक्स्ड क्षेत्रों के बढ़ाया विचार बाएं पैनलों में दिखाए जाते हैं। स्केल बार = 500 माइक्रोन। यह आंकड़ा चित्रा 1-चित्रा पूरक 1, किम एट अल16,क्रिएटिव कॉमन्स एट्रिब्यूशन ४.० इंटरनेशनल पब्लिक लाइसेंस (सीसी बाय ४.०; https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) के तहत प्रकाशित से पुन: पेश किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

माउस ब्लैडर ट्यूमर ऑर्गेनोइड मध्यम
उन्नत डीएमईएम/एफ-12 (बुनियादी माध्यम) 10 एमएम हेप्स (पीएच 7.4)
10 एमएम निकोटिनमाइड 0.5x सीरम-मुक्त पूरक
2 एमएम एल-अलानाइल-एल-ग्लूटामाइन डिपेप्टाइड 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन
1 एमएम एन-एसीटिल-एल-साइस्टीन 50 एनजी/एमएल मॉरिन एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर
1 μm एक 83-01

तालिका 1: मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनॉइड माध्यम की संरचना।

Discussion

यह प्रोटोकॉल कार्सिनोजन-प्रेरित मूत्राशय ट्यूमर से प्राप्त मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनॉइड को संस्कृति और बनाए रखने के लिए प्रायोगिक प्रक्रियाओं का वर्णन करता है।

इस प्रोटोकॉल में, कई प्रयोगात्मक कदम हैं जिनमें प्रक्रियाओं को कुछ समस्या निवारण की आवश्यकता हो सकती है। सबसे पहले, ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या है कि शुरू में वरीयता प्राप्त कर रहे है एक महत्वपूर्ण कारक है क्योंकि संस्कृति में ट्यूमर कोशिकाओं की कम संख्या (<2 x 104 कोशिकाओं) ज्यादातर ट्यूमर कोशिकाओं के बीच बातचीत की कमी के कारण सेल मौत के लिए सीसा । इसके विपरीत, सीडिंग में बहुत अधिक कोशिकाओं (>5 x 104 कोशिकाओं) के साथ शुरुआत करने से अधिक भीड़ वाले ऑर्गेनॉइड हो जाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप प्रत्येक ऑर्गेनॉइड के खराब विकास के साथ संस्कृतियों को संभालने में कठिनाई होती है। यह दृढ़ता से सुझाव दिया जाता है कि प्रयोगात्मक स्थितियों को अनुकूलित करने के लिए शुरुआत में विभिन्न संख्याओं वाली कई प्लेटें स्थापित की जाएं। प्रारंभिक ट्यूमर कोशिकाओं की सही संख्या की पहचान उच्चतम कोशिका व्यवहार्यता प्राप्त करने और सफल मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनॉइड स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, 2 सप्ताह से अधिक की दीर्घकालिक संस्कृति में बिना किसी कमी के, अधिकांश ट्यूमर ऑर्गेनॉइड बढ़ना बंद कर देते हैं, संभावित रूप से ऑर्गेनोइड के केंद्र में पोषक तत्वों की अपर्याप्त आपूर्ति और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में विकास कारक की कमी के कारण। इसलिए, ट्यूमर ऑर्गेनॉइड संस्कृति को बनाए रखने के लिए समय पर ऑर्गेनॉइड को समय पर प्रमाणित करना एक महत्वपूर्ण कदम है।

दूसरा, ट्यूमर ऑर्गेनॉइड के कुशल आनुवंशिक हेरफेर के लिए उच्च-टिटर लेंटिवायरल कणों का उत्पादन महत्वपूर्ण है। वायरस टिटर से संबंधित मुद्दों को परेशान करने के लिए, यह दृढ़ता से सुझाव दिया जाता है कि वायरस टिटर हर बार वायरल ट्रांसड्यूक्शन से पहले निर्धारित किए जाते हैं क्योंकि लेंटिवायरल निर्माण अलग दक्षता के साथ वायरल कणों का उत्पादन करते हैं। यदि ट्यूमर ऑर्गेनॉइड वायरल संक्रमण के बाद कम व्यवहार्यता प्रदर्शित करते हैं, तो यह संभावना है कि वायरल टिटर संभावित रूप से बहुत अधिक हैं। इस मामले में वायरस की कम मात्रा का उपयोग करने का पुरजोर सुझाव दिया गया है। तीसरा, बीबीएन-प्रेरित मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनॉइड के ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण के दौरान, मूत्राशय की दीवार की अखंडता को बनाए रखना महत्वपूर्ण है। यदि इंजेक्शन मूत्राशय की दीवार परत को भेदने से मूत्राशय के लुमेन तक पहुंचता है, तो प्रयोग को समाप्त कर दिया जाना चाहिए और छोड़ दिया जाना चाहिए। यदि संभव हो, तो अल्ट्रासाउंड इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके मूत्राशय ट्यूमर विकास की निगरानी की सिफारिश की जाती है।

वर्तमान तकनीकों की एक सीमा इन ऑर्गेनॉइड में ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट या स्ट्रोमा की अनुपस्थिति है। इस मुद्दे को दूर करने के लिए, यह दृढ़ता से सुझाव दिया जाता है कि ट्यूमर ऑर्गेनॉइड का ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण देशी ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट की नकल करने के लिए वीवो सिस्टम में उपयोग करता है। भविष्य में, ट्यूमर स्ट्रोमा के अन्य घटकों के साथ ट्यूमर ऑर्गेनॉइड से बने 3डी इन विट्रो ऑर्गेनॉइड सिस्टम विकसित करना आवश्यक होगा।

हमारी तकनीक के प्रमुख निहितार्थों में से एक यह है कि, ट्यूमर ऑर्गेनॉइड के ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण में, केवल 10 मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनॉइड मूत्राशय में ट्यूमर के विकास को प्रेरित कर सकते हैं। पारंपरिक ट्यूमर प्रत्यारोपण प्रयोगों की तुलना में जिन्हें 5 x 105-1x 106 एकल मूत्राशय ट्यूमर कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, हमारे तरीके बहुत अधिक कुशल और मजबूत हैं। एक और महत्वपूर्ण अंतर यह है कि ऑर्गेनॉइड को विभिन्न लेंटिवायरल वैक्टर का उपयोग करके विविध रूप से हेरफेर किया जा सकता है, जैसे कि लेंटिवायरल निर्माण जिसमें शॉर्ट-हेयरपिन आरएनए, CRISPR-Cas9 सिस्टम, या रुचि के जीन होते हैं। ये वर्तमान ऑर्गेनॉइड प्रौद्योगिकी को जोड़ने के लिए शक्तिशाली उपकरण होंगे। कुल मिलाकर, यहां प्रस्तुत प्रायोगिक दृष्टिकोण इन विट्रो ट्यूमर मॉडल की स्थापना की सुविधा प्रदान कर सकते हैं जो 2डी मूत्राशय कैंसर कोशिका रेखाओं का उपयोग करने के बजाय मूत्राशय के कैंसर के रोगजनकों की हमारी समझ में सुधार कर सकते हैं।

यह विधि कार्सिनोजन-प्रेरित मूत्राशय ट्यूमर से प्राप्त मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनॉइड स्थापित करने में सक्षम थी। लेख लेंटिवायरस-मध्यस्थता प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का वर्णन प्रदान करता है जिसके माध्यम से आनुवंशिक संशोधनों को पेश किया जाता है और मूत्राशय ट्यूमर ऑर्गेनॉइड में स्थिर रूप से बनाए रखा जाता है। इसके अलावा, ट्यूमर ऑर्गेनॉइड के ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण के लिए एक प्रक्रिया शामिल है। वीवो कैंसर मॉडल में वर्तमान के साथ संयोजन में, यह तकनीक मूत्राशय ट्यूमर के आणविक आधार का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण होगी।

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं ।

Acknowledgments

इस शोध को कोरिया के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन से केएस: एनआरएफ-2017R1A2B4006043 को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, एनआरएफ-2017M3C7A1047875, एनआरएफ-2017R1AAAA10153666, क्रिएटिव इकोनॉमी अग्रणी प्रौद्योगिकी विकास कार्यक्रम (SF317001A), पोस्को (2018Y060) और बीके21 प्लस रिसर्च फेलोशिप।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 µm syringe filter (PES membrane) Millipore SLHP033RS
10 cm culture plate Eppendorf 0030-702-115
90 mm Petri dish SPL 10090
100 µm cell strainer Corning 352360
15 mL conical tube SPL 50015
24-well plate Corning 3526
29 G 1/2 insulin syringe SHINA B299473538
3 mL syringe Norm-ject N7.A03
50 mL conical tube SPL 50050
A8301 Tocris 2939 stock concentration: 25 mM
Absolute ethanol Daejung 4023-2304
Absorbable suture Henry Schein 039010
Advanced DMEM/F-12 Thermo 12634028
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer Thermo A1049201
B-27 Gibco 17504-044 stock concentration: 50X
BBN(N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine) Tokyo Chemical Industry B0938
Blue nylon 5/0-13mm AILEE NB521
C57BL Mouse The Jackson Laboratory 000664
CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl (nude mouse) Charles River 194
Collagenase type I Thermo 17100017 stock concentration: 20 mg/mL
Collagenase type II Thermo 17100015 stock concentration: 20 mg/mL
Collagenase/dispase Sigma 10269638001 stock concentration: 1 mg/mL
Cyrovial Corning 430488
DMEM(Dulbecco's modified minimum essential media) Gibco 11965-118
DMSO(Dimethyl sulfoxide) Sigma D8418
DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline) Welgene LB 001-02
Enrofloxacin (Baytril) Bayer Healthcare DIN: 02169428
FBS(Fetal bovine serum) Millipore ES009B-KC
Glutamax Gibco 35050061 100X
HEK 293T ATCC CRL-11268
HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) Welgene BB001-01
Isoflurane Hana Pharm Co., Ltd.
Ketoprofen (Anafen) Merial DIN: 02150999
Matrigel growth factor reduced (GFR)
Growth Factor
Reduced (GFR)		 Corning 354230 use for organoid culture in plate
Matrigel high concentration (HC) Corning 354248 use for organoid transplantation
1.5 mL microtube Axygen MCT-150-C
LT1 transfection reagent Mirus Bio MIR 2300
murine EGF(epidermal growth factor) Peprotech 315-09 stock concentration: 100 µg/mL
N-acetyl-L-cysteine Sigma A9165 stock concentration: 200 mM
Nicotinamide Sigma N0636 stock concentration: 1M
Opti-MEM Gibco 31985070
pCMV.R 8.74 Addgene 22036 Packaging plasmid
Penicillin/streptomycin Gibco 15140122 100X
pMD2.G Addgene 12259 Envelope plasmid
Polybrene(hexadim ethrine bromide) Sigma H9286 stock concentration: 2 µg/mL
pSiCoR Addgene 11579 Lentiviral plasmid
Razor blade
Saline buffer JW Pharmaceutical
SW41Ti swinging bucket rotor Beckman Coulter
Thermolysin, Bacillus thermoproteolyticus Millipore 58656-2500KUCN stock concentration: 250 KU/mL
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200072
Ultracentrifugation tube Beckman Coulter 331372
Y-27632 dihydrochloride Abmole M1817 stock concentration: 10 mM

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References

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Kim, Y., Lee, J., Kim, S., Shin, K. Culture, Manipulation, and Orthotopic Transplantation of Mouse Bladder Tumor Organoids. J. Vis. Exp. (155), e60469, doi:10.3791/60469 (2020).

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