Summary
Denne protokollen gir detaljerte eksperimentelle skritt for å etablere en tredimensjonal in vitro kultur av blære tumor organoider avledet fra kreftfremkallende murine blærekreft. Kulturmetoder inkludert passaging, genteknologi, og ortopisk transplantasjon av tumor organoider er beskrevet.
Abstract
Utviklingen av avanserte tumormodeller har lenge blitt oppmuntret fordi dagens kreftmodeller har vist begrensninger som mangel på tredimensjonal (3D) tumorarkitektur og lav relevans for menneskelig kreft. Forskere har nylig utviklet en 3D in vitro kreft modell referert til som tumor organoider som kan etterligne egenskapene til en innfødt svulst i en kulturrett. Her er eksperimentelle prosedyrer beskrevet i detalj for etablering av blæretumororganoider fra en kreftfremkallende murineblæresvulst, inkludert kultur, passasje og vedlikehold av de resulterende 3D-tumororganoidene in vitro. I tillegg beskrives protokoller for å manipulere de etablerte blæretumororganoide linjene for genteknologi ved hjelp av lentivirusmediert transduksjon, inkludert optimaliserte forhold for effektiv innføring av nye genetiske elementer i svulst organoider. Til slutt er prosedyren for ortopisk transplantasjon av blæretumororganoider inn i veggen av murineblæren for videre analyse lagt ut. Metodene som er beskrevet i denne artikkelen kan lette etableringen av en in vitro-modell for blærekreft for utvikling av bedre terapeutiske alternativer.
Introduction
Blærekreft er den mest utbredte urinveiskreft, med ca 165.000 pasienter som dør årlig1. Blant de ulike typer blærekreft viser muskelindetoll eominom en aggressiv fenotype, og dens 5 års overlevelse er lavere enn 50%2. Nye terapeutiske alternativer for invasive uroteltumorer har ikke blitt utvidet i løpet av de siste tiårene1.
Kreftcellelinjer har blitt mye brukt til legemiddelscreening3. Selv om gunstige resultater har blitt observert hos mange legemiddelkandidater i kreftcellelinjer, rapporteres dårlige resultater i kliniske studier4. Etter økt tilpasning til in vitro todimensjonale (2D) kulturmiljøer, har det blitt stadig vanskeligere å rekapitulere innfødte svulster i cellelinjer. Dyrekreftmodeller eller pasientavledede tumorxenografts kan brukes til å håndtere begrensningene som observeres i blærekreftcellelinjer. Men dyrekreftmodeller er tids- og ressurskrevende. Derfor har forbedrede sykdomsmodeller vært på forespørsel i årevis, og et nytt modellsystem, organoider, er utviklet for å overvinne manglene til eksisterende modeller5.
En organoid er en flercellet 3D-konstruksjon som kan rekapitulere in vitro de fysiologiske egenskapene til det tilsvarende in vivo-organet. Normale og tumororganoider kan avledes fra enten pluripotente eller voksne stamceller, og primære tumorceller, henholdsvis5,6. I løpet av de siste årene har tumororganoider blitt etablert fra et stort antall forskjellige tumorvev7, inkludert kolon8,9, blære10, bukspyttkjertel11,12, prostata13, lever14, og bryst15 tumorvev. Slike tumororganoider etterligner sine opprinnelige svulster fenotypisk og genetisk. På grunn av deres likhet med in vivo tumorvev og deres mange praktiske anvendelser, har forskere adoptert dem som nye sykdomsmodeller i studiet av kreftpatogenese.
Her er prosedyrene for etablering av tumororganoider fra et kreftfremkallende-indusert murineininvasiv uroteliv tumor16 lagt ut. N-butyl-N-(4-hydroksybutyl) nitrosamin (BBN) brukes som kreftfremkallende for å indusere invasiv urothelial karsinom hos mus17 og tumororganoider, som viser de patologiske egenskapene til musmuskelinvasiv blæresvulster, er etablert fra BBN-indusert murine blærekreft16. Metoden for å genetisk manipulere tumororganoider er illustrert ved hjelp av lentivirus-mediert transduksjon for å utvikle et modellsystem for å studere det molekylære grunnlaget for utviklingen av blærekreft. I tillegg er en metode for transplantasjon av organoider ortotoppisk inn i en blære for å undersøke rollen til det innfødte blæremiljøet i blærekreft beskrevet.
Protocol
Alle prosedyrer ble godkjent og utført i henhold til retningslinjene til Institutional Animal Care and Use Committee ved POSTECH (IACUC-nummer: POSTECH-2019-0055).
1. In Vitro Kultur av Blære Tumor Organoider
- Etablere blæretumororganoider fra murine blæresvulsten (Figur 1A).
MERK: Prosedyren for generering av BBN-induserte museblæresvulster er skissert i Shin et al.17.- Gi 0,1% BBN-holdig vann i en mørk flaske til mus ad libitum i 6 måneder. Endre BBN-holdig vann 2x i uken.
MERK: En C57BL/6 mannlig mus med en kroppsvekt på ca. 25 g ved 8–10 uker ble brukt. BBN-holdig vann kan administreres til opptil fem mus i et enkelt bur. - Etter 6 måneder, euthanize musen ved hjelp av karbondioksid innånding og isolere hele blæresvulsten. Overfør den til en 90 mm Petri-tallerken.
- Fjern ikke-kreftdeler og nekrotiske regioner ved hjelp av steril kirurgisk saks og vask blæretumorfragmentene 2–3 ganger med kald 1x Dulbeccos fosfatbufret saltvann (DPBS). Samle fragmentene og overfør dem til en ny 90 mm Petri-tallerken.
- Tilsett 1 ml Dulbeccos modifiserte minimumsessensielle medium (DMEM) med 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES).
- Hakk tumorvevet i biter så lite som mulig (0,5–1 mm3)ved hjelp av et sterilisert barberblad.
- Tilsett 9 ml DMEM med 10 mM HEPES, 250 μg/ml kollagenasetype I, 250 μg/ml kollagenase type II og 250 U/ml termolysin. Inkuber hakket tumorvev i 1,5–2 timer på en orbital shaker i en inkubator (37 °C, 5 % CO2) for å dissosiere fragmentene i cellesuspensjonen. Overfør cellesuspensjonen til et 50 ml rør.
MERK: Hvis størrelsen på svulsten som høstes fra musen er større enn 1 cm3,behandler du den med 2x mengden termolysin eller øker inkubasjonstiden. - Sentrifuge røret ved 400 x g i 5 min ved 4 °C og aspirere supernatanten.
- Resuspender pelleten ved hjelp av 5 ml ammoniumklorid-kalium (ACK) lysing buffer for å lyse noen røde blodlegemer. Inkuber røret i 3–5 min ved romtemperatur (RT) til hele lysen av røde blodlegemer.
MERK: Hvis de røde blodcellene ikke observeres, utelater du lysingsprosessen. - Tilsett 20 ml DMEM i røret. Sentrifuge røret ved 400 x g i 5 min ved 4 °C og aspirere supernatanten.
- Resuspender pelleten med 1 ml 0,25 % Trypsin-EDTA og 10 μM Y-27632 dihydroklorid (Y-27632) for å dissosiere pelleten i enkeltceller. Inkuber røret i 5 min i et 37 °C vannbad.
MERK: Observer svulsten under et mikroskop for å bekrefte fullstendig dissosiasjon i enkeltceller. Hvis biter av celler vedvarer, pipette suspensjonen ytterligere. - Nøytraliser trypsin ved hjelp av 10 ml DMEM med 10 % føtal storfeserum (FBS). Filtrer cellesuspensjonen gjennom en 100 μm cellesil på et nytt 50 ml rør for å fjerne ufordøyd rusk.
- Sentrifuge røret ved 400 x g i 5 min ved 4 °C og aspirere supernatanten.
- Coat en brønn i en 24 brønnplate ved hjelp av 150 μL iskald vekstfaktor redusert kjeller membran matrise (Table of Materials) og plassere 24 brønnplate i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) i 30 min for å stivne kjelleren membran matrise.
MERK: Tin opp og vedlikehold kjellermembranmatrisen ved 4 °C for å forhindre størkning før bruk. - Resuspender pelleten ved hjelp av 1 ml DMEM og telle cellene ved hjelp av et hemocytometer. Overfør 3-4 x 104 tumorceller til et 1,5 ml mikrorør på is.
- Sentrifuge mikrorøret ved 400 x g i 3 min ved 4 °C og kast forsiktig supernatanten.
- Resuspender cellene med 500 μL prewarmed organoid medium(Tabell 1) og 10 μM Y-27632 og overfør dem til den belagte brønnen. Plasser 24 brønnplaten i en inkubator (37 °C, 5 % CO2).
- Ekstra blæretumorceller kan fylles med 1 ml DMEM som inneholder 10 % FBS, 1 % penicillin/streptomycin og 10 % dimetylsulfoksid (DMSO) i 1,5 ml kryovialer. Plasser dem i en kryovial frysebeholder og overfør beholderen til en -80 ° C fryser. Etter lagring i fryseren over natten, overføre kryovials til flytende nitrogen for langsiktig lagring.
- Endre mediet annenhver dag ved hjelp av 500 μL prewarmed organoid medium (Figur 1B).
- Gi 0,1% BBN-holdig vann i en mørk flaske til mus ad libitum i 6 måneder. Endre BBN-holdig vann 2x i uken.
- Subkultur blære tumor organoider.
MERK: Passasje av blæretumororganoider når de når 100–150 μm i diameter anbefales.- Tilsett 500 μL kollagennase/dispase til organoidmediet i 24 brønnplaten med tumororganoider. Pipette opp og ned kjelleren membran matrise og mediet. Inkuber i 20 min ved 37 °C og høst cellene inn i et 15 ml rør.
MERK: Undersøk organoidene isolert fra kjellermembranmatrisen under et mikroskop. Hvis organoidene ikke er løsrevet fra kjellermembranmatrisen, øker inkubasjonstiden eller pipetten flere ganger. - Tilsett 5 ml prewarmed DMEM, sentrifuge røret ved 400 x g i 3 min ved 4 °C, og aspirer supernatanten.
- Resuspender pelleten ved hjelp av 1 ml prewarmed 0,25% trypsin-EDTA og 10 μM Y-27632. Inkuber i 5 min i et 37 °C vannbad. Kraftig pipette cellene opp og ned og nøytraliser trypsin ved hjelp av 5 ml DMEM med 10% FBS.
- Sentrifuge røret ved 400 x g i 3 min ved 4 °C og aspirere supernatanten.
- Resuspender pelleten ved hjelp av 1 ml prewarmed organoid medium og telle antall enkelt tumorceller.
- Gjenta trinn 1.1.14−1.1.18.
- Tilsett 500 μL kollagennase/dispase til organoidmediet i 24 brønnplaten med tumororganoider. Pipette opp og ned kjelleren membran matrise og mediet. Inkuber i 20 min ved 37 °C og høst cellene inn i et 15 ml rør.
2. Genetisk manipulering av blæretumororganoider ved hjelp av lentivirusmediert transduksjon (figur 2A)
- Produser GFP-uttrykkende lentivirale partikler.
- På dag 0, plate HEK 293T celler med en tetthet på 5-6 x 106 celler per 10 cm celle kulturplate i cellelinje kultur medium (dvs. DMEM med 10% FBS og 1% penicillin / streptomycin).
- På dag 1, forberede DNA-transfeksjonsoppløsningen inkludert overføringsplasmid holdig GFP (8 μg), lentiviral emballasje plasmid (10 μg pCMVR 8,74 og 3 μg pMD2.G), og 1 ml redusert serummedium (Materialtabell).
- Tilsett 3 μL transfeksjonsreagens (Materialtabell) per 1 μg total plasmid i henhold til produsentens instruksjoner og bland forsiktig ved pipettering. Inkuber i 20 min ved RT og legg til 9 ml DMEM med 10% FBS.
- Aspirer kulturmediet i cellekulturplaten med HEK 293T-celler. Overfør forsiktig 10 ml DNA-transfeksjonsoppløsning til HEK 293T-cellene og inkuber i en cellekulturinkubator ved 37 °C.
- På dag 3, observere cellene under et fluorescensmikroskop (eksitasjon ved 488 nm og utslipp ved 512 nm) for å bestemme transfection effektivitet. Nesten 90%–100% av cellene i hele cellepopulasjonen bør uttrykke GFP.
- Samle supernatanten (som inneholder viruset) og filtrate supernatanten med et 0,45 μm polyeterulfonfilter (PES).
MERK: Bruk et lavt proteinbindingsfilter, for eksempel et PES-filter. - For å konsentrere viruset, sentrifuge viruset supernatant på 98,768 x g i en ultracentrifuge for 2 t ved 4 °C i en svingende bøtte rotor (Table of Materials) og forsiktig kaste supernatant.
- Resuspender pelleten i 2,5 ml kaldt organoidmedium.
- For langtidslagring, aliquot 250 μL lentiviral medium i kryogene hetteglass og snap-fryse dem ved hjelp av flytende nitrogen. Oppbevar de frosne virusbestandene i en -80 °C-fryser.
- Utfør lentivirus-mediert transduksjon av blæren tumor organoider.
- På dag 2, dele tumor organoider som beskrevet ovenfor (trinn 1,2) 12 timer før lentivirus-mediert transduksjon.
- På dag 3, tin raskt en aliquot (trinn 2.1.9) som inneholder virus i et 37 ° C vannbad og tilsett 250 μL organoid medium med 10 μM Y-27632 og 8 μg/ml hexadimethrinbromid.
- Erstatt organoidmediet i 24 brønnplate med tumororganoider med 500 μL virusholdig medium og inkubator i 12–16 timer i inkubator (37 °C, 5 % CO2).
- På dag 4, endre mediet med 500 μL ferskorganoid medium.
MERK: Etter 12–16 timer med inkubasjon bør mediet endres, fordi mediet som inneholder lentivirus og heksadimethrinbromid er cytotoksisk. - På dag 6 overvåker du GFP-signalet fra tumororganoidene 3 dager etter transduksjon under et fluorescensmikroskop (Figur 2B).
- På dag 10, passasje og lager organoider 7 dager etter transduksjon som beskrevet i trinn 1.2, for å opprettholde genmodifiserte tumor organoid linjer.
3. Ortotopisk transplantasjon av blæreorganoid (figur 3A)
- Forbered blæretumororganoider for ortopisk transplantasjon.
- Før transplantasjon, kultur blæren tumor organoider i 5-7 dager, som beskrevet ovenfor (trinn 1.2).
- Tilsett 500 μL kollagennas/dispase til organoidmedium i en 24 brønnplate med tumororganoider. Pipette opp og ned kjelleren membran matrise og medium. Inkuber i 20 min ved 37 °C og samle cellene i et 15 ml rør.
- Tilsett 5 ml prewarmed DMEM, sentrifuge røret ved 400 x g i 3 min ved 4 °C, og aspirer supernatanten.
- Resuspender pelleten med 1 ml DMEM og overfør oppløsningen til en 90 mm Petri-tallerken.
- Under et mikroskop, plukke opp 10-100 tumor organoider ved hjelp av en p200 mikropipette og samle dem inn i et mikrorør på is.
- Sentrifuge røret ved 400 x g i 3 min ved 4 °C og kast forsiktig supernatanten.
- Vedlikehold cellepelleten på is til musene er klare for kirurgi.
- Submucosal blære vegg transplantasjon
MERK: Denne fremgangsmåten er endret fra protokollen publisert av Fu et al18.- Forbered en 8 til 10 uke gammel mannlig naken mus (CAnN.Cg-Foxn1nu / Crl) minst 1 uke før eksperimentet for å tillate det å akklimatisere seg til et nytt miljø. Injiser enrofloksacin (5 mg/kg) subkutant 24 timer før operasjonen.
- Rengjør benkeflaten med såpe og vann. Autoklav kirurgiske instrumenter før kirurgisk prosedyre og utføre kirurgi ved hjelp av sterile instrumenter.
- Oppbevar 29 G insulinsprøyte, pipettetips og kjellermembranmatrise på is. Administrer ketoprofen (5 mg/kg) subkutant før administrering av anestesi.
- Bedøve musen med 4% isofluran i et induksjonskammer. Når generell anestesi oppnådde, legg musen i en supine posisjon og opprettholde anestesi ved maske innånding av 2% fordampet isoflurane.
MERK: Hvis anestesitiden er over 30 min, bruk øyesalve på begge øynene ved hjelp av en bomullspinne for å unngå hornhinnetørking. - Påfør povidon-jod med steril gasbind og tørk den ned med 70% etanol. Gjenta 3x med en ny gasbind eller en bomullspinne hver gang.
- Dekk anus og det kirurgiske feltet ved hjelp av engangs, sterile kirurgiske gardiner.
- Bruk et dissekeringsmikroskop for forstørrelse, gjør et lite tverrgående snitt (mindre enn 1,5 cm) i huden og muskelveggen i nedre midtlinjemage med steril kirurgisk saks. Utsett blæren fra bukhulen og støtte den med saltvannsfuktede bomullspinner.
MERK: Hvis blæren er full av urin, trykk blæren forsiktig for å dekomprimere den litt. - Resuspender organoidpellets (trinn 3.1.7) i 80 μL organoid medium som inneholder 50% høy konsentrasjon kjeller membran matrise (Materialtabell).
- Injiser organoid suspensjon i det snevre aspektet av blærekuppelen ved hjelp av 29 G insulinsprøyten under et dissekeringsmikroskop.
- Lukk det indre laget av bukveggen med antibakteriell absorberbar sutur og lukk deretter det ytre laget med 4-0 nylonsuturering. Desinfiser operasjonsstedet med povidon-jod og 70% etanol.
- La musen komme seg under en infrarød irradiator 10-15 min. Overvåk musen til den gjenvinner bevissthet og motilitet.
- En dag etter operasjonen, sjekk den generelle tilstanden til musen og anastomotisk lekkasje. Administrer ketoprofen (5 mg/kg) én gang daglig i 3 dager etter operativt og behandle enrofloksacin (5 mg/kg) én gang daglig i 10 dager etter operativt.
- Når snittområdet har grodd (10-14 dager etter operasjonen), fjern suturene. Overvåk veksten av museblæresvulsten i 2–3 uker etter tumororganoidinjeksjonen.
- Hvis blæretumorvekst observeres, euthanize musen ved hjelp av karbondioksid innånding, og høst hele blæresvulsten. Vask den med kald DPBS (Figur 3B)16.
- For å analysere blæretumorhistologien, beflekk parafininnebygd del av vevet ved hjelp av hematoksylin og eosin (H og E) farging (Figur 3B)16.
Representative Results
In vitro kultur av museblæren tumor organoider
Antall tumorceller dissosiert fra en ~ 1 cm3 BBN-indusert svulst er minst 4 x 105 celler. Når cellene i utgangspunktet seedes i kjelleren membran matrise, ikke-kreftceller og rusk kan observeres. Rusk ble gradvis utvannet ved å fortsette subkulturen. Figur 1B viser bilder av de kultiverte organoidene på forskjellige tidspunkter. Hvis tumorcellene ikke danner tumororganoider, er cellene potensielt døde under dissosiasjonstrinnet. I et slikt tilfelle må dissosiasjonsprosedyrer, inkludert inkubasjonstid med enzymet, justeres for å øke cellelevedyktigheten.
Uttrykk for GFP i blæretumororganoider ved hjelp av lentivirusmediert genetisk manipulasjon
Blæretumororganoider viste sterke GFP-signaler med vellykket lentiviral infeksjon (figur 2B). Etter konsentrasjon var totalt 250 μL virusholdige medier nok til å infisere 3 x 104 enkelttumorceller på kjellermembranmatrisen, og opprettholdt 90%–100% infeksjonseffektivitet. GFP-signaler kan oppdages fra blæretumororganoider 3 dager etter lentiviral transduksjon. Hvis fluorescenssignalene er lave, er effektiviteten av virusinfeksjon potensielt lav. Dette kan skyldes mange faktorer, for eksempel lav viral titer, og prosedyrene må justeres tilsvarende.
Ortotopisk transplantasjon av blæretumororganoider
En blæresvulst allograft hentet fra BBN-indusertblære tumororganoider presenteres i figur 3B16. Blæretumor allografts ble høstet 3 uker etter ortopisk transplantasjon. Histologien til den transplanterte blæresvulsten ble analysert ved hjelp av H og E-farging. Ortotopisk transplantasjoner av tumororganoider kan vokse som blæresvulster i 2–3 uker.
Figur 1: In vitro kultur av mus blære tumor organoider. (A) Skjematisk diagram for etablering av museblære tumor organoider. (B) Representative bilder for kulturen i blæretumororganoider på forskjellige tidspunkter. Musblære tumororganoider ble etablert og kultivert over 9 dager. Skala bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Uttrykk for GFP i blæretumororganoider ved hjelp av lentivirusmediert genetisk manipulasjon. (A) Skjematisk diagram av lentiviral transfection og transduksjon av blære tumor organoider. (B) Representative bilder av blæretumororganoider som uttrykker GFP. Skaler stenger = 100 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Ortopisk transplantasjon av blæretumororganoider. (A) Skjematisk diagram av ortopisk transplantasjon av blære tumor organoider til en naken mus. (B) Representative bilder av blære og H og E farget seksjoner fra mus ortotopically transplantert med blære tumor organoider. Forstørret visning av de boksede områdene i de midterste panelene vises i de venstre panelene. Skala bar = 500 μm. Dette tallet ble gjengitt fra figur 1-figur supplement 1, Kim et al.16, publisert under Creative Commons Attribution 4.0 International Public License (CC BY 4.0; https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
| Museblære tumor organoider medium | |
| Avansert DMEM/F-12 (Grunnleggende medium) | 10 mM HEPES (pH 7,4) |
| 10 mM Nikotinamid | 0,5 x serumfritt tillegg |
| 2 mM L-alanyl-L-glutamin dipeptid | 1 % penicillin/streptomycin |
| 1 mM N-acetyl-L-cystein | 50 ng/ml ml epidermal vekstfaktor |
| 1 μM A 83-01 | |
Tabell 1: Sammensetning av blæretumororganoidmedium.
Discussion
Denne protokollen beskriver eksperimentelle prosedyrer for å kultur og opprettholde blære tumor organoider avledet fra kreftfremkallende murine blære svulster.
I denne protokollen er det flere eksperimentelle trinn der prosedyrene kanskje trenger litt feilsøking. For det første er antall tumorceller som i utgangspunktet seedes en kritisk faktor fordi lavt antall tumorceller i kultur (<2 x 104 celler) for det meste fører til celledød på grunn av mangel på interaksjoner mellom tumorceller. I motsetning, begynner med for mange celler (> 5 x 104 celler) på seeding fører til overbefolkede organoider, noe som resulterer i vanskeligheter når du håndterer kulturer med dårlig vekst av hver organoid. Det er sterkt foreslått at flere plater med forskjellige antall celler etableres i begynnelsen for å optimalisere de eksperimentelle forholdene. Identifisere riktig antall innledende tumorceller er avgjørende for å oppnå den høyeste celle levedyktighet og å etablere vellykket blære tumor organoider. Også i langsiktig kultur på over 2 uker uten å passere, slutter de fleste tumororganoider å vokse, potensielt på grunn av utilstrekkelig tilførsel av næringsstoffer i midten av organoider og uttømming av vekstfaktor i kjelleren membran matrise. Derfor er subculturing organoider i tide et kritisk skritt for å opprettholde tumor organoid kultur.
For det andre er produksjonen av høytiterlentivirale partikler avgjørende for effektiv genetisk manipulering av tumororganoider. For å feilsøke virustiterrelaterte problemer, er det sterkt foreslått at virustiters bestemmes før viral transduksjon hver gang fordi lentivirale konstruksjoner har en tendens til å produsere viruspartikler med varierende effektivitet. Hvis tumororganoider viser lav levedyktighet etter virusinfeksjon, er det sannsynlig at virustiterne potensielt er for høye. Det er sterkt foreslått å bruke lavere mengde virus i dette tilfellet. Tredje, under ortopisk transplantasjon av BBN-indusert blære tumor organoider, er det avgjørende å opprettholde integriteten til blæreveggen. I tilfelle injeksjonen når blærens lumen ved å trenge inn i blærevegglaget, bør eksperimentet avsluttes og kastes. Hvis mulig anbefales overvåking av blæretumorvekst ved hjelp av et ultralydbildesystem.
En begrensning av de nåværende teknikkene er fraværet av tumormikromiljøet eller stroma i disse organoidene. For å overvinne dette problemet, er det sterkt foreslått at ortopisk transplantasjon av tumororganoider bruker et in vivo-system for å etterligne det innfødte tumormikromiljøet. I fremtiden vil det være nødvendig å utvikle 3D in vitro organoid systemer som består av tumororganoider med andre komponenter av tumor stroma.
En av de store implikasjonene av vår teknikk er at i ortopisk transplantasjon av tumororganoider kan bare 10 blæretumororganoider indusere tumorvekst i blæren. Sammenlignet med de konvensjonelle tumortransplantasjonsforsøkene som krever 5 x 105–1 x 106 enkeltblæretumorceller, er metodene våre mye mer effektive og robuste. En annen betydelig forskjell er at organoidene kan manipuleres forskjellig ved hjelp av ulike lentivirale vektorer, for eksempel lentivirale konstruksjoner som inneholder korthårede RNA, CRISPR-Cas9-systemet eller opprinnelser av interesse. Dette ville være kraftige verktøy for å legge til dagens organoid teknologi. Samlet sett kan de eksperimentelle tilnærmingene som presenteres her lette etableringen av in vitro tumormodeller som kan forbedre vår forståelse av patogenesen av blærekreft i stedet for å bruke 2D blærekreft cellelinjer.
Denne metoden var i stand til å etablere blære tumor organoider avledet fra en kreftfremkallende murinblære svulst. Artikkelen gir en beskrivelse av lentivirus-medierte eksperimentelle prosedyrer der de genetiske modifikasjonene innføres og stabilt opprettholdes i blæretumororganoider. I tillegg er en prosedyre for ortopisk transplantasjon av tumororganoider inkludert. I kombinasjon med nåværende in vivo kreftmodeller, vil denne teknikken være et nyttig verktøy for å studere molekylært grunnlag av blære tumorigenese.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av tilskudd fra National Research Foundation of Korea til K.S: NRF-2017R1A2B4006043, NRF-2017M3C7A1047875, NRF-2017R1A5A1015366, Creative Economy Leading Technology Development Programme (SF317001A), POSCO (2018Y) BK21 Plus Research Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm syringe filter (PES membrane) | Millipore | SLHP033RS | |
| 10 cm culture plate | Eppendorf | 0030-702-115 | |
| 90 mm Petri dish | SPL | 10090 | |
| 100 µm cell strainer | Corning | 352360 | |
| 15 mL conical tube | SPL | 50015 | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 29 G 1/2 insulin syringe | SHINA | B299473538 | |
| 3 mL syringe | Norm-ject | N7.A03 | |
| 50 mL conical tube | SPL | 50050 | |
| A8301 | Tocris | 2939 | stock concentration: 25 mM |
| Absolute ethanol | Daejung | 4023-2304 | |
| Absorbable suture | Henry Schein | 039010 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo | 12634028 | |
| Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Thermo | A1049201 | |
| B-27 | Gibco | 17504-044 | stock concentration: 50X |
| BBN(N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine) | Tokyo Chemical Industry | B0938 | |
| Blue nylon 5/0-13mm | AILEE | NB521 | |
| C57BL Mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl (nude mouse) | Charles River | 194 | |
| Collagenase type I | Thermo | 17100017 | stock concentration: 20 mg/mL |
| Collagenase type II | Thermo | 17100015 | stock concentration: 20 mg/mL |
| Collagenase/dispase | Sigma | 10269638001 | stock concentration: 1 mg/mL |
| Cyrovial | Corning | 430488 | |
| DMEM(Dulbecco's modified minimum essential media) | Gibco | 11965-118 | |
| DMSO(Dimethyl sulfoxide) | Sigma | D8418 | |
| DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline) | Welgene | LB 001-02 | |
| Enrofloxacin (Baytril) | Bayer Healthcare | DIN: 02169428 | |
| FBS(Fetal bovine serum) | Millipore | ES009B-KC | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | 100X |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Welgene | BB001-01 | |
| Isoflurane | Hana Pharm Co., Ltd. | ||
| Ketoprofen (Anafen) | Merial | DIN: 02150999 | |
| Matrigel growth factor reduced (GFR) Growth Factor Reduced (GFR) |
Corning | 354230 | use for organoid culture in plate |
| Matrigel high concentration (HC) | Corning | 354248 | use for organoid transplantation |
| 1.5 mL microtube | Axygen | MCT-150-C | |
| LT1 transfection reagent | Mirus Bio | MIR 2300 | |
| murine EGF(epidermal growth factor) | Peprotech | 315-09 | stock concentration: 100 µg/mL |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | stock concentration: 200 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | stock concentration: 1M |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | |
| pCMV.R 8.74 | Addgene | 22036 | Packaging plasmid |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | 100X |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Envelope plasmid |
| Polybrene(hexadim ethrine bromide) | Sigma | H9286 | stock concentration: 2 µg/mL |
| pSiCoR | Addgene | 11579 | Lentiviral plasmid |
| Razor blade | |||
| Saline buffer | JW Pharmaceutical | ||
| SW41Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ||
| Thermolysin, Bacillus thermoproteolyticus | Millipore | 58656-2500KUCN | stock concentration: 250 KU/mL |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | |
| Ultracentrifugation tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Abmole | M1817 | stock concentration: 10 mM |
References
- Sanli, O., et al. Bladder cancer. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17022 (2017).
- Stenzl, A., et al. Treatment of muscle-invasive and metastatic bladder cancer: update of the EAU guidelines. European Urology. 59 (6), 1009-1018 (2011).
- Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483 (7391), 603 (2012).
- Caponigro, G., Sellers, W. R. Advances in the preclinical testing of cancer therapeutic hypotheses. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 179 (2011).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407 (2018).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246 (2016).
- Pauli, C., et al. Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine. Cancer discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-517 (2018).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell-and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364 (2015).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer–derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424 (2017).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Kim, S., et al. Epigenetic regulation of mammalian Hedgehog signaling to the stroma determines the molecular subtype of bladder cancer. eLife. 8, 43024 (2019).
- Shin, K., et al. Cellular origin of bladder neoplasia and tissue dynamics of its progression to invasive carcinoma. Nature Cell Biology. 16 (5), 469 (2014).
- Fu, C. L., Apelo, C. A., Torres, B., Thai, K. H., Hsieh, M. H. Mouse bladder wall injection. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (53), e2523 (2011).
