Formålet med denne undersøgelse var at etablere en metode til undersøgelse af hjertets dynamik ved hjælp af en translationel dyremodel. Den beskrevne eksperimentelle tilgang inkorporerer Dual-emission optocardiography i forbindelse med en elektrofysiologisk undersøgelse for at vurdere elektrisk aktivitet i en isoleret, intakt svine hjerte model.
Små dyremodeller anvendes oftest i hjerte-kar-forskning på grund af tilgængeligheden af genetisk modificerede arter og lavere omkostninger i forhold til større dyr. Endnu, større pattedyr er bedre egnet til translationelle forskningsspørgsmål i forbindelse med normal hjertets fysiologi, Patofysiologi, og præklinisk testning af terapeutiske midler. For at overvinde de tekniske barrierer, der er forbundet med at ansætte en større dyremodel inden for Kardiologisk forskning, beskriver vi en tilgang til måling af fysiologiske parametre i et isoleret, Langendorff-perfektbrugt Grisling hjerte. Denne fremgangsmåde kombinerer to kraftfulde eksperimentelle værktøjer til at evaluere tilstanden af hjertet: Elektrofysiologi (EP) undersøgelse og samtidig optisk kortlægning af transmembran spænding og intracellulære calcium ved hjælp af parameter følsomme farvestoffer (RH237, Rhod2-am). De beskrevne metoder egner sig godt til translationelle undersøgelser, der undersøger det kardiale ledningssystem, ændringer i aktionspotentialet morfologi, calcium håndtering, excitation-sammentrækning kobling og forekomsten af hjerte vekslere eller Arytmier.
Hjerte-kar-sygdom er en førende årsag til sygdom og død på verdensplan. Som sådan er en primær forskning fokus på at optimere metoder, der kan bruges til at studere normal hjertets fysiologi og underliggende mekanismer, der kan bidrage til sygelighed og dødelighed hos mennesker. Grundlæggende kardiovaskulær forskning har traditionelt været baseret på små dyremodeller, herunder gnavere og kaniner1,2,3, pågrund af tilgængeligheden af genetisk modificerede arter4,5, lavere omkostninger, mindre eksperimenterende fodspor og højere gennemløb. Brugen af en svine model har imidlertid potentiale til at give mere klinisk relevante data6. Faktisk, tidligere undersøgelser har dokumenteret ligheder i hjertets Elektrofysiologi (EP) mellem mennesker og grise, herunder lignende ion strømme7, action potentiel figur8, og respons på farmakologiske test9. Desuden, svine hjertet har kontraktile og afslapning kinetik, der er mere sammenlignelige med mennesker end enten gnavere eller kaniner10. Sammenlignet med en hunde model, den Porcin koronar anatomi mere ligner en menneskelig hjerte11,12 og er den model af valg for undersøgelser fokuseret på hjerte udvikling, pædiatrisk kardiologi og/eller medfødte hjertefejl 13. selv om der er forskelle mellem gris og menneskelige hjerte8, disse ligheder gør svin hjerte en værdifuld model for hjerte-kar-forskning14.
Retrograd perfusion af hjertet er blevet en standardprotokol for at studere hjertets dynamik ex vivo15 siden først etableret af Oskar Langendorff16. Derfor kan Langendorff-perfusion anvendes til at støtte et isoleret, intakt hjerte uden autonome påvirkninger. Denne model er et nyttigt værktøj til direkte at sammenligne hjertets Elektrofysiologi og kontraktilitet mellem sunde og ikke-sunde hjerter. Da hjertets dynamik både er timeligt og rumligt komplekst, kan en mindre ændring i én region dramatisk påvirke hele hjertets evne til at arbejde som syncytium17. Derfor er høj spatiotemporale billeddannelse af parameter følsomme farvestoffer et nyttigt værktøj til overvågning af hjertets funktion på tværs af hjertets overflade18,19. Faktisk giver simultan dobbelt billeddannelse af spænding og calcium-følsomme fluorescerende sonder mulighed for vurdering af elektrisk aktivitet, calcium håndtering og excitation-sammentrækning kobling på vævsniveau20,21, 22,23,24,25,26,27,28. Langendorff-perfusion og/eller optisk kortlægnings teknik har tidligere været anvendt til at dokumentere nedgangen i hjertets ydeevne på grund af aldring eller genetiske mutationer og til at vurdere sikkerheden af farmakologiske agenser eller miljø eksponeringer29 ,30,31,32,33.
I de kliniske omgivelser, en invasiv kardiel Elektrofysiologi undersøgelse bruges ofte til at undersøge hjerterytmeforstyrrelser, identificere patologier, og lokalisere mulige behandlingsmuligheder. På samme måde beskriver vi en EP-protokol, der kan bruges til at vurdere sinus node funktion, måle atrioventrikulær ledning, og identificere refraktoriness af myokardievæv. Den beskrevne EP-undersøgelse kan udføres i forbindelse med optisk kortlægning, eller optokardiografi34, til fuldt ud at karakterisere hjertets fysiologi i isolerede hjerter. I den beskrevne protokol blev der udført en høj spatiotemporale opløsning fluorescens Imaging med en kombination af spænding (RH237) og calcium (rhod-2AM) farvestoffer i en dual emission opsætning. Derudover blev kardielle Elektrofysiologi parametre overvåget under både sinusrytme og som respons på programmeret elektrisk stimulation.
Selv om kardiovaskulære forskningsmodeller spænder fra cellulære til in vivo præparater, der er en iboende trade-off mellem klinisk relevans og eksperimentel nytte. På dette spektrum er det isolerede Langendorff-perfvant hjerte fortsat et nyttigt kompromis for studiet af hjertets fysiologi48. Hele hjerte modellen repræsenterer en højere grad af funktionel og strukturel integration end enkelt celle-eller vævs monolayers, men undgår også de forstyrrende kompleksiteter, der er forbundet med in vivo-modeller. En stor fordel ved Dual optisk kortlægning eksperimenter er, at den epicardial overflade af det isolerede hjerte kan observeres, og fluorescens billeddannelse af transmembran potentiale og calcium håndtering kan bruges til at overvåge hjertets fysiologi34.
Gnaver modeller er mest almindeligt anvendt til isolerede hjerte præparater i modsætning til større dyr, skyldes til dels de tilknyttede omkostninger ved at op-dimensionere alle de involverede elementer (f. eks opløsning volumen, perfusion kredsløb, mængde af farvestoffer og mekaniske uncouplers) sammen med større ustabilitet og tilbøjelighed til arytmias i større dyr10,36,49. En fordel ved at bruge gris hjerter er, at de ligner det menneskelige hjerte i struktur, størrelse og hastighed af sammentrækning, derfor mere præcist modellering hæodynamiske parametre som koronar blodgennemstrømning og hjertets udgang. På samme måde har mennesker og grise lignende calcium håndtering, elektrokardiogram intervaller37, og action potentielle morfologi, herunder de underliggende kanaler, som det repræsenterer12,50,51, 52. Denne protokol beskriver i detaljer de trin, for at skabe en reproducerbar store animalske model til omfattende karakterisere myokardial funktion. Samtidig billeddannelse af transmembran-spænding (RH237) og intracellulær calcium (Rhod2), der anvendes sammen med etablerede elektrofysiologiske protokoller, giver mulighed for at udpege mekanismer, der er ansvarlige for ændrede kardiale Funktion. Den beskrevne metodologi kan anvendes til prækliniske sikkerhedsundersøgelser, toksikologisk screening og undersøgelse af genetiske eller andre sygdoms patologier. Desuden kan den beskrevne metodologi ændres og tilpasses til brug sammen med andre hjerte modeller (f. eks. hunde, mennesker) afhængigt af det specifikke forsknings fokus53,54,55.
Der er et par kritiske ændringer at huske på, når overgangen fra en mindre gnaver model til en større svine model for isolerede, hele hjerte præparater. Under klargøring og opsætning anbefaler vi at tilføje albumin til perfusatet for at opretholde onkotisk tryk og reducere ødem (plus antifoam, hvis det er nødvendigt)56,57,58,59. Desuden, perfusat indeholder albumin kan også støtte i metaboliske undersøgelser, der også kræver fedtsyre tilskud til medierne60,61. I modsætning til gnaver hjerter behøver det større svine hjerte ikke at blive nedsænket i varme medier på grund af dets mindre overflade til volumen forhold og den øgede mængde varmede medier, der strømmer gennem krans karrene, som bedre bevarer temperaturen. Som tidligere nævnt placerede vi temperatur sonder inde i højre ventrikel og på den epicardial overflade af både højre og venstre ventrikler, der kun observerede små temperaturudsving på 1 − 2 °C på alle tre steder i hele studiet. Vigtigere, kan sådanne hurtigere strømningshastigheder også øge sandsynligheden for bobler og en potentiel emboli. For at omgå dette problem anbefaler vi at bruge en boble fælde med store bore slanger, der fører direkte ned til aorta kanylen. Tilsvarende fandt vi det mest nyttigt at have to personer, der arbejder i tandem til at kanyle aorta på et større (og tungere) hjerte; en person til at holde aorta åben med robuste produkter og en anden til at sikre aorta til atraumatiske ved hjælp af navle bånd. I den beskrevne metode konstaterede vi, at perfusion med kardioplegi og defibrillering var afgørende for hjerte genfinding, hvilket er i modstrid med gnaver hjerte præparater. I vores erfaring, genoptog kun et par fjernede hjerter normal sinus-drevet aktivitet uden kardioversion.
For at forbedre optiske billedbehandlings slutpunkter begrænsede en hængende hjerte forberedelse effekten af blænding, der kan opstå med et nedsænket hjerte. Desuden, den hængende hjerte undgår også enhver kompression eller kompromis af krans karrene på det bageste aspekt af hjertet, der kan opstå, når æglæggende hjertet ned horisontalt for vertikal billeddannelse. Vi fandt også, at lastning fluorescerende farvestoffer efter boble fælde (tæt på aorta-kanyle) stærkt forbedret vævs farvning og optiske signaler. Endelig, at forbedre hjertets Elektrofysiologi endepunkter, brugen af en større koaksial stimulation elektrode lettet vellykket atrieflimning. Selv om vi beskriver brugen af elektrokardiogrammer til at identificere opsamling og tab af Capture til forskellige EP parametre, kan intrakardiel katetre eller bipolar optagelse elektroder også anvendes.
Vores undersøgelse var fokuseret på at udvikle en metode til dual optisk kortlægning og kardiel elektrofysiologisk vurdering i en isoleret, intakt svine hjerte model. På grund af ligheder med den unge menneskelige hjerte, svine hjertet er stadig en populær model for undersøgelser fokuseret på pædiatrisk kardiologi eller medfødte hjertefejl. Vigtigere, kan den beskrevne tilgang tilpasses til brug med større størrelse voksne hjerter og/eller forskellige arter af interesse. Faktisk kan andre laboratorier finde, at brugen af hunde eller menneskelige hjerter (enten donor eller syge) er mere gældende for deres specifikke forskning fokus53,54,55. En anden potentiel begrænsning til denne undersøgelse er brugen af en mekanisk af at reducere bevægelse artefakt under billeddannelse. Blebbistatin er blevet afkobler af valg i hjertets billedbehandlings applikationer på grund af dets minimale effekt på EKG-parametre, aktivering og refraktære perioder41,62,63. BDM er et billigere valg, som kan være særlig vigtigt i store dyreforsøg, der kræver større mængder af perfusat og mekanisk afkobling, men det vides at have en større indvirkning på kalium-og calcium strømme, der kan ændre aktionspotentialet morfologi64,65,66,67. Hvis BDM anvendes, Bemærk, at APD forkortelse øger hjertets sårbarhed over for chok-induceret rytmeforstyrrelser68. Omvendt er den primære begrænsning for brug af blebbistatin dens lysfølsomhed og fototoksicitet, selv om alternative formuleringer, der har reduceret disse virkninger69,70,71. Endelig anvender den beskrevne metode et enkelt kamerasystem til dobbelt optisk kortlægning eksperimenter, men det er vigtigt at bemærke, at forskningsundersøgelser fokuseret på ventrikelflimren og/eller sporing af elektriske bølger på tværs af epicardial overflade ville være nødvendigt at ændre denne tilgang til at omfatte tredimensionel panoramabilleder, som beskrevet af andre15,19,72,73,74,75 .
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkender taknemmeligt Dr. Matthew Kay for hjælpsom eksperimentel vejledning, og Manelle Ramadan og Muhaymin Chowdhury for teknisk assistance. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (R01HL139472 to NGP, R01 HL139712 to NI), children’s Research Institute, children’s national Heart Institute og Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical innovation.
(-)-Blebbistatin | Sigma-Aldrich | B0560-5MG | Mechanical Uncoupler |
2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753-100G | Mechanical Uncoupler |
Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A9418 | |
Analog signal interface | emka Technologies | itf16USB | |
Antifoam | Sigma-Aldrich | A5758-250ML | |
Antifoam Y-30 Emulsion | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A5758 | |
Aortic cannula, 5/16” | Cole-Parmer | 45509-60 | |
Bubble trap | Sigma-Aldrich | CLS430641U-100EA | |
CaCl2 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | C77-500 | |
Camera, sCMOS | Andor Technology | Zyla 4.2 PLUS | |
Coaxial stimulation electrode (atria) | Harvard Apparatus | 73-0219 | |
Defibrillator | Zoll | M Series | |
Dichroic mirror | Chroma Technology | T660lpxrxt-UF2 | |
Differential amplifier | Warner Instruments | DP-304A | |
Emission filter, calcium | Chroma Technology | ET585/40m | |
Emission filter, voltage | Chroma Technology | ET710lp | |
EP stimulator (Bloom) | Fisher Medical | DTU-215B | |
Excitation filter | Chroma Technology | CT510/60bp | |
Excitation lights | Thorlabs | SOLIS-525C | |
Filter | McMaster-Carr | 8147K52 | |
Filter cartridge, polypropylene | Pentair | PD-5-934 | |
Filter housing | McMaster-Carr | 9979T21 | |
Flow transducer | Transonic | ME6PXN | |
Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 158968 | |
Heating coil | Radnoti | 158821 | |
Hemofilter | Hemocor | HPH 400 | |
Hemostatic Forceps | World Precision Instruments | 501326 | |
Image Splitter | Cairn Research | OptoSplit II | |
KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P3911 | |
KH2PO4 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | 423-316 | |
Large-bore tubing, I.D. 3/8” | Fisher Scientific | 14-169-7H | |
Lens 50 mm, 0.95 f-stop | Navitar | DO-5095 | |
Metamorph | Molecular Devices | Image Alignment | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M-7506 | |
Mucasol detergent | Sigma-Aldrich | Z637181-2L | |
Na Pyruvate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P2256 | |
NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S-3014 | |
NaHCO3 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S-233 | |
Needle Electrodes 29 gauge, 2 mm | AD Instruments Inc. | MLA1204 | |
Noise eliminator | Quest Scientific | Humbug | |
Perfusion pump | PolyStan | A/S 1481 | |
Pressure transducer | World Precision Instruments | BLPR2 | |
Reservoir, 2 liter | Cole-Parmer | UX-34541-07 | |
RH237 | AAT Bioquest Inc. | 21480 | |
Rhod2-AM | AAT Bioquest Inc. | 21062 | |
Stimulation electrode (ventricle) | Harvard Apparatus | 73-0160 | |
Surgical Suture | McKesson Medical-Surgical | 890186 | |
Transducer amplifier | World Precision Instruments | TBM4M | |
Tubing flow console | Transonic | TS410 | |
Umbilical tape | Jorvet | J0025UA | |
Water bath/circulator | VWR | 89400-970 | |
Surgical Tools | |||
Bandage shears | Harvard Apparatus | 72-8448 | Lister Bandage Scissors, Angled, Blunt/Blunt, 42.0mm blade length, 17.0 cm |
Electrocautery | Dalwha Corp. Ltd. | BA2ALD001 | Model: 200 Basic |
Hemostat | Roboz | RS-7476 | St Vincent Tube Occluding Forceps |
Hemostatic forceps | Harvard Apparatus | 72-8960 | Hartmann Hemostatic Forceps, Curved, Serrated 2.2 mm tip width, 9.5 cm |
Hemostats | Harvard Apparatus | 72-8985 | Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Curved, Serrated, 2mm tip 14cm |
Mayo scissors | WPI | 501749 | 14.5 cm, Straight |
Metzenbaum scissors | WPI | 501747 | 11.5 cm, Straight |
Mosquito forceps | Harvard Apparatus | 72-8980 | Halstead-Mosquito Hemostatic Forceps Straight, Smooth, 2mm tip width 12cm |
Needle holder | Harvard Apparatus | 72-8828 | Webster Needle Holders, Straight, Smooth,13.0 cm overall length |
Pediatric cross clamp | Roboz | RS-7660 | Cooley-Derra Clamp 6.25" 5mm Calibrations |
Right angle forceps | WPI | 501240 | Baby Mixter Hemostatic Forceps, 14cm, Right Angle |
Scalpel | Ted Pella | 549-4 | Scalpel Handle No. 4, 13.7cm Stainless Steel and 10 No. 22 Blades |
scissors | Harvard Apparatus | 72-8380 | Operating Scissors, Straight, Blunt/Blunt, 42mm blade,12cm |
Straight Serrated forceps | WPI | 500363 | Dressing Forceps 15.5cm |
Towel clamp | WPI | 501700 | Backhaus Towel Clamp, 13cm, Curved, Locking handle, SS |
Weitlaner retractor | WPI | 501314 | Weitlaner Retractor, Self-Retaining, 10.2cm, 2×3 Sharp Prongs |
Disposables | |||
3-0 prolene suture | Various vendors | Various vendors | |
Vessel loop | Aspen surgical | 011001PBX | Sterion® Vessel Loop, 0.8 x 406mm |
Cardioplegia (Plegisol) | Pfizer | 00409-7969-05 | Plegisol; St Thomas crystalloid cardioplegia solution 20ml/kg |
Heparin | Various vendors | Various vendors | 300 U/kg |
Syringe and Needle | Various vendors | Various vendors | 60mL & 18G respectively |
Umbilical tape | Ethicon | U12T |