Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Analyse af komplekse molekyler og deres reaktioner på overflader ved hjælp af cluster-induceret desorption/ionisering massespektrometri

Published: March 1, 2020 doi: 10.3791/60487
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Institute of Applied Physics and Center for Materials Research (LaMa), Justus Liebig University Giessen, 2Bruker Daltonik GmbH
* These authors contributed equally

Summary

Neutrale SO2 klynger af lav kinetisk energi (< 0,8 eV/constituent) bruges til desorb komplekse overflademolekyler som peptider eller lipider til yderligere analyse ved hjælp af massespektrometri ved hjælp af et ionfældemassespektrometer. Der kræves ingen særlig prøveforberedelse, og det er muligt at observere reaktioner i realtid.

Abstract

Desorption/ionisering Induceret af neutrale SO2 Klynger (DINeC) anvendes som en meget blød og effektiv desorption/ioniseringsteknik til massespektrometri (MS) af komplekse molekyler og deres reaktioner på overflader. DINeC er baseret på en stråle af SO2 klynger, der påvirker prøveoverfladen ved lav klyngeenergi. Under klynge-overflade påvirkning, nogle af overfladen molekyler er desorberet og ioniseret via dissolvation i den påvirkende klynge; Som følge af denne dissol-medieret desorption mekanisme, lav klynge energi er tilstrækkelig, og desorption processen er meget blød. Både overflade adsorbater og molekyler, som overfladen er sammensat af kan analyseres. Der opnås klare og fragmenterede spektre fra komplekse molekyler som peptider og proteiner. DINeC kræver ingen særlige prøvepræparater, navnlig ingen matrix skal anvendes. Metoden giver kvantitative oplysninger om prøvernes sammensætning. molekyler ved en overfladedækning så lavt som 0,1 % af et monolag kan påvises. Overfladereaktioner såsom H/D-udveksling eller termisk nedbrydning kan observeres i realtid, og reaktionernes kinetik kan udledes. Ved hjælp af en pulserende dyse til klyngestrålegenerering kan DINeC effektivt kombineres med ionfældemassespektrometri. DINeC-processens matrixfrie og bløde karakter i kombination med ionfældens MSn-funktioner giver mulighed for meget detaljeret og utvetydig analyse af den kemiske sammensætning af komplekse økologiske prøver og organiske adsorbater på overflader.

Introduction

Overfladefølsomme analyseteknikker er ofte baseret på partikelsonder som lavenergielektroner, atomer eller ioner, der i høj grad interagerer med faste prøver. Som følge heraf udviser de høj overfladefølsomhed, og detaljerede oplysninger om overfladekonstruktion kan fås1. Kemiske oplysninger er imidlertid ofte begrænsede. Som et eksempel kan røntgenfotoelektronspektroskopi give kvantitative oplysninger om den atomare sammensætning og om det gennemsnitlige kemiske miljø for en given art (f.eks. kulstofatomerne i et organisk molekyle, der adsorberedepå en overflade2). Det er dog vanskeligt at få mere detaljerede oplysninger om komplekse, overfladeadsorberede molekyler, såsom deres detaljerede struktur eller bindingssteder, med standardoverfladeanalyseteknikker. På den anden side vokser behovet for sådanne oplysninger med den stigende interesse for overfladefunktionalisering ved hjælp af organiske molekyler. De ekspanderende felter af on-overflade syntese3 eller overflade funktionalisering ved fastgørelse af biomolekyler4,5 er to fremtrædende eksempler. På alle disse områder undersøges grundlæggende spørgsmål om substrat-adsorbat- og adsorbat-adsorbatinteraktioner for bedre at forstå systemerne. I forbindelse med disse undersøgelser er det ønskeligt med højst oplysninger om adsorberede molekyler.

Til dels kan sekundær ion masse spektrometri (SIMS) give sådanne oplysninger. For det første er SIMS meget overfladefølsomme. For det andet, som sputtered adsorbater og deres fragmenter er opdaget ved hjælp af MS, oplysninger langt ud over atomare sammensætning er opnået. Afhængigt af arten af de kemiske arter adsorberet på overfladen, kan det identificeres ved sin molekylære masse og fragment mønster observeret i massespektret6. Fragmenterne induceret af de primære ioner faktisk kan hjælpe til identifikation af det analyserede materiale. Hvis den primære ion fremkaldte ændring (fragmentering, ioninducerede reaktioner, blanding) af prøven derimod er for stærk, går de fleste oplysninger om prøvens oprindelige tilstand tabt. Der er således gjort en stor indsats for at mindske fragmenteringen i SIMS (f.eks. ved hjælp af ladede molekylære klynger som primære ioner7,8,9). Men fragmentering stadig dominerer SIMS spektre af store makromolekyler og biologiske prøver10,begrænse anvendelsen af SIMS på forskellige områder.

Alternativt har vi vist desorption/ionisering forårsaget af neutrale klynger (DINeC) som en blød og matrixfri ioniseringsmetode, som med succes er blevet anvendt til massespektrometrisk analyse af komplekse molekyler11,12,13,14,15,16,17. DINeC er baseret på en stråle af molekylære klynger, som består af 103 til 104 SO2 molekyler (figur 1). Når klyngerne påvirker prøven, interagerer de på forskellige måder med molekylerne på og i overfladen: For det første omfordeles en del af klyngens kinetiske energi og aktiverer desorption. Tilsvarende vigtigt opløses desorbingmolekylet i klyngen under klyngeoverfladepåvirkning11,18,19 ( figur1 og figur 2). Med andre ord, baseret på den høje dipole øjeblik SO2, klyngerne meget effektivt tjene som en forbigående matrix for polære analysander. Som et resultat, desorption af analysand molekyler finder sted på klynge energier så lavt som 1 eV / molekyle og nedenfor. Den bløde karakter af desorptionsprocessen understøttes yderligere af hurtig afkøling af systemet , når SO2-klyngen splintres under og efter overfladepåkørsel11,19. Som en konsekvens af disse forskellige aspekter, klynge-induceret desorption af komplekse molekyler såsom peptider, proteiner, lipider, og farvestoffer provenuet uden nogen fragmentering af desorbing molekyler11,15; typiske massespektre viser den dominerende top ved m/z-værdien af det intakte molekyle ([M+H]+ eller [M-H]-figur 3). Afhængigt af antallet og arten af funktionelle grupper i molekylet, flere ladede kationer af formen [M + n· H]n+ er observeret11,15,18. For biomolekyler finder ionisering typisk sted via optagelse eller indvinding af en proton i en basis- eller sur funktionsgruppe, henholdsvis11. Hvis vandmolekyler er til stede i prøven, kan SO2 molekyler fra klyngen reagere med disse vandmolekyler, der danner svovlsyre18. Sidstnævnte kan fungere som en effektiv proton kilde, som yderligere fremmer ioniseringsprocessen i tilfælde af ionisering via proton optagelse (positiv ion mode)13,18.

Figure 1
Figur 1: Skematisk illustration af klynge-induceret desorption / ionisering og eksperimentel opsætning. Klynge-induceret desorption/ionisering udføres i en højvakuumbeholder. En stråle af SO2 klynger (gule prikker) er produceret via supersoniske udvidelse af en SO2/ Han gas blanding fra en pulserende dyse. Under klynge-overflade påvirkning, overflade molekyler er desorberet og ioniseret. Molekylære ioner (røde/orange prikker) overføres via et partisk gitter, et dobbelt iontragtindløb og octopolære ionguider i ionfælden for massespektrometri. Typiske massespektre viser dominerende toppe ved m/z-værdier af de intakte molekyler, her: M1 (orange) og M2 (rød) i positiv iontilstand. Spræng op: Under klyngeoverfladepåvirkningen opløses de besmittede molekyler i den nedslagsnde klynge eller et af dens fragmenter. Yderligere brud og fordampning af SO2 molekyler derefter føre til den nøgne, intakt molekylære ion som detekteret i massespektrometeret. Se også figur 2. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Øjebliksbilleder af molekylære dynamiksimuleringer, der illustrerer klynge-induceret desorption via dissolvation. (A) En SO2 klynge (300 molekyler) nærmer overfladen med 1250 m/s vinkelret på den overflade, hvor et dipeptid (aspartisyre-arginin, ASP-ARG) adsorbes. (B) Under påvirkning af klyngeoverfladen splintres klyngen. Adsorberet dipeptid interagerer med de omkringliggende SO2 molekyler, der fører til dens dissolvation i en af klyngefragmenterne. (C) Klyngefragmenterne frastødes fra overfladen. Det mærkede fragment (blå cirkel) bærer det dipeptid, der er desorberet i dette fragment. Dette tal er blevet ændret fra reference 19. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Repræsentativmassespektrum og molekylær model af angiotensin II. (A) Massespektre (toppanel: positiv iontilstand, bundpanel: negativ iontilstand) som opnået efter klyngeinduceret desorption/ionisering fra en angiotensin II-prøve. Prøven blev fremstillet ved drop-casting den respektive opløsning på en Si wafer (dækket af sin naturlige oxid). De vigtigste toppe er tildelt intakt biomolekyle, [M + H]+ og [M-H]-; der ikke observeres fragmenteringsmønstre. Dimers ([2M+H]+pil) angiver yderligere den bløde karakter af desorptionsprocessen. Det positive ionsignal er mere intenst på grund af indflydelsen fra SO 2-klyngerne18. (B) Rumfyldningsmodel og aminosyresekvens af angiotensin II. Hvide kugler indikerer brintatomer; sort: kulstof; blå: kvælstof; rød: ilt. Klik her for at se en større version af denne figur.

DINeC kan påføres enhver form for fast prøve, som er kompatibel med højvakuumforhold. Der kræves ingen særlig prøveforberedelse, navnlig ingen matrix, der skal anvendes før DINeC-MS-målinger, i modsætning til matrixassisteret laserdesorption/ionisering (MALDI) massespektrometri og beslægtede teknikker20,21. Dette muliggør realtidsmålinger af kemiske ændringer af prøven med varierende eksperimentelle forhold såsom baggrundstryk af reaktive arter i vakuumkammeret22 eller prøvetemperaturen. Detektionsgrænsen for DINeC-MS har vist sig at være i femtomoleområdet11. Når den anvendes på analyse af biomolekyler adsorberet på faste overflader i submonolayer regime, en overfladedækning så lavt som 0,1% af et monolag blev opdaget23. I denne dækningsordning afhænger signalintensiteten lineært af overfladedækningen, og DINeC-MS kan anvendes til kvantitativ analyse af overfladesammensætningen23. For blandede prøver er det muligt at foretage en kvantitativ vurdering af stikprøvesammensætningen17,24, da der ikke observeres nogen væsentlig indvirkning af det kemiske miljø på ioniseringssandsynligheden (f.eks. for blandede lipid-/peptidprøver17). Dette står i klar kontrast til SIMS, for hvilke ioniseringssandsynligheden for en given art typisk er stærkt påvirket af tilstedeværelsen af forskellige kemiske komponenter (den såkaldte "matrixeffekt"25,26).

Ud over overfladeanalyse kan kemisk sammensætning i undergrunden afundersøgtes ved hjælp af dybdeprofilering17. Med den nuværende opsætning, typiske desorption satser for klynge-induceret desorption af biomolekyler er af den rækkefølge 10-3 nm / s. En høj dybde opløsning i intervallet 1 til 2 nm er blevet observeret for blandet lipid / peptid prøver17.

Et andet anvendelsesområde er kombinationen af DINeC-MS med tyndt lagkromatografi (TLC). Konventionelle TLC-plader kan analyseres direkte ved hjælp af DINeC-MS. Positionsafhængige massespektre kan erhverves fra TLC-pladerne, og dermed massespecifikke kromatogrammer kan fås ved Hjælp af TLC-pladerne27. Det er ikke nødvendigt at reeluere de separerede analysatter , som er forskellig fra TLC i kombination med ENS28,29. Der kræves heller ingen matrix for DINeC-MS + TLC-kombinationen i modsætning til koblingen af TLC med MALDI28,29.

Desorption elektrospray ionisering (DESI) er også en blød desorption / ionisering metode til MS-applikationer30,31. De mest slående forskelle mellem DINeC og DESI er: DINeC23'skvantitative karakter , foreneligheden med ultrahøjvakuumforhold (UHV), navnlig muligheden for at undersøge prøver, der er tilberedt og overført under UHV-forhold, uden at bryde vakuum23,samt muligheden for effektivt at desorbuerikkepolære molekyler19.

I princippet kan DINeC som desorption/ioniseringskilde kobles til enhver form for massespektrometer. Kombinationen med ionfældemassespektrometri har imidlertid to hovedfordele: for det første pulsbredden og gentagelseshastigheden for en typisk pulserende klyngestråle svarer meget godt til den diskontinuerlige akkumuleringstid samt iontrapfældens spektralhastighed15,32. For det andet fører den bløde karakter af DINeC-processen til desorption af intakte molekyler. I kombination med msn kapaciteter ion fælde masse spektrometri, dette giver mulighed for en mest omfattende analyse af de undersøgte prøver15.

Protocol

BEMÆRK: Protokollen kan til enhver tid sættes på pause.

1. Udarbejdelse af substrater

  1. For standardprøver skæres underlagene fra siliciumvafler (tykkelse på ca. 0,5 til 1 mm) i stykker på 1 x 1 cm2.
  2. Rengør Si substrater i et ultralydsbad af ethanol og acetone i 15 minutter hver.
  3. Tør underlagene i en strøm af tør nitrogengas.

2. Fremstilling af prøver

  1. Standardprøveforberedelse
    1. Ved standardprøver fremstilles opløsningen, der indeholder analysandenmolekyler, i henhold til det videnskabelige spørgsmål, der skal behandles. Koncentrationen af analysanden skal være mindst 1 x 10-10 mol/L.
    2. Dråbestøbt 5 til 30 μL af prøveopløsningen på underlaget. Afhængigt af opløsningsmidlets damptryk skal prøven tørre under omgivende forhold eller i en ekssikkator, indtil alt opløsningsmiddel er fordampet, og der er dannet en tør film. Afhængigt af den anvendte mængde stof kan filmens tykkelse være mellem flere ti μm (visuel inspektion muligt) og monolaget til undermonolagsregime (som således ikke kan påvises med øjnene).
    3. Prøverne monteres på prøveholderen (f.eks. ved hjælp af tape eller klemmer, der er strammet med skruer, afhængigt af prøverne og vakuumforholdene).
    4. Om muligt monteres der desuden en referenceprøve, såsom en mikrometertyk film af angiotensin II, på prøveholderen.
  2. Alternativt prøveforberedelse
    1. Brug alternative prøveforberedelsesordninger såsom aflejring af elektrosprayion-beam (ES-IBD) i vakuum- eller dipbelægning i en hvilken som angivet løsning.
    2. Monter prøver, der skal fremstilles og overføres i vakuum på DINeC-prøveholderen forud for tilberedningstrinnene.
    3. Sørg for, at dipbelagte prøver er tørre efter det afsluttende forberedelsestrin.
    4. Overvej den enkleste forberedelsesordning. For eksempel, for undersøgelse af highlighter blæk, bare tegne en prik på substratoverfladen.

3. Overførsel af prøver til DINeC massespektrometer

  1. Overførsel af prøver fra omgivende forhold til det evakuerede DINeC-kammer
    1. Udluft belastningslåsesystemet.
    2. Åbn belastningslåsen, og monter prøveholderen.
    3. Luk belastningslåsen, og pump læsslåskammeret ned til et tryk under 2 x 10-5 mbar.
    4. Åbn ventilen til DINeC-kammeret, og overfør prøveholderen med overførselsstangen til hovedmanipulatoren. Fastgør prøveholderen til manipulatoren.
    5. Træk overførselsstangen tilbage, og luk ventilen mellem lastlås og DINeC-kammer.
       
  2. Overførsel af prøver fra vakuum til det evakuerede DINeC kammer
    1. Brug en transportabel vakuumbeholder, som kan fastgøres til CF40 flange i DINeC-kammeret. Prøverne, som er fremstillet i vakuum, overføres med denne beholder uden at bryde vakuum. Sørg for, at prøverne monteres på en prøveholder, der er kompatibel med den manipulator, der anvendes i DINeC-systemet.
    2. Fastgør den transportable vakuumbeholder til CF40 flange og pumpe ned volumen mellem beholder og DINeC kammer.
    3. Når trykket er faldet til under 2 x 10-5 mbar, skal du åbne portventilerne til DINeC-kammeret og den transportable vakuumbeholder og overføre prøven til DINeC-kammeret på manipulatoren ved hjælp af en wobblestick eller et andet overførselssystem med mere end 50 cm lineær bevægelse.
    4. Træk overførselssystemet tilbage, og luk de to portventiler.

4. Fremstilling af gasblanding

  1. Forbered en blanding på ca. 3% SO2 i helium ved først at evakuere gasflaskerne i gasblandingssystemet i 10 min.
  2. Fyld cylindrene med SO2, indtil et tryk på 1 bar er nået.
  3. Yderligere fylde cylindre med helium, indtil et samlet tryk på 30 bar er nået.
    FORSIGTIG: Når du bruger SO2,skal de respektive sikkerhedsforanstaltninger såsom opbevaring af SO2 cylindre i udpegede gasskabe altid være opfyldt.

5. Forberedelse af DINeC massespektrometer

  1. Åbn ventilen mellem gasflasken og dysen. Juster trykket af SO2/He gasblandingen ved omridset af gasblandingssystemet til 15 bar.
  2. Indstil manipulatorens position til referenceprøvens position.
  3. Til måling af kationiske massespektre skal prøven og gitterbiasen indstilles til henholdsvis +40 og +7 V.
  4. Hvis du vil køre den pulserende dyse og ionfældemassespektrometeret, skal du indstille generatoren til den eksterne funktion til 2 Hz. Med forsinkelsesgeneratoren skal du indstille tidsforsinkelsen Δtn mellem signalet Klar fælde fra ionfælden og udløsersignalet for den pulserende dyse til 5 ms.
  5. I kontrolsoftwaren skal du justere følgende parametre ved at trykke på de respektive knapper eller skrive de respektive værdier i tilstandssiden i hoveddialogvinduet: Scanningstilstand:Forbedret opløsning, Område: m/z 50 – 3000, Accu-tid: 0,1 ms, Gennemsnit: 10 cyklusser, Polaritet: positiv for måling af kationiske massespektre
    BEMÆRK: Til måling af anioniske spektre skal prøve- og gitterbias være negative med hensyn til jord, polaritetskal skiftes til Negativ i kontrolsoftwaren.

6. Måling af massespektre

  1. Når et tryk under 3 x 10-6 mbar er nået i DINeC-kammeret, kan målingen startes. Start målingen ved først at trykke på Stand by og derefter trykke på Benyt i kontrolsoftwaren. Begynd at registrere målingerne, der trykker på knappen Afspil.
  2. Mål et testspektrum fra en referenceprøve, såsom angiotensin II for ca. 300 s. Følg signalets tidsafhængighed ved hjælp af kromatogrammet indstillet til den respektive m/z-værdi. Optimer signalintensiteten ved justering af tidsforsinkelsen Δtn mellem signalet klar fælde og det signal, der udløser den pulserende dyse.
  3. Flyt manipulatoren til placeringen af den prøve, der skal måles. Optimer signalintensiteten ved justering af prøvepositionen i prøveholderplanet.
  4. Erhverve masse spektre over det tidsrum af interesse. Ændre forsøgsparametrene såsom prøvetemperatur eller baggrundstryk i kammeret i henhold til detaljerne i forsøget. Fortsæt med at tage massespektre, når de varierer de eksperimentelle parametre.

7. Dataevaluering

  1. Når målingen er afsluttet, skal du indlæse det respektive datasæt i dataanalyseprogrammet. Vælg tidsrummet for interesse for kromatogrammet med højre knap på musen. Det gennemsnitlige spektrum vises i et separat vindue.
  2. Eksporter spektret som en datafil til videre behandling i et foretrukne program.

   

Representative Results

I det følgende præsenteres to eksempler for realtidsanvendelsen af DINeC-MS. Figur 4 viser ændringen af massespektret fra angiotensin II, når prøven opvarmes til ca. 140 °C. Når den endelige temperatur er nået(figur 4B, figur 4E), er spektret karakteriseret ved en ekstra top, der angiver tabet af en H2O-enhed (m/z = 1029). Ved opbevaring af prøven ved denne temperatur observeres yderligere nedbrydning af angiotensin II-molekylerne (figur 4C), herunder tab af en af terminalens aminosyreenheder, aspartsyre (top ved m/z = 932, figur 4D). Kvantitativ analyse af dataene gør det muligt at vurdere de underliggende reaktionskinetik (figur 4E). Figur 4E viser navnlig, at enheden med m/z = 1029 er et mellemprodukt, der nedbrydes yderligere til mindre fragmenter, efterhånden som intensiteten først øges og derefter falder. De samtidige hastighedskonstanter er således i samme størrelsesorden.

Som et andet eksempel er undersøgelsen af brint/deuteriumudveksling i angiotensin II22 illustreret i figur 5. Ved eksponering af angiotensinprøven for D2O i DINeC-kammeret (pD2O = 10-4 mbar) udvides isotopmønstret for angiotensin II og flyttes til højere m/z-værdier, der angiver udveksling af H med D-atomer. Processen er hurtig i løbet af de første 60 s, men væsentligt bremser i forsøgets videre løb: isotopmønsteret i figur 5B dækker et bredt m/z-område (ca. 15 m/z enheder). Når vi definerer graden af deuteration d som antallet af udvekslede H atomer i et molekyle, værdier d mellem d = 0 til d = 13 kan udvindes fra spektret. I figur 5Creduceres isotopmønsteret igen i bredden. Denne observation kan tilskrives den stærkt reducerede intensitet af de toppe, der er forbundet med de laveste grader af deuteration. I figur 5Dvises spektret i endnu længere reaktionstider. Den overdækkede m / z rækkevidde forbliver næsten den samme, men centrum af massen af spektret stadig skifter langsomt i retning af at øge m / z værdier. For lange eksponeringstider når en del af molekylerne den højeste grad af deuteration, dmax = 17. Den svarer til det maksimale antal omtoner, der kan udskiftes, og som angives af antallet af H-atomer, der er bundet til funktionelle grupper såsom carboxylsyrer eller amingrupper.

Allerede fra den tidsmæssige udvikling af spektre, kan det udledes, at H / D udveksling finder sted med forskellige sats konstanter. For at få en kvantitativ beskrivelse af denne observation afbildes den gennemsnitlige grad af deuteration dי i figur 5E som funktion af tiden. Inspektion af forsøgsresultaterne (symboler) afslører tre forskellige regimer: en hurtig stigning i dי operative for t < 50 s, en mellemliggende ordning for 50 s < t < 200 s, og en langsom, men næsten kontinuerlig stigning for t > 200 s. De eksperimentelle resultater blev simuleret ved hjælp af Monte Carlo simuleringer; pseudo-første-ordens reaktion kinetik med reaktionskonstanter ki blev antaget for H / D udveksling på de funktionelle grupper af molekyler undersøgt22. Der blev kun opnået en god aftale mellem simuleringer og eksperimentelle resultater i alle tre regimer, når der blev anvendt mindst tre forskellige satskonstanter ki for H/D-udvekslingen i angiotensin II-molekyler. I figur 5F,Gvises de kinetik, der udledes af montering af de eksperimentelle isotopmønstre ved summen af isotopmønstre for forskellige grader af deuteration ( figur5A til figur 5D). Den gode aftale mellem eksperimentelle data og simuleringer samt de meget forskellige valutakurser for lave og høje grader af deuterations er klart observeret. Sammenlignet med forskellige oligopeptider såsom hexaglycin, blev de hurtige valutakurser tilskrevet de eksplicitte funktionelle grupper, mens de langsomme valutakurser var forbundet med amidgrupperne af peptidets rygrad22.

Mens disse to første eksempler blev målt med mikrometertykke angiotensin II-prøver, viser figur 6 resultaterne af submonolagsdækningen af angiotensin II på guldprøver som fremstillet ved hjælp af elektrosprayionstråledeposition (ES-IBD)23. En lineær afhængighed af signalintensiteten på mængden af stof observeres over 3 størrelsesordener, den laveste mængde stof opdaget svarer til 0,1% af et monolag af angiotensin II molekyler på guldoverfladen. H/D-udvekslingsforsøg som vist i figur 5 blev også udført med angiotensin II på guld i undermonolagetsregime23.

Figure 4
Figur 4: Realtidsobservation af termisk nedbrydning af angiotensin II. (A-C) Massespektre som opnået efter klynge-induceret desorption / ionisering fra en angiotensin II prøve. A) Frisk prøve ved RT. (B) Prøve opvarmet til ca. 140 °C. Ud over toppen ved m/z = 1047, som er forbundet med det intakte molekyle [M+H]+, toppe ved m/z = 932, 1012 og 1029 vises (angivet med pile). (C) Sidstnævnte toppe stiger, og hovedtoppen falder med tiden, når prøven holdes ved forhøjet temperatur. D) Strukturel formel af angiotensin II med angivelse af det fragment (brune parenteser), der fører til toppens udseende ved m/z = 932 ved tab af en aminosyreenhed (aspartisyre). E) Tidsafhængighed af prøvetemperatur og intensiteten af de vigtigste toppe, der er angivet i parcellerne (A) til C). Solide linjer er guider til øjet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Realtidsobservation af H/D-udveksling i angiotensin II. (A-D) Kationiske massespektre af angiotensin II som opnået ved hjælp af DINeC-MS. På grund af H/D-udveksling udvider isotopmønsteret og skifter til højere m/z-værdier i (B) til D) sammenlignet med isotopmønsteret for de ikke-deuterede arter, der er vist i (A). Røde linjer er data, stiplede cyan linjer er passer til de data, der tager hensyn til forskellige grader af deuteration. E) Gennemsnitlig grad af deuteration dי som en funktion af tid som udledes af forsøgene (åbne prikker). Desuden vises dי som en funktion af tiden udledes ved hjælp af Monte Carlo simuleringer. Sort stiplet kurve: simuleringer under hensyntagen til en hastighedskonstant (k1); rød kurve: under hensyntagen til tre hastighedskonstanter (k1, k2, k3). (F,G) Relative signalintensiteter af udvalgte grader af deuteration af angiotensin II (symboler + faste linjer) som en funktion af tid sammen med de tilsvarende resultater af Monte Carlo simuleringer (stiplede linjer). Dette tal er blevet ændret fra reference 22. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Anvendelse af DINeC-MS på angiotensin II på guld i submonolagregimet. (A) Skematisk repræsentation af kombinationen af ES-IBD til aflejring og DINeC-MS for massespektrometri af isolerede angiotensin II-molekyler i submonolagsregimet. b) Afhængighed af signalintensitet for mængden af stof, der deponeres på prøven, som er fremstillet af to uafhængige datasæt (udfyldte og åbne symboler). Indsæt: DINeC massespektre som fremstillet af prøver, hvor en mængde stof blev deponeret som angivet. Dette tal er blevet ændret fra reference 23. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

I mange undersøgelser, der hidtil er udført, er det påvist, at DINeC-MS er stor følsomhed over for forskellige stoffer. Faktisk giver dette mulighed for målinger af analysander ned til en mængde stof i femtomol regime11. På grund af denne høje følsomhed skal prøveforberedelse, navnlig substratrensning, udføres med meget rene kemikalier for at undgå kontaminering i DINeC-massespektre. Som det er tilfældet for mange analyseteknikker, hjælper en korrekt baggrundsmåling fra et tomt substrat med at adskille toppe fra analysanden og toppe, der har deres oprindelse i substrat-/prøveforberedelse.

Selv om vi har vist , at ioniseringssandsynligheden for et givet analysandmolekyle ikke er stærkt påvirket af tilstedeværelsen af coadsorbates eller medbestanddele i blandede prøver17,24, kan ioniseringssandsynligheden variere fra stof til stof13. Således er det endnu vigtigere at arbejde under rene forhold som forurenende stoffer, afhængigt af deres ionisering sandsynlighed, kan bidrage til signalet meget stærkere end analysanden. Prædannede ioner (f.eks. som findes i tilfælde af mange farvestofmolekyler) eller molekyler med funktionelle grupper, der viser en klar tendens til protonoptagelse eller deprotonation (dvs. baser eller syrer), viser typisk høj ioniseringssandsynlighed i DINeC-MS. Hvis en sådan funktionel gruppe ikke findes i analysanden, kan ioniseringssandsynligheden være lav. Prøverne kan derefter behandles ved ioniserende stoffer såsom trifluorsyre (f.eks. ved at eksponere prøven for ioniserende agensens damptryk).

De repræsentative resultater, der er beskrevet i figur 4 og figur 5, viser, at DINeC-MS finder anvendelse i realtid med henblik på realtidsundersøgelser af kemiske reaktioner ved hjælp af massespektrometri. Figur 6 illustrerer metodens submonolagsfølsomhed. Hvis de to egenskaber kombineres, kan kemiske reaktioner på overflader og deres produkter følges i realtid23. Dette kan især være af interesse for den såkaldte "on-surface syntese", som fører til samling af makromolekylære strukturer på overflader3,33,34,35,36. I den nuværende opsætning er observation af sådanne overfladereaktioner mulig på overflader med lavere reaktivitet såsom guld23 og andre ædle metaller; forsøgene er vanskeligere at udføre på meget reaktive overflader såsom siliciumoverflader37,da grundtrykket i desorptionskammeret er i 10 -7-mbar-området. De nuværende aktiviteter tager højde for denne begrænsning, og der opbygges et UHV-kompatibelt DINeC-apparat. I tilfælde af reaktive overflader skal samspillet mellem SO2 og substratoverfladen testes forud for målinger af overfladeadsorbater og overfladereaktioner.

Da klyngestrålen er neutral, kan den ikke fokuseres. Strålestørrelsen på prøven angives således ved, at den i brug af udsnedsemaskinens opsætning og åbning er geometrisk. typiske værdier for strålediameteren på prøven er en til flere millimeter. Som et resultat, billeddannelse ved at scanne prøven er kun muligt med meget lav opløsning. På den anden side, givet af den høje ionisering sandsynlighed13, DINeC effektivt gør brug af de desorbede molekyler. Således synes en kombination af DINeC-MS og en ion-imaging detektor38 at være meget attraktiv.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har noget at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender økonomisk støtte fra Helmholtz International Center for FAIR (HICforFAIR) og Helmholtz Graduate School for Hadron og Ion Research (PS). Forfatterne takker prof. Rauschenbach (University of Oxford) og hans team for frugtbart samarbejde om kombinerede ES-IBD/DINeC eksperimenter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone rotisolv HPLC Roth 7328.2 HPLC Gradient Grade
Copper tape
Ethanol rotisolv HPLC Roth p076.1 HPLC Gradient Grade
Helium Praxair 4800086706 Purity 99.9999%
Nitrogen Praxair 40728408 Purity 99.5 - 100%
Silicon Wafers Active Business Company GmbH G60007
Sulfur dioxide Air Liquide P1734S10R0A001 Purity 99.98%
Water rotisolv LC-MS Roth HN43.1 Ultra LC-MS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vickerman, J. C., Gilmore, I. Surface Analysis: The Principal Techniques. , 2nd ed, John Wiley & Sons. New York. (2009).
  2. Reutzel, M., Münster, N., Lipponer, M. A., Länger, C., Höfer, U., Koert, U., Dürr, M. Chemoselective Reactivity of Bifunctional Cyclooctynes on Si(001). Journal of Physical Chemistry C. 120, 26284-26289 (2016).
  3. Grill, L., Dyer, M., Lafferentz, L., Persson, M., Peters, M., Hecht, S. Nano-architectures by covalent assembly of molecular building blocks. Nature Nanotechnol. 2, 687-691 (2007).
  4. Stutzmann, M., Garrido, J. A., Eickhoff, M., Brandt, M. S. Direct biofunctionalization of semiconductors: A survey. Physica Status Solidi A. 203, 3424-3437 (2006).
  5. Adler-Abramovich, L., Gazit, E. The physical properties of supramolecular peptide assemblies: from building block association to technological applications. Chemical Society Reviews. 43, 6881-6893 (2014).
  6. Vickerman, J. C., Briggs, D. TOF-SIMS: Materials Analysis by Mass Spectrometry, 2nd ed. , IM Publications. Chichester, UK. (2013).
  7. Winograd, N. The magic of cluster SIMS. Analytical Chemistry. 77, 142-149 (2005).
  8. Ichiki, K., Ninomiya, S., Nakata, Y., Honda, Y., Seki, T., Aoki, T., Matsuo, J. High Sputtering Yields of Organic Compounds by Large Gas Cluster Ions. Applied Surface Science. 255, 1148-1150 (2008).
  9. Mochiji, K., Hashinokuchi, M., Moritani, K., Toyoda, N. Matrix-free Detection of Intact Ions from Proteins in Argon-Cluster Secondary Ion Mass Spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 23, 648-652 (2009).
  10. Yokoyama, Y., Aoyagi, S., Fujii, M., Matsuo, J., Fletcher, J. S., Lockyer, N. P., Vickerman, J. C., Passarelli, M. K., Havelund, R., Seah, M. P. Peptide Fragmentation and Surface Structural Analysis by Means of ToF-SIMS Using Large Cluster Ion Sources. Analytical Chemistry. 88, 3592-3597 (2016).
  11. Gebhardt, C. R., Tomsic, A., Schröder, H., Durr, M., Kompa, K. L. Matrix-Free Formation of Gas-Phase Biomolecular Ions by Soft Cluster-Induced Desorption. Angewandte Chemie, International Edition. 48, 4162-4165 (2009).
  12. Baur, M., Lee, B. J., Gebhardt, C. R., Durr, M. Soft Clusterinduced Desorption and Ionization of Biomolecules - Influence of Surface Load and Morphology on Desorption Efficiency. Applied Physics Letters. 99, 234103 (2011).
  13. Lee, B. J., Baur, M., Gebhardt, C. R., Durr, M. Quantification of the Ionization Probability During Desorption/Ionization of Oligopeptides Induced by Neutral Cluster Impact. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 27, 1090-1094 (2013).
  14. Lee, B. J., Gebhardt, C. R., Schroder, H., Kompa, K. L., Durr, M. Observation of Ionic Desorption Channels in Cluster-induced Desorption of Alkali Halides - Influence of Surface Electronic Properties and Surface Configuration. Chemical Physics Letters. 556, 77-81 (2013).
  15. Baur, M., Gebhardt, C. R., Durr, M. Desorption/Ionization Induced by Neutral Cluster Impact as a Soft and Efficient Ionization Source for Ion Trap Mass Spectrometry of Biomolecules. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 28, 290-296 (2014).
  16. Kley, C. S., Dette, C., Rinke, G., Patrick, C. E., Cechal, J., Jung, S. J., Baur, M., Durr, M., Rauschenbach, S., Giustino, F., Stepanow, S., Kern, K. Atomic-Scale Observation of Multiconformational Binding and Energy Level Alignment of Ruthenium-Based Photosensitizers on TiO2 Anatase. Nano Letters. 14, 563-569 (2014).
  17. Portz, A., Aoyagi, S., Durr, M. Soft depth-profiling of mixed peptide/lipid samples by means of cluster induced desorption/ionization mass spectrometry - high depth resolution and low matrix effect. Biointerphases. 13, 03B405 (2018).
  18. Portz, A., Baur, M., Gebhardt, C. R., Frank, A. J., Neuderth, P., Eickhoff, M., Durr, M. Influence of the Cluster Constituents' Reactivity on the Desorption/Ionization Process Induced by Neutral SO2 Clusters. Journal of Chemical Physics. 146, 134705 (2017).
  19. Schneider, P., Durr, M. Cluster-induced desorption investigated by means of molecular dynamics simulations - Microsolvation in clusters of polar and non-polar constituents. Journal of Chemical Physics. 150, 214301 (2019).
  20. Karas, M., Hillenkamp, F. Laser Desorption Ionization of Proteins with Molecular Masses Exceeding 10 000 Daltons. Analytical Chemistry. 60, 2299-2301 (1988).
  21. Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights. Analytical Chemistry. 90, 240-265 (2018).
  22. Portz, A., Gebhardt, C. R., Durr, M. Real-Time Investigation of the H/D Exchange Kinetics of Porphyrins and Oligopeptides by Means of Neutral Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Journal of Physical Chemistry B. 121, 11031-11036 (2017).
  23. Portz, A., Baur, M., Rinke, G., Abb, S., Rauschenbach, S., Kern, K., Dürr, M. Chemical Analysis of Complex Surface-Adsorbed Molecules and Their Reactions by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 90, 3328 (2018).
  24. Portz, A., Baur, M., Gebhardt, C. R., Durr, M. Mass Spectrometry of Oligopeptides in the Presence of Large Amounts of Alkali Halides Using Desorption/Ionization Induced by Neutral Cluster Impact. Biointerphases. 11, 02A316 (2016).
  25. Shard, A. G., Spencer, S. J., Smith, S. A., Havelund, R., Gilmore, I. S. International Journal of Mass Spectrometry. 377, 599-609 (2015).
  26. Nakano, S., Yamagishi, T., Aoyagi, S., Portz, A., Durr, M., Iwai, H., Kawashima, T. Evaluation of Matrix Effects on TOF-SIMS Data of Leu-enkephalin and DOPC Mixed Samples. Biointerphases. 13, 03B403 (2018).
  27. Heep, J., Tuchecker, P. H. K., Gebhardt, C. R., Dürr, M. Coupling of planar chromatography to mass spectrometry. ACS Omega. 4, 22426-22430 (2019).
  28. Morlock, G., Schwack, W. Coupling of planar chromatography to mass spectrometry. Trends in Analytical Chemistry. 29, 1157-1171 (2010).
  29. Cheng, S. C., Huang, M. Z., Shiea, J. Thin layer chromatography/mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1218, 2700-2711 (2011).
  30. Takats, Z., Wiseman, J. M., Gologan, B., Cooks, R. G. Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization. Science. 306, 471 (2004).
  31. Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. Ambient mass spectrometry. Science. 311, 1566 (2006).
  32. Dürr, M., Gebhardt, C. Ion generation in mass spectrometers by cluster bombardment. US Patent. , 926322 B2 (2019).
  33. Lindner, R., Kuhnle, A. Bottom-up Assembly of Molecular Wagons on a Surface. ChemPhysChem. 16, 1582-1592 (2015).
  34. Dong, L., Liu, P. N., Lin, N. Bottom-up Assembly of Molecular Wagons on a Surface. Accounts of Chemical Research. 48, 2765-2774 (2015).
  35. Björk, J. Reaction mechanisms for on-surface synthesis of covalent nanostructures. Journal of Physics: Condensed Matter. 28, 083002 (2016).
  36. Rauschenbach, S., Rinke, G., Gutzler, R., Abb, S., Albarghash, A., Le, D., Rahman, T. S., Durr, M., Harnau, L., Kern, K. Two-Dimensional Folding of Polypeptides into Molecular Nanostructures at Surfaces. ACS Nano. 11, 2420-2427 (2017).
  37. Dürr, M., Höfer, U. Dissociative adsorption of molecular hydrogen on silicon surfaces. Surface Science Reports. 61, 465-526 (2006).
  38. Zhang, J., Franzreb, K., Aksyonov, S. A., Williams, P. Mass Spectra and Yields of Intact Charged Biomolecules Ejected by Massive Cluster Impact for Bioimaging in a Time-of-Flight Secondary Ion Microscope. Analytical Chemistry. 87, 10779-10784 (2015).

Tags

Kemi massespektrometri klynge desorption matrixfri blød overfladeadsorbates reaktionskinetik H/D udveksling
Analyse af komplekse molekyler og deres reaktioner på overflader ved hjælp af cluster-induceret desorption/ionisering massespektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bomhardt, K., Schneider, P., Portz,… More

Bomhardt, K., Schneider, P., Portz, A., Gebhardt, C. R., Dürr, M. Analysis of Complex Molecules and Their Reactions on Surfaces by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (157), e60487, doi:10.3791/60487 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter